Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti

Destrani fluorescenti sono stati utilizzati come strumenti anatomici e per l'imaging attività neuronale ^1-4. Campi et al. (2009) ⁴ pubblicato un protocollo per l'applicazione di ioni e della tensione di coloranti sensibili ai tratti assonali con un focus sul midollo spinale come sistema modello. Qui si descrive una procedura più dettagliata per l'applicazione colorante fluorescente e / o ione-sensibile alle radici taglio ventrali, radici dorsali o qualsiasi tratto neuronale del midollo spinale per studi in vitro optophysiological e morfologiche.

1. Di tipo I e tipo II Pipettes

Avviare tirando due brevi tratti di tubazione in polietilene (PE90, Clay marca Adams) sulla fiamma di una lampada ad alcool ⁷ per la produzione di pipette con puntali conici. Una pipetta (Type-I) deve essere breve (3-7 mm) con una piccola punta che può ben tenere la radice di destinazione o del tratto (diametro esterno: 0,2-0,4 mm, diametro interno: 0,1-0,3 mm). Quindi tirare una pipetta secondo (Type-II) con un più lungo (8-12 cm) più sottile, albero e una punta molto fine (diametro esterno: 0,2-0,3 mm, diametro interno: 0.1-0.2 mm) che può essere inserito nel tipo I pipettare fino la sua punta. La seconda pipetta sottile verrà utilizzato per aspirare ed introdurre fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) e la soluzione colorante, rispettivamente, dal tipo I pipetta.

2. Posizionamento di tipo-I Pipettare

Staccare ed isolare il midollo spinale ^8,9 e collocarlo in un bagno, con superfuso refrigerate ACSF (~ 16 ° C) durante tutto il processo di caricamento. Posizionare il Type-I pipettare su un portaelettrodo (H1/12 portaelettrodo, Narishige) in modo che la sua apertura posteriore può essere facilmente collegato ad una siringa (1 ml U-100 siringa da insulina, Becton Dickinson o comparabili) tramite un tubo flessibile (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Fig.1A-B).

3. Dye Application

1. Usando la siringa, prima disegnareACSF nel tipo I pipetta (Fig.1B; 2A) seguita dal tratto assonale o radice da riempire (Fig. 2B). Il tubo flessibile deve quindi essere rimosso dalla apertura posteriore. Il Tipo II-pipetta è attaccata ad un'altra siringa e inserito nel tipo I pipettare premuto il tratto assonale o radice. Usando la siringa collegata al tipo II pipetta, aspirare ACSF in modo che il residuo ACSF copre appena il tratto assonale (Fig.1C; 2C-D). Poi ritirare il tipo II pipetta dal tipo I pipetta. Monitorare il livello ACSF per qualche minuto per verificare una buona tenuta sul tratto assonale o nervi (vedi sezione 3 Risoluzione dei problemi di "buona tenuta").
2. Sciogliere il colorante in ACSF o 0,2% di Triton X-100 in acqua bidistillata e renderlo il Type-II pipetta facendo attenzione a non includere bolle d'aria. Inserire il Tipo II-pipetta contenente il colorante nel tipo I pipetta e nella soluzione residua ACSF (Fig. 2E). Rilasciare lentamenteil colorante nella ACSF mediante una leggera pressione positiva (Fig. 2F). Fare attenzione a non introdurre eventuali bolle d'aria o di provocare lo spostamento del tessuto bersaglio dall'interno della punta. Ritirare il tipo II pipetta dopo sufficiente quantità di colorante è stata rilasciata (3-5 ml di soluzione colorante).

4. Incubazione

Incubare il tessuto al buio tra 6 e 20 ore a seconda del tipo di esperimento. Una volta che un tempo sufficiente è stato consentito per il riempimento, tirare delicatamente l'elettrodo lontano dal tessuto lasciando il tessuto pronto per l'imaging e l'istologia.

