Detectie van virale RNA door fluorescentie

Kishanda Vyboh^1,2, Lara Ajamian^1,3, Andrew J. Mouland^1,2,3

¹Lady Davis Institute for Medical Research, Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital, ²Department of Microbiology and Immunology, McGill University, ³Department of Medicine, Division of Experimental Medicine, McGill University

1. Probe Voorbereiding

1. Digest 1 pg van het in vitro transcriptie vector, pKS (+) pol 236nt ⁹ met Kpn1 enzym bij 37 ° C gedurende 1 uur en loopt het gelineariseerde DNA product op een agarose gel. Het fragment dient ongeveer 2500 bp.
2. Snij het ​​fragment van de gel en zuiveren met de Roche Micro Elueer gelextractiekit (alle gebruikte reagentia worden in tabel 1). Voer de laatste elutie in 30 pi elutiebuffer. Run 5 ul van het product op een agarose gel om de zuivering te controleren.
3. Meng een in vitro transcriptie reactie (zie onderstaand recept) met de DIG Roche RNA labeling kit en incuberen bij 37 ° C gedurende 2 uur.

In vitro transcriptie reactie:

4. Voeg 228 U van DNase I en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
5. Stop de reactie door toevoeging EDTA pH 8,0 tot een eindconcentratie van 20 mM.
6. Zuiver de reactie met behulp van de Quick Spin kolommen van Roche zoals gespecificeerd door de fabrikant.
7. Zuiver de sonde door neerslag met 1/10 volume DEPC behandeld met 3M NaOAc pH 5,2 en 2,5 volumes van ijskoude 95% ethanol. Mengen en incuberen bij -80 ° C gedurende 30 min een nacht.
8. Centrifugeer de sonde 15 min bij 4 ° C bij 15.000 x g.
9. Verwijder het supernatant en was de pellet in ijskoude 70% ethanol. Centrifugeer opnieuw gedurende 5 min bij 4 ° C bij 15.000 x g.
10. Verwijder het supernatant en droog de pellet. Resuspendeer de pellet in 50 ul water (DNase / RNase gratis) met 10 U Invitrogen RNase OUT.
11. Bereken de concentratie van probe spectrofotometrisch (maatregel RNA bij 260 nm), en verdund tot een concentratie van 5 ng / pl. Bewaren in fracties bij -20 ° C voor kortdurend gebruik, of -80 ° C voor opslag op lange termijn. Het wordt aanbevolen om onder assay vergelijkingen uit te voeren, zodat behoud van een hoeveelheid voor.

2. Cell Fixatie

1. Het is in eerste instantie belangrijk om zaad hechtende cellen op onbehandeld, steriele glazen dekglaasjes zodat de uiteindelijke confluentie na de oogst is ongeveer 70-80%. Voor niet-hechtende cellen groeien normaal en wanneer bereid verzamelen, te incuberen met dekglaasjes die zijn 0,01% w / v poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, Inc) behandeld gedurende 1 uur. Voor een typische 12 en polystyreen weefselkweek plaat (3,8 cm ²⁾ worden 150.000 cellen (bijv. HeLa) uitgeplaat 24 uur voorafgaand aan transfectie. Niet-hechtende cellen geïnfecteerd of getransfecteerd zoals gebruikelijk en mag adhier om dekglaasjes voor fixatie ^3.
2. Gooi de media en was de cellen met 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing bereid in dubbel gedistilleerd water (DPBS) gedurende 1 minuut. Diethylpyrocarbonaat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc) behandelde 1X PBS kunnen ook worden gebruikt, kunnen echter onbehandelde PBS niet omdat kan RNase enzymen.
3. Gooi de PBS en voeg 4% paraformaldehyde, genoeg om volledig te bedekken de cellen. Incubeer gedurende 15-20 minuten.
4. Gooi de paraformaldeyhyde en was cellen met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
5. Gooi de DPBS en voeg 0,1 M glycine (opgelost in 1X DPBS). Incubeer gedurende 10 minuten.
6. Gooi de glycine en was de cellen met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
7. Gooi de DPBS en voeg 0,2% Triton-X (opgelost in 1X DPBS). Incubeer gedurende 5-10 minuten. Als kleuring voor nucleolair of nucleaire envelop-eiwitten, permeabilize met Triton X-100 voor niet meer dan 5 min of het eiwit wordt de lokalisatie en diffuus.
8. Gooi Triton X-100 en was een keer in1X DPBS 1 min.
9. Voor de lange-termijn opslag, vervang PBS met 70% ethanol en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal vier maanden. U kunt ook eenmaal meer wassen met 1X DPBS en beginnen te vissen.

3. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

1. Indien de dekglaasjes opgeslagen in ethanol, vervangen ethanol 1X DPBS en kunnen de cellen te rehydrateren gedurende 30 minuten. Rehydratatie kan 's nachts worden gedaan als de dekglaasjes worden opgeslagen bij 4 ° C.
2. Was de dekglaasjes met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
3. Bereid je dia's aan het broeden op dekglaasjes en zorg te reinigen en goed te labelen ze.
4. Voor een 18mm dekglaasje, voeg 50 ul DNase oplossing (25 eenheden / dekglaasje, los verkrijgbaar) aan de dia. Voeg de dekglaasje, waarbij u het cel zijde leggen en dat zij het incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
5. Was de dekglaasjes met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
6. Voeg 50 ul hybridisatiemengsel (zie recept) per dekglaasje opeen dia en incubeer het dekglaasje cel naar beneden gedurende 16-18 uur bij 42 ° C De incubatie moet worden uitgevoerd in een bak met een 50% formamide, 2X SSPE mix (12,5 ml gedeïoniseerd formamide, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml water).

Hybridisatiemengsel (voor een dekglaasje 50 pi):

7. Incubeer dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi 50% formamide (verdund in 1X DPBS) gedurende 15 minuten bij 42 ° C.
8. Tweemaal wassen de dekglaasjes in 2X SSPE door incubatie deze cel naar beneden in 50 pi 2X SSPE (20X SSPE verdund in 1X DPBS) gedurende 5 min elk bij 42 ° C.
9. Was de dekglaasjes in 1X DPBS gedurende 1 minuut.

4. Immunofluorescentiekleuring

1. Blok de dekglaasjes door ze cel naar beneden in 50 pi 1X Roche blokkeeroplossing (10X Roche blokkeren verdund in 1X DPBS) gedurende 30 minuten.
2. Incubeer de dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi primaire antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Anti-DIG antistof worden verdund volgens fabrikant richting 1X blokkeeroplossing. Als andere antilichamen worden gebruikt om eiwitten vlek, kunnen zij worden toegevoegd aan het juiste concentratie voorwaarde dat alle gebruikte antilichamen zijn afgeleid van verschillende gastheer specn.
3. Was de dekglaasjes gedurende 10 min in 1X DPBS.
4. Incubeer de dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Alexa Fluor-geconjugeerde antilichamen (Invitrogen) kan worden gebruikt om verschillende kleuren genereren en worden op 1:500 in 1X blokkeeroplossing, 1X DPBS.
5. Was twee keer de dekglaasjes gedurende 10 minuten elk in 1X DPBS.
6. Droog de dekglaasjes cel kant naar boven op Whatman papier. Zorg ervoor dat u de dekglaasjes dekking van blootstelling aan licht en bleken te voorkomen.
7. Zodra alle vloeistof is verdampt, monteren de dekglaasjes op verse dia's met 8 pi ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.) Tik voorzichtig naar beneden het dekglaasje om eventuele luchtbellen te verwijderen.
8. Breng nagellak aan de randen van het dekglaasje om deze vast te zetten.
9. De visualisatie van RNA en eiwitten door microscopische technieken is ook cruciaal voor het succes van deze techniek. Instellingen op de gebruikte microscoop kan helpen of hinderen visualisatie dus het is belangrijk dat deinstellingen van de microscoop goed ingesteld en consistent ene monster elkaar in een bepaalde proef. Voor gedetailleerde microscopie instellingen, optica en antilichaam combinaties zie referenties ^1,10.

