Mise en place de cultures microbiennes eucaryotes à partir d'un enrichissement chimique stratifié lac Antarctique et de l'évaluation du potentiel de fixation du carbone

1. L'acquisition des échantillons

1. Choisir et préparer le site d'échantillonnage un jour avant l'échantillonnage de la colonne d'eau. Cela permettra aux couches stratifiées de la colonne d'eau à la réforme après la perturbation due au forage et à la glace-trou de fusion. Identifier l'emplacement du site de forage par GPS.
2. Pour accéder à la colonne d'eau, commencez par percer un trou dans la glace avec une tarière à glace Jiffy attaché à une prolongation de 4 pouces Jiffy vol et peu de coupe. Pour prévenir le gel de la perceuse dans le trou, essayez d'éviter de forage dans l'eau liquide par l'arrêt de forage d'environ 4-6 cm au-dessus du haut de la colonne d'eau.
3. Le trou de forage devra être élargi à partir d'un diamètre de 15 à 60 cm avant l'échantillonnage. Ceci est réalisé par utilisation d'un générateur trou (Modèle Hotsy) qui circule polyéthylèneglycol chauffé à travers un tube de cuivre. Trou de fusion prend habituellement jusqu'à 18 heures.
4. Avant l'échantillonnage de la colonne d'eau, veiller à ce que tous les équipements requis et st l'échantillonOrage bateaux sont assemblés sur le site d'échantillonnage. Matériaux d'échantillonnage comprennent: bouteille Niskin (capacité L 5-10), avec la profondeur Winch-calibré par câble, Messenger, bouteilles d'échantillon suffisant pour chaque profondeur d'échantillonnage et de refroidisseurs pour le transport des échantillons.
5. Commencer l'échantillonnage tôt dans la journée (~ 5 heures), que le filtrage de l'eau des lacs devrait être achevée le jour de l'échantillonnage. Prélever des échantillons d'eau (1-5 L) à des profondeurs désirées (pour cette étude: 6-m, 15 m et des profondeurs d'échantillonnage de 18 m, mesurée à partir du niveau de l'eau piézométrique dans le trou dans la glace) à l'aide d'un échantillonneur Niskin attaché à un calibré treuil à main. Pour éviter une perturbation de la colonne d'eau de recueillir de faibles profondeurs avant plus profonds.
6. Magasin échantillons lacustres dans les refroidisseurs et de transport à partir du site échantillon au laboratoire champ à l'aide d'un traîneau attaché à un VTT (véhicule tout terrain). Les échantillons doivent être traités ou stabilisés (pour exemple: gel rapide dans l'azote liquide) au laboratoire échantillonnage sur le terrain immédiatement après.

2. Development des cultures d'enrichissement

1. Pour la culture de cultures d'enrichissement, de 0,5 à 1 L Concentré d'eau du lac sur 47 mm filtres 0,45 um pores de taille à l'aide de filtration polyéthersulfone douce (<0,3 atm). Si la diversité de la communauté naturelle est souhaitée, filtrer une deuxième échantillon sur 47 mm 0,45 um pores des filtres de polyéthersulfone taille et suivre les protocoles en fonction de Bielewicz et al. ⁴ pour eucaryote diversité phylogénétique.
2. Transfert filtre à Falcon de 50 ml tube stérile contenant ~ 20 ml d'eau du lac filtrée recueillies auprès de la profondeur d'échantillonnage que le filtre. Lavez délicatement les cellules du filtre à l'aide d'une pipette stérile.
3. Transfert suspension cellulaire à un ballon de 25 cm ² de culture cellulaire stérile. Ajouter l'eau du lac filtrée recueillies auprès de chaque profondeur de l'échantillon pour augmenter le volume de la culture à 45 ml. Mettre en place plusieurs répétitions pour chaque profondeur d'échantillonnage, si enrichissements sur différents milieux de culture sont souhaitées.
4. Supplément flacons de culture avec 50X ssolutions terile à une concentration finale de 1X des milieux de culture suivants: Moyen basale Bold, BG11 et F / 2. Si la culture d'organismes mixotrophes est nécessaire, le démarrage deux navires F/2-supplemented et ajouter 2-3 grains de riz stérile l'une quelconque des flacons.
5. Incuber flacons de culture à basse température (4 ° C) et sous faible éclairement (20 umol photons m ^-2 s ^-1) dans une croissance à température contrôlée incubateur pour au moins 4 semaines dans l'Antarctique avant l'expédition de votre laboratoire américain. Si des isolats sont souhaités, la plaque 250 uL de culture d'enrichissement sur gélose contenant un milieu de croissance approprié, après une incubation de 2 semaines.
6. Pour l'expédition aux États-Unis, les cultures d'enrichissement de transfert aux stériles de 50 mL tubes Falcon. Exigence d'expédition Demande de "ne pas congeler" et "Keep cool" sur le transport de la demande. Alors que le processus d'expédition de l'Antarctique est relativement rapide (2 semaines par voie aérienne commerciale) et très fiable, il ya une possibilité de perte de l'organe fastidieuxismes au cours du processus de transport. Ainsi, les enquêteurs peuvent vouloir préserver un sous-échantillon avant l'expédition de sorte que la perte de certaines espèces au cours du processus d'expédition peut être évaluée.
7. À l'arrivée aux États-Unis, le transfert de 5 ml de la culture d'enrichissement dans 45 ml de milieux de croissance appropriés dans une fiole Erlenmeyer de 125 ml stérile coiffé d'une éponge stérile. Cultures d'enrichissement devrait être maintenu comme debout cultures à une température contrôlée en chambre de croissance de l'environnement (Chambre de croissance diurne, VWR) à 4 ° C/20 photons umol m ^-2 s ^-1. Les cultures doivent être transférés sur des supports tous les 30 jours.

3. Extraction lysat cellulaire à partir enrichissements filtrées

1. Filtre 5 ml de la culture d'enrichissement sur un 25 mm Whatman GF / F filtre à l'aide léger vide (moins de 10 psi). Le filtre peut être stocké pendant plusieurs semaines à -80 ° C avant dosage de l'activité Rubisco.
2. Coupez le filtre en sections avec des ciseaux en acier 4-5 stériles ettransférer les pièces avec une pince stérile à un tube 2 ml bouchon à vis remplie d'un cinquième de la voie complète avec 0,1 mm de diamètre de zircone / silice billes.
3. Ajouter 1,25 ml de tampon d'extraction de filtre (50 bicine, 10 mM MgCl _2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, et 0,1% de triton X-100, ajouter frais: 10 mM NaHCO _3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocaproïque l'acide, 0,7 mM de benzamidine, pH 7,8) ¹³ et de perturber les cellules en utilisant un batteur Minibead trois fois pour 30 ans sur 48 réglage de la vitesse. Pour éviter un échauffement de l'échantillon, beadbeating alternent avec une incubation de glace min.
4. Centrifugeuse suspension filtre pendant 2 minutes à 3000 x g à 4 ° C pour former une boulette de lâche GF / F fibres filtrantes et les débris paroi cellulaire.
5. Suppression d'un aliquote de 200 ul et plongez dans 800 ul de acétone glacée 90%. Mesurer la chlorophylle extractible (chl) a dans un spectrophotomètre à des valeurs de longueur d'onde de 664 nm et 647 nm ^14. Transférer le surnageant dans un microtube de 1,5 mL.
6. Centrifuger remaining surnageant à 4 ° C pendant 2 min à 15.000 xg et de transférer le surnageant (éviter le culot de membranes cellulaires insolubles et autres GF / F fibres du filtre) à un propre de 1,5 ml microtube. Ce lysat cellulaire soluble peut maintenant être utilisé dans le dosage RubisCO activité carboxylase.
7. Lysat peut être conservé à -80 ° C après addition de glycérol de 12,5% et la congélation instantanée dans l'azote liquide. Une perte d'activité peut se produire après plusieurs cycles gel / dégel en fonction de la sensibilité des enzymes dans le lysat. Par conséquent, l'activité de lysat frais versus congelée doit être examinée avant à grande échelle des extractions lysat cellulaire.

4. RubisCO Assay carboxylase filtrer l'activité

1. Transfert 125 ul de lysat soluble à un tube de 15 ml vis microcentrifugeuse bouchon (bouchon n'est pas nécessaire) qui a été sur de la glace. Pour les échantillons de contrôle négatifs, ajouter 125 ul de lysat soluble à tube de 15 ml vis microcentrifugeuse bouchon, mais n'ajoutez pas de substrat (à l'étape 4.7). Courirreproduire les réactions de tous les échantillons et les contrôles négatifs.
2. Préparer 10 ml de tampon de dosage frais (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO _3, 25 mM MgCl ₂₎ et le froid sur la glace. Aliquoter assez de la mémoire tampon de dosage pour tous les échantillons et les contrôles négatifs (100 pi par échantillon / contrôle de plus 100 supplémentaires pi) à un tube de 5 ml. Effectuer toutes les étapes ultérieures sous une hotte.
3. Ajouter 40 ul NaH ¹⁴ CO ₃ (500 pCi / ml) par ml de tampon d'essai à la mémoire tampon poolées et de garder la mémoire tampon sur la glace.
4. Retirez 10 uL du tampon de dosage contenant ¹⁴ C et la diluer dans 1 ml de tampon de dosage. Après inversion de mélanger, ajouter 100 ul du mélange dilué 1:100 à 3 ml de Bio-sécurité à scintillation comptage II cocktail dans un flacon à scintillation. Mélanger par inversion. Compte de scintillation (Beckman LS6500) devrait être plus de 18.000 cpm avant de poursuivre avec le test.
5. Quand un nombre suffisant de NaH ¹⁴ CO ₃ a été ajouté à la mémoire tampon de dosage,déplacer les tubes de réaction à un bain sec préréglée à 25 ° C et incuber pendant 3-5 min.
6. Ajouter 100 ul du tampon d'essai à des lysats et incuber pendant 5 minutes à 25 ° C.
7. Ajouter 20 ul de 15 mM ribulose biphosphate, à des échantillons et permettre à la réaction se poursuivre pendant 5-10 minutes à 25 ° C.
8. Ajouter 100 ul d'acide propionique (100%) (Fisher) pour arrêter la réaction. Centrifuger pendant 1 heure à 2000 xg à épuiser non constituée en société ¹⁴ C.
9. Transférer le volume total des échantillons dans des flacons à scintillation contenant 3 ml de Bio-Safe II cocktail de scintillation comptage. Déterminer cpm de produits acides finaux stables par comptage à scintillation (B. de Witte, R. Tabita communication personnelle).
10. Calculer les taux d'activité Rubisco sur un chl une base ^14.

5. Les résultats représentatifs

Nous avons utilisé la culture d'enrichissement d'isoler phototrophes adapté au froid et protistes mixotrophes résidant dans le L 'AntarctiqueAke Bonney. Pour capturer une plus grande diversité d'organismes, nous avons testé trois types de milieux de culture: Moyen basale Bold (BBM) ^15, F/2-Si Marine Medium ^{16, 17} et BG11 moyen ^{de 18 ans.} L'inspection visuelle des cultures d'enrichissement par microscopie optique a révélé que les cultures ont été dominées par les protistes phototrophes (indiqué par la présence de pigments chlorophylliens dans la plupart des cellules) et nourrissait une grande variété de morphologies cellulaires en fonction de la profondeur d'échantillonnage à partir de laquelle l'inoculum a été prise et le type de support utilisé dans la culture (fig. 1).

Nous avons mesuré les taux maximaux d'activité carboxylase catalysées par l'enzyme rubisco comme un proxy pour le potentiel de fixation du carbone. Chl une abondance a également été suivie que d'une estimation de la biomasse des protistes phototrophes (Fig. 2). Malgré la culture de toutes les cultures dans le cadre du même température / lumière régime (c.-à-4 ° C/20 mol m ^-2 s ^-1), le potentiel de fixation du carboneet la biomasse phototrophes variait considérablement entre les cultures d'enrichissement. Maximum RubisCO activité a été observée dans des cultures d'enrichissement de croissance dans les deux BBM (enrichissements 4 et 6) ou BG11 (enrichissements 13 et 14) des milieux de croissance, tandis que les cultures sur milieu de croissance enrichi F / 2 (enrichissements 19, 21, 23) ont présenté une 4 - à la baisse de 34 plis activités carboxylase maximum. Ces différences n'étaient pas dues à des niveaux inférieurs de la biomasse dans les cultures F / 2, que l'activité carboxylase a été exprimé sur une base Chl. En outre, l'activité RubisCO n'était pas corrélée avec une concentration chl (r = -0,023, p> 0,1;. La figure 2, en médaillon). Les cultures BBM inoculés avec l'eau du lac à partir de 6 m et 15 m (enrichissements 4 et 5) ont eu le plus grand chl quelques niveaux, tandis que toutes les autres cultures exposées chl relativement faible a, indépendamment de l'activité enzymatique RubisCO (Fig. 2).

Figure 1.Représentant cultures microbiennes eucaryotes enrichissement qui ont sélectionnés pour la croissance d'organismes différents. Identité de la culture est donnée dans la partie inférieure gauche des panneaux. Toutes les images représentent des micrographies de lumière générées à l'aide immersion dans l'huile à un grossissement de 1000X.

Figure 2. Potentiel capacité de fixation de carbone et de la chlorophylle extractible quelques niveaux dans les cultures microbiennes antarctiques enrichissement eucaryotes isolées du lac Bonney et cultivées sur des milieux de culture différents. Voir le tableau 1 pour plus de détails la culture Encart:. De corrélation de Pearson entre la chlorophylle a le potentiel de fixation de carbone dans l'abondance et les cultures microbiennes antarctiques enrichissement eucaryotes.

Les études moléculaires récentes ont rapporté une grande diversité de eucaryotes unicellulaires à travers une gamme d'environnements ^{3, 19, 20;} toutefois, en raison d'un manque d'isolats dans toute la gamme des habitats protistes les rôles fonctionnels de ces espèces individuelles dans les réseaux trophiques sont en grande partie inconnue. Dans cette étude, nous avons décrit des méthodes pour enrichir des espèces microbiennes eucaryotes présentant polyvalence métabolique à partir d'un environnement relativement sous-échantillonné, une permanence recouverte de glace en Antarctique lac. Cultures enrichies à partir des profondeurs d'échantillonnage différentes dans le lac Bonney ont affiché des taux différentiels de carbone de fixation qui étaient de croissance à moyen-dépendante. Par exemple, un faible potentiel de fixation du carbone dans les cultures enrichies en F / 2 en fonction de BBM ou les médias BG croissance de 11 reflètent probablement des différences dans la diversité des protistes et de la capacité métabolique. Milieu de croissance BBM sélectionne pour des espèces d'algues vertes (chlorophycées ou) et de nos cultures semblent être une monoculture d'une espèce d'algues vertes (Fig.1A, B). Ces organismes sont connus pour dépendra en grande partie photoautotrophy. Un isolat du lac Bonney expositions métabolisme photoautotrophe pur, ayant une exigence stricte de la lumière comme source d'énergie unique ^1. En revanche, à moyen F / 2 de croissance est conçu pour enrichir une large gamme de protistes marins, y compris les organismes potentiellement mixotrophes ^12. Bien que nous n'ayons pas d'explorer pleinement la diversité des cultures F / 2, des vues microscopiques de ces enrichissements montrent clairement un consortium de protistes de morphologies cellulaires (Fig. 1C, D). Ainsi, une activité réduite dans les cultures RubisCO F / 2 pourrait être due à l'utilisation des modes alternatifs d'acquisition de carbone / énergie. À l'appui de cette prédiction, les cultures pures d'isolats Antarctique photoautotrophes présentent significativement plus élevé des taux maximum carboxylase Rubisco par rapport à l'Antarctique isolats qui mixotrophie exposition (Dolhi & Morgan-Kiss, résultats non publiés). D'autres études de hétérotrophes enzl'activité YME dans ces échantillons aiderait à caractériser pleinement la polyvalence métabolique des cultures d'enrichissement de protistes et sont actuellement en cours dans notre laboratoire. En outre, les données physiologiques décrits dans le présent document sera complété par des informations phylogénétiques et métagénomique de séquençage dans le cadre d'un effort de séquençage à grande pour caractériser les communautés microbiennes dans le monde entier appelé le projet de la Terre du microbiome ( http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .

Le test de filtrage modifié décrit dans le présent rapport pourraient également être appliquée à lysat cellule extraite de filtrées des échantillons d'eau du lac. Cependant, pour de nouvelles applications de ce test, le volume de lysat optimale doit être déterminée par dosage de trois volumes différents et en utilisant ce qui donne cpm au moins 3 à 4 fois au-dessus des contrôles négatifs. Les analyses de potentiel de fixation du carbone, en liaison avec les analyses enzymatiques de activités hétérotropheté dans les communautés de protistes naturelles fournirait une vue plus détaillée du rôle de la capacité trophique protiste et cycle du carbone dans les milieux aquatiques. Nous sommes en train d'appliquer cette approche pour comprendre le rôle des facteurs environnementaux abiotiques dans la polyvalence métabolique protiste dans le lac Bonney et d'autres lacs antarctiques. La carboxylase RubisCO méthode de dosage du filtre sera un outil précieux pour étudier la fixation du carbone potentiel et la polyvalence métabolique dans les petites cultures d'enrichissement d'échelle ainsi que des systèmes lacustres entiers.

Avant le développement de la culture indépendants des outils moléculaires, les protistes ont été traditionnellement identifié par la culture et taxonomiquement classées en fonction de leur morphologie cellulaire. Ainsi, il ya une longue histoire de l'enrichissement et l'isolement des protistes résidant dans une grande variété d'habitats. Les premières enquêtes, en particulier, sont de grande valeur historique pour l'identification taxonomique détaillée (revue dans: ^{21, 22).} Bien que l'isolement des protistesrecourir à l'enrichissement des approches fondées sur est relativement rare dans les eaux douces Antarctique, plusieurs isolats de protistes marins de l'enrichissement de l'eau de mer antarctiques sont disponibles ^23-26. En outre, plusieurs collections de cultures sont consacrées à des protistes et les isolats de microalgues (par exemple pour: la collection de culture Provasoli-Guillard, https://ncma.bigelow.org/~~V ). Technologies de séquençage fiables et pas cher ont produit une énorme base de données génétique des séquences protistes incultes. Bien que ces bases de données ont été très instructif en ce qui concerne la diversité et la distribution de cet important groupe de micro-organismes, il ya un fossé qui se creuse dans la liaison de données de séquence avec notre compréhension de l'écologie et la physiologie des protistes. Ainsi, les techniques traditionnelles de culture, en particulier dans des environnements sous-échantillonné comme les habitats aquatiques polaires continuera à jouer un rôle important dans la compréhension de l'importance et les rôles écologiquesdes protistes dans le cyclisme géochimiques mondiale.