Risoluzione dei problemi

1. Se il tessuto bersaglio non entra facilmente nella punta della pipetta di tipo I o è sciolto una volta dentro, allora il diametro della punta è la dimensione sbagliata. In questo caso, tirare e utilizzare una pipetta differente.
2. Prima di aggiungere il colorante alla ACSF del tipo I pipetta, assicurarsi che ACSF sia sufficiente in modo che possa essere raggiunto con laType-II puntale (Fig. 2D). Altrimenti, un traferro esisterà una volta che il colorante viene aggiunto. Se questo accade, non aggiungere il colorante e rimuovere il tratto assonale dalla pipetta e poi tirarla indietro con ACSF sufficiente per essere raggiunto dalla Type-II pipetta.
3. Se il livello ACSF in tipo I aumenta pipette dopo che è stato aspirato con il Tipo II-pipetta, significa che il sigillo con il tessuto non è buona. Utilizzare un elettrodo diverso, altrimenti il ​​colorante viene diluito nel corso della procedura di etichettatura.
4. Se una bolla d'aria viene introdotta nel tipo I pipetta mentre iniettando il colorante, defluire la bolla facendo avanzare il tipo-II vicino punta della pipetta per la bolla e delicatamente applicando una pressione negativa debole usando la siringa attaccata.

5. Risultati rappresentativi

Motoneuroni Per illustrare l'applicazione del metodo, caricati contemporaneamente, le afferenze sensoriali e interneuroni spinali con tre differenti Dextcorse di coniugati coloranti fluorescenti (Fig. 3A). Come illustrato in fig. 3B, tre classi di neuroni sono etichettati; afferenze sensoriali (rosso), interneuroni sporgenti all'interno del funicolo ventrale (verde) e motoneuroni (blu).

Figura 1. Schema che mostra Pipettare di tipo I e tipo II montaggio. (A) Un tipo I pipetta (luce blu) è posto su un portaelettrodo in modo che sia indietro apertura può essere facilmente collegata al tubo elastomero flessibile (B) e in cui uno di tipo II pipetta può essere inserito (C).

Figura 2. Schematico che mostra il processo di caricamento dei motoneuroni con coloranti fluorescenti. (A) di tipo A-I pipetta si trova vicino alla radice ventrale da riempire. (B) di aspirazione viene applicata alla pipetta per disegnare ACSF nella pipetta seguita dalla radice. (C-D) Staccare il tubo flessibile in elastomero dal backend di tipo-I pipetta e ridurre la quantità di ACSF applicando aspirazione alla Type-II pipetta. (E) Inserire la punta della pipetta Type-II contenente il colorante dissolto nel ACSF rimanente nel tipo I pipetta. (EF) Lentamente riempire la Type-I pipetta con il colorante e quindi rimuovere la Type-II pipetta.

Figura 3. Applicazione della procedura di riempimento al midollo spinale topo isolato. (A) schematico che mostra tre tipo I pipette per riempire diverse classi neuronali nel midollo spinale. Motoneuroni (blu, blu destrano Cascade) e sacrale afferenze sensoriali (rosso, Texas-Red destrano) sono stati riempita attraverso le radici ventrali e dorsali, rispettivamente. Fluoresceina destrano è stato utilizzato per caricare interneuroni spinali (verde) i cui assoni salire attraverso il funicolo ventrale (VF). 1 mg di ciascun colorante destrano (10.000 MW; Molecular Probes)è stato sciolto in 6 microlitri di acqua distillata contenente 0,2% Triton X-100 (B). Immagine confocale di una sezione del midollo sacrale di un midollo spinale in cui i neuroni sono stati retro-etichettato come descritto in A. Si noti che le afferenti etichettate sensoriali sono principalmente omolaterale con alcune sporgenze poco controlaterali. I neuroni motori sono etichettati omolaterale alla radice ventrale riempita mentre le interneuroni sono etichettati controlaterale al lato del riempimento (testa freccia). Calibrazione bar 200 micron.

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Disclosures: Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti

Acknowledgements: Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti