Ovariëctomie en 17β-estradiol Vervanging bij ratten en muizen: een visuele demonstratie

1. Ovariëctomie via de Dorsale Route

1. Verdoven dier, bijvoorbeeld met 1,5% isofluraan (4% inductie) in een zuurstof / lachgas 30% / 70% mengsel. Plaats het dier in buikligging op een verwarmingsplaat verbonden met een rectale thermometer. Het is belangrijk om een ​​dunne laag isolatie tussen de dieren en de plaat en dat de thermometer terugmeldingssysteem houdt de lichaamstemperatuur binnen 37 ± 0,5 ° C. Breng gel voor oogbescherming en beheren van 5 mg Rimadyl / kg lichaamsgewicht verdund in een zoutoplossing subcutaan aan de laterale aspect van de nek van het dier voor postoperatieve pijnbestrijding.
2. Cephally Shave een 4 * 4 cm (3 * 3 cm voor muizen) gebied van het bekken. Grondig het geschoren gebied met bijvoorbeeld Jodopax voordat die het dier met een 4 * 4 cm opening operatie vel.
3. Maak een 2-3 cm middellijn incisie en bot ontleden de huid van de onderliggende fascia. Een cm lateraal van de middellijn, maak een andere incisie through de fascia. Botweg zijdelings ontleden onder deze fascia zo oppervlakkig als mogelijk tot het bereiken van de buikholte.
4. Behulp van een pincet, pak het vetweefsel, dat de eierstok schouwen in de buikholte en trek het voorzichtig uit. Identificeer de eierstok en ligeren de baarmoeder horens en schepen 0.5-1 cm proximaal van deze structuur. Snijd de eierstok en geligeerde vetweefsel en zet de resterende weefsel terug in de buikholte. Maak nog een incisie in de contralaterale fascia en herhaal de procedure.
5. Sluit de wonden, bij voorkeur met behulp van een monofilament hechtdraad, en wakker laten we het dier van anesthesie. Plaats het dier in een verwarmde kooi (25-27 ° C) gedurende tenminste 2 uren na de operatie. De dieren moeten afzonderlijk worden de eerste dagen na de operatie gehuisvest. Het is cruciaal dat de kooi regelmatig wordt gereinigd / vervangen tijdens de fase van herstel. Vierentwintig uur na de operatie, subcutaan injecteren de dieren met een andere 5 mg Rimadyl / kg lichaamsgewicht verdund inzoutoplossing.

2. Subcutane toediening van 17β-estradiol door Silastic Capsules

1. Meng de gewenste hoeveelheid 17β-oestradiol in sesamolie. Voor de fysiologische concentraties bij ratten en muizen, raden wij aan 180 pg / ml en 18-36 ng / ml. Placebo capsules zijn gevuld met pure sesamolie.
2. Knip 3 cm (2 cm voor muizen) een lengte van silastic buizen en 5 mm (3 mm voor muizen) lengtes van houten stokken applicator voor het aansluiten. Met behulp van een tang, knijp een houten plug in de silastic capsule voor het injecteren van de 17β-estradiol/sesame olie oplossing voor de gehele lengte te vullen. Voorzichtig de dop op de silastic capsule in het open einde met een andere houten plug (de stekkers worden verondersteld om permanent te verblijven in de capsule). Incubeer de capsules in de resterende 17β-estradiol-oplossing 's nachts voor implantatie.
3. Implantatie van de capsule kan worden uitgevoerd tijdens de anesthesie gebruikt bij ovariëctomie bij ratten. Voor mice wordt echter een 14-daags herstelperiode na ovariectomie raden om het risico van de capsule ketel door het fragiele huid te voorkomen.
4. Na chirurgische preparaten in 1,1 of na het sluiten van de ovariectomie insnijding scheren en wassen een 2 * 2 cm oppervlakte op de dorsale zijde van de hals van het dier. Maak een 1 cm incisie en botweg caudolaterally ontleden een subcutane pocket, met veel ruimte voor de capsule. Veeg de silastic capsule (dat tot nu-punt is geïncubeerd 17β-oestradiol oplossing) en voorzichtig te installeren door de snede, die vervolgens wordt gesloten door een hechtdraad. Het is cruciaal om ervoor te zorgen dat de capsule stammen huid zo min mogelijk, met name in de directe omgeving van de wond. Van productie van capsules de implantatie, is het belangrijk dat besmetting wordt voorkomen.

3. Perorale toediening van 17β-estradiol via de Nut-ijs Nutella

1. Grondig te ontbinden 17β-estradiol in sesamolie, en dan meng de sesamolie met de Nutella. We raden aan elke dagelijkse portie 28 ug 17β-estradiol, 5 ui sesamolie en 1 g Nutella per kilogram lichaamsgewicht voor ratten en 1,12 microgram 17β-estradiol, 0,312 ul sesamolie en 60 mg Nutella voor elke 30-g muis bevat. Placebo moer-ijs is op dezelfde manier bereid maar dan zonder de 17β-estradiol.
2. Train de dieren om hormoon-vrije moer-ijs te eten vijf dagen voorafgaand aan het experiment. De eerste drie dagen van de opleiding, moeten de ratten optimaal worden getraind in groepen (ongeveer 0,5 g Nutella tot 2-5 dieren), in hun eigen kooien. Op de vierde en vijfde dag van de opleiding, worden de dieren in aparte kooien voor het ontvangen van de dagelijkse portie van de experimentele situatie lijken.
3. Tijdens het experiment worden de dieren in afzonderlijke kooien om voeding gelegenheid, waarna de Nutella gedeelte wordt gevoerd op kleine keramische tegels. Indien training is uitgevoerd als hierboven our ervaring is dat meer dan 95% van de ratten en muizen de moer-ijs te accepteren, en een keer volledig gewend, de meeste van de dieren eten het binnen enkele seconden.

4. Representatieve resultaten

Fysiologisch serum 17β-estradiol concentraties, die de huidige methoden richten zich voort te planten, zijn ongeveer 5 tot 140 pg / ml voor ratten en 5-35 pg / ml voor muizen ^4,6. De subcutane silastic capsules volgens de instructies hierboven bij toediening aan 300 g vrouwelijke Sprague-Dawley ratten, produceren langzaam afneemt 17β-oestradiol serum van ongeveer 40 pg / ml dag 2 tot 10 pg / ml dag 35. Echter, direct na de toediening, kan een serumconcentratie piek rond de 1000 pg / ml worden verwacht, vallen op de fysiologische bereik binnen 8 uur (Figuur 1A) ^4,5. De silastic capsules voor muizen hierboven beschreven met 36 ug 17β-estradiol/mL, indien toegediend aan 25 g vrouwelijke C57BL / 6 muizen, maken serum concentrations die langzaam afnemen van ongeveer 90 pg / ml dag 2 tot 25 pg / ml dag 35. Dit wordt waarschijnlijk voorafgegaan door een vergelijkbare piek zoals in de ratten, hoewel dit niet onderzocht (figuur 1B) ^6.

De perorale Nutella methode met de doseringen hierboven beschreven toegediend aan 300 g vrouwelijke Sprague-Dawley ratten, maakt fysiologische niveaus van 17β-oestradiol met dagelijkse fluctuaties van 10-70 pg / ml (Figuur 2A) ^4. Voor muizen met de bovenstaande dosering dagelijkse schommelen tussen ongeveer 20 en 120 pg / ml (Figuur 2B) ^6.

. rong> Figuur 1 gestileerde grafieken presenteren 17β-oestradiol concentraties in ratten (A, n = 10 tijdstippen tot 24 uur, n = 15 later tijdstippen) ^4,5 en muizen (B, n = 10) ⁶ na capsule implantatie. De silastic capsules produceren een korte eerste piek van serum concentraties tot 1000 pg / ml, maar daling binnen enkele uren tot minder dan 100 pg / ml. Voor de komende 4-5 weken, de capsules opleveren stabiel, hoewel gestaag af, serum concentraties. De gearceerde gebieden komen overeen met fysiologische 17β-estradiol serum concentraties in intacte vrouwelijke ratten en muizen respectievelijk. Ook al niet visueel aangetoond in de grafieken is er inter-individuele variabiliteit in de 17β-estradiol concentraties, waardoor variatiecoëfficiënten 27 tot 183% bij ratten en van 28 tot 115% in muizen met de silastic capsule methode (zeer lage gemiddelde concentraties vaak het genereren van hoge coëfficiënten van variatie).

iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg "/>
Figuur 2 presenteert gestileerde grafieken 17β-oestradiol concentraties in ratten (A, n = 15). ⁴ en muizen (B, n = 10) ⁶ als gevolg van dagelijkse toediening hormoon in Nutella. De perorale Nutella-methode maakt de dagelijkse pieken, maar lang niet zo hoog als die door subcutane of intraveneuze methoden. Dit simuleert de farmacokinetiek van menselijke hormoon en de perorale behandeling kan doorgaan zolang als nodig, zelfs indien het voorbeeld slechts een eerste 96 uur presenteren. De gearceerde gebieden komen overeen met fysiologische 17β-estradiol serum concentraties in intacte vrouwelijke ratten en muizen respectievelijk. Hoewel visueel niet aangetoond in de grafieken is er inter-individuele variabiliteit in de 17β-estradiol concentraties, waardoor variatiecoëfficiënten 40 tot 132% bij ratten en van 13 tot 219% in muizen met de Nutella-methode (zeer lage gemiddelde concentraties genereren vaak hogeVariatiecoëfficiënten).

De administratie modi hierboven gepresenteerd hebben in eerdere studies bleek superieur aan commerciële slow-release tabletten en injecties op het gebied van het produceren van fysiologisch serum concentraties van 17β-estradiol. Terwijl de slow-release pellets te produceren zeer hoog en langdurig serumconcentratie pieken, de injecties veroorzaken extreme, dagelijks hormoonschommelingen en vereisen herhaalde stressvolle omgang met de dieren ^4-6. Het belang van het kiezen van een adequate administratie modi wordt onderstreept door de recente studies waaruit blijkt dat, terwijl een lage dosis 17β-estradiol administratie regimes (zoals de technieken die in dit artikel) te beschermen tegen cerebrale ischemie ^8-10, de 17β-estradiol concentraties geproduceerd door de commerciële slow-release pellets kan eigenlijk verhoging van de cerebrale schade ^1,2,11-14. Drinkwater administratie en orale sondevoeding zijn twee andere, minder vaak, de methoden die zijn getest. Het beheer van de hormoon via het drinkwater heeft zijn grootste voordeel in het zijn extreem niet-invasieve, omdat bijna geen dieren omgaan helemaal nodig is. Echter, 17β-oestradiol niet oplosbaar is in water zonder emulgator, de individuele wateropname is moeilijk te controleren en als het doel is van het verbruik van een pil ander nadeel is dat de muizen water drinken tijdens de gehele 24 uur . Orale sondevoeding heeft de grootste nadeel dat het stress van het dier en kan slokdarm letsel die eetgedrag kunnen beïnvloeden.

De hier beschreven methoden - silastic capsules en perorale Nutella - zijn beide geschikt voor korte termijn oestrogeen toediening en voor een langere periode van maximaal 5-6 weken. Indien hogere doses worden toegediend dan hierboven beschreven, ongeacht het type van toediening medium kan lange oestrogeentoediening ernstige bijwerkingen zoals urethrale occlusie door mucosale proliferatie ^15.

Dagelijkse consumptie van grote hoeveelheden energie-rijke Nutella zou kunnen leiden tot gewichtstoename. Echter, de kleine bedragen hierboven beschreven alleen komen overeen met minder dan 5% van de dieren de dagelijkse energie-inname en excessieve gewichtstoename is niet waargenomen in onze studies met behulp van Nutella.

Het cruciale verschil in het werken met ratten en muizen verdient speciale aandacht. Ook al strenge hygiëne cruciaal is, ongeacht van diersoorten, muizen gevoeligheid voor infecties pleit voor controle op nog hoger niveau dan bij het werken met ratten. Zo moet een zorgvuldige desinfectie van de huid voorafgaand aan de incisie, frequente verandering van medische handschoenen en het gebruik van steriele chirurgische instrumenten niet in gevaar worden gebracht. Implantaten zijn altijd broeinesten voor infecties. De dieren moeten daarom regelmatig worden onderzocht op tekenen van infectie na capsule implantatie. Als een abces is gevormd rondhet implantaat, raden wij aan dat het dier ingeslapen is of dat de capsule is verwijderd, de wond zorgvuldig gereinigd, en een andere capsule weer door middel van een nieuwe incisie. Verder is de huid van muizen rug is veel kwetsbaarder dan bij ratten, rechtvaardigt twee weken van herstel na ovariëctomie voordat capsule administratie.

De methoden hierboven besproken kunnen ook worden gebruikt voor andere stoffen dan 17β-oestradiol. Het is echter belangrijk dat de farmacokinetiek en dosis van elk stelsel nauwkeurig wordt gekenmerkt, bij voorkeur door opeenvolgende serum metingen van de toegediende stof.