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van virale RNA kleuring te zien in figuur 2. Het virale RNA voor HIV-1 is te zien in het cytoplasma diffuus weergegeven voor het grootste deel, hoewel kleine cytoplasmatische punctae zijn niet ongewoon. De specificiteit kan worden gezien door het vergelijken van positieve cellen naar de omliggende cellen die geen fluorescentie weer te geven. Zoals in de inleiding, HIV-1 die de regulerende Rev eiwit mist produceert RNA dat wordt vastgehouden in de kern: dit kan gezien worden als een heldere signaal in de kern, en een gebrek aan RNA fluorescentiesignaal in het cytoplasma. Overexpressie van cellulaire eiwitten kan ook verschuiving van de verdeling van de HIV-1 RNA. In figuur 2 11 of N-terminaal verwijderd RILP (RILPN) ^11, en ​​eiwitten die interfereren met dyneine motorische functie [bv p50/dynamitin ^{1, 12],} interfereren met de normale stationaire toestand lokalisatie van het virale genoom RNA bepaald door FISH analyse RILP expressie leidt opnieuw lokalisatie van het virale genoom RNA het microtubule organisatie centrum (MTOC) ^13;. RILPN dispergeert late endosomen in de cytoplasma als gevolg van het onvermogen om te binden aan p150 ^gelijmd van de dyneine motor complex ¹⁴ en p50/dynamitin blokkeert de grote subeenheid van dyneine motor en releases endosomen laat, maar ook het virale genoom RNA en HIV-1 structurele eiwitten van de cel periferie ¹ (Figuur 2). De manipulatie van de steady-state lokalisatie van het virale genoom RNA, een belangrijke bijdrage leveren aan de besmettelijkheid vanvirusdeeltjes, zou in de eventuele ontwikkeling van geneesmiddelen. In onze handen viraal RNA in de cel reeds op 3 uur na transfectie en infectie ¹⁰ en wordt gemakkelijker door deze FISH techniek 12 uur.

Figuur 1. Stroomschema van het protocol voor FISH / IF co-analyses. De cellen worden gekweekt op dekglaasjes en daarna gefixeerd met paraformaldehyde. Behandelingen glycine en Triton-X worden uitgevoerd voordat de cellen worden gebruikt voor hetzij FISH / IF of opgeslagen in 70% ethanol voor opslag. Cellen gedehydrateerd voor opslag worden gerehydrateerd in 1X DPBS (DEPC behandelde PBS) alvorens verder te gaan met FISH / IF. Cellen worden behandeld met DNase I en liet nacht te hybridiseren met de probe. Na hybridisatie is voltooid, worden de cellen gewassen met formamide, en met SSPE, en een laatste 1X DPBS spoelen. Blokkeren oplossing wordt aangebracht op de cellen, gevolgd door incubatie metde primaire antilichamen. Na het wassen worden secundaire antilichamen toegepast. Laatste twee wasbeurten in 1X DPBS completeren het kleuringsprocedure waar op de dekglaasjes worden gedroogd en gemonteerd op dia's voor de beeldvorming.

Figuur 2. Representatieve resultaten met FISH / IF co-analyses. A) HIV-1 wordt getransfecteerd in HeLa-cellen en in sommige gevallen met constructen die de expressie van cellulaire eiwitten (RILP, p50/Dynamitin en RILPΔN (een amino-terminale deletie mutant) veroorzaken) . FISH / IF co-analyses werd uitgevoerd: RNA wordt aangeduid in het groen met een G3BP of LAMP1 (rood) te differentiëren. B) HIV-1 wordt uitgedrukt in HeLa en verzameld op verschillende tijdstippen. Viraal RNA expressie wordt gevolgd in het groen, terwijl het cellulaire eiwit, hnRNP A1, is gekleurd in het rood. Grootte balken 10 urn. Afbeeldingen gewijzigd ten opzichte van referenties ¹ (selecteer cijfers van panel A; RILP, p50/Dynamitin en RILP deltaN)en ¹⁷ (panel B).

FISH / IF co-analyse is een betrouwbare methode om virale RNA te visualiseren in cellen die nu is geraffineerd ^9,15,16. In de loop van enkele jaren, hebben we een verfijndere methode van kleuring voor RNA. Deze techniek kan worden gebruikt op een groot aantal celtypes die de sonde specifiek voor het doel RNA ^17. Door het labelen van de sonde met DIG, zijn wij in staat het visualiseren van de RNA door eenvoudige kleuring. Wanneer kleuring voor RNA en andere eiwitten worden gecombineerd, FISH / IF co-analyses uitgegroeid tot een krachtig instrument om cellulaire structuren en eiwit / RNA-lokalisatie te observeren.

De specificiteit van de RNA detectie vrij hoog. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2. In een deel van het originele werk dat zich richtte op virale genoom RNA lokalisatie, FISH vastgesteld dat een gebrek aan Rev viraal RNA gevangen in de kern ^18. Aangezien dit is, heeft veel nieuwe informatie over virale genoom RNA lokalisatie is verkregen met behulp van de technique hier beschreven. Door overexpressie cellulaire eiwitten kunnen specifieke groepen en niet alle van het virale RNA gedwongen lokaliseren verschillende gebieden van de cel. RILP overexpressie, die lijkt op de fenotype verkregen wanneer hnRNP A2 is uitgeput door siRNA in HIV-1-expresserende cellen ^13, waardoor de RNA zichtbaar ophopen op de MTOC. De virale genoom RNA kan worden geduwd om de cel omtrek uitschakelen van de min-end motor eiwit dyneine: p50/Dynamitin overexpressie of knockdown van de zware keten dyneine ¹ resulteert in het vrijkomen van virale genoom RNA van intracellulaire domeinen van de cellulaire periferie ( Figuur 2). Een mutant van RILP, RILPΔN, die niet meer bindt de dyneine motor, verspreidt endosomen (getagged door LAMP1) in het cytoplasma, omdat ze niet meer actief gelokaliseerd in juxtanuclear domeinen. Deze resultaten wijzen op het idee van een plastic populatie van HIV-1 RNA genoom en in het bijzonder, dat verschillende zwembaden van HIV-1 genoomRNA bestaan ​​soms identificeerbare rollen in de virale replicatie cyclus. Dezelfde begrippen zijn reeds aangegeven voor het eiwit gecodeerd door dit mRNA, Gag ^19.

Er zijn beperkingen aan het gebruik van FISH / IF co-analyses die zijn gerelateerd aan antilichaam keuze en beschikbaarheid. De optimalisatie van de beste combinatie van primaire en secundaire antilichamen, en de concentraties daarvan, zal de tijd nemen om te optimaliseren (zie tabel 1 & 2). Antilichamen gemaakt van hybridoma of geproduceerd door grote bedrijven kan hebben concentraties die overal variëren van 1:2 tot 1:2000, maar zorg ervoor dat de richtlijnen van de fabrikant voor het beste resultaat te volgen. De gastheer waarin het antilichaam geproduceerd moet worden overwogen. Mengen schapen met geit antilichamen moet worden vermeden in primaire en secundaire antilichamen als deze combinatie hoge achtergrond door cross-soortherkenning (gegevens niet getoond). Voor de Alexa-Fluor secondary antilichamen, kan de concentratie worden gebruikt 1:500 bijna elk antilichaam in de toestel. De andere nadeel van FISH / IF co-analyses, zoals beschreven in dit rapport is het vangt de RNA op de locatie bij steady-state, na cellen zijn gefixeerd en doorlaatbaar gemaakt met behulp van paraformaldehyde en wasmiddel (Figuur 1).

Er is echter RNA-imaging in levende cellen is bereikt door een verscheidenheid aan middelen ^20-22, meestal in varianten van de virale RNA-genomen die zijn voorzien van tag door fluorescerende eiwitten zoals GFP. Echter aanvullende middelen om RNA-lokalisatie te identificeren in levende cellen blijven aan de oppervlakte. Deze nieuwe methoden betrekking op de tagging RNA door middel van Spinazie ^23, SNAP ^24, of MTRIP ^2. Deze technieken lijden enkele nadelen waaronder de vereiste cellen permeabilize voor toevoeging substraten of een groep worden geconstrueerd om de mRNA labelen te detecteren mRNA microscopie. Immers de belangrijkste ADVAntage van FISH analyse beschreven in dit rapport ligt in het feit dat de natieve RNA ongewijzigde leidt tot de fysiologisch relevante resultaten.