Analyse af Pulmonal dendritiske celle modning og migration under Allergisk luftvejene

1. Sensibilisering af mus med ovalbumin

1. Fremstille en opløsning af OVA (kvalitet V, Sigma, MO) i sterilt PBS til en koncentration på 1 mg / ml (opløsning kan opbevares ved -80 ° C).
2. For at forberede OVA-Alun blanding tage alun i et rør, og der tilsættes OVA opløsning på en dråbevis måde mens prøveglasset omrystes i et forhold på 1:1. Blandingen omrøres i 30 minutter og anvende det samme efter blanding.
3. Anvendelse af en 1 ml sprøjte, injiceres 0,2 ml af blandingen i mus peritoneale hulrum og gentage injektionen igen efter 2 uger.

2. Intranasal Challenge af mus med FITC mærket Ovalbumin

1. 7 dage efter den anden injektion af OVA-Alun, mus er klar til at blive udfordret intranasalt med OVA-FITC.
2. Fremstille en opløsning af OVA-FITC (Sigma) under anvendelse af sterilt PBS i en koncentration på 1 mg / ml og opbevares i aliquoter ved -80 ° C.
3. Placere en steril gaze på bunden af ​​en 50 ml Falcon-rør og i en kemisk timerOOD, tilsættes 5 ml Aerrane på gaze. For at bedøve mus, dirigere dyret ind i røret i ca 5-10 sekunder.
4. Hold bedøvede dyr i en oprejst stilling og med sterile pipettespidser, pipette 100 ul af OVA-FITC-opløsning på de næsebor hos mus i et dråbevis måde.
5. Gentag intranasal udfordring med OVA-FITC for de næste to dage.

3. Fremstillinq af Single-cellesuspension fra lungerne og af de drænende lymfeknuder

1. Ofre mus under anvendelse af intraperitoneal injektion af Euthanyl.
2. For at reducere makrofag kontaminering, som kan komplicere DC-analyse, lungeudskylning udføres. Til udskylning lungerne, er muse tracheas kort eksponeres og kanyleres med et kateter og en sprøjte, med iskold PBS med 5 mM EDTA, er den nedre luftveje skyllet 3 gange for at fjerne celler fra de alveolære rum.
3. Perfundere lungerne med 10 ml PBS indeholdende 10 U / ml Heparind via den højre ventrikel af hjertet. fjerne blodlegemer fra lungen vaskulaturen Udføre perfusioner indtil lungerne blive hvidt, indikerer fjernelse af det meste af blodceller. Dette er især vigtigt at fjerne kontaminerende celler fra det perifere blod.
4. Dissekere lungerne ud og fjerne mediastinale lymfeknuder (MLN) og placer lymfeknuder i en separat skål. (Forsøg på at minimere udsættelse af væv for lys for at forhindre quenching af FITC fluorescens).
5. Placer lungerne på en petriskål og hakkekød med en saks. Næste fordøje lungerne i 25 minutter ved 37 ° C under anvendelse af 250 U / ml collagenase D (Roche), og der tilsættes EDTA (10 mM slutkoncentration) i de næste 5 minutter for at standse collagenase-aktivitet.
6. Passerer fragmenter af spaltede lungerne gennem en 100 um cellefilter og udføre hypotonisk lysis at fjerne erythrocytter. Den enkelt cellesuspension er klar til yderligere analyse af DC'er.
7. For at fremstille en enkelt cellesuspension fra MLN, tlette MLN hjælp fine nåle og fordøje med collagenase som beskrevet ovenfor, efterfulgt af dræning gennem en celle si.

4. Farvning for DC Markers at vurdere Modning / migration

1. For at identificere udviklingslandene i lungerne, er farvning udføres for CD11c og CD11b. Desuden at vurdere for modning, er farvning udføres for CD86 og CD80, der er opreguleret som udviklingslandene gennemgår modning. CD11c ⁺ CD11 b ⁺ OVA-FITC ^+-celler i MLN er identificeret som pulmonale DC'er migrerer fra lungerne til MLN som reaktion på OVA luftvejene udfordring.
2. Suspendere cellerne i en koncentration på 10 x 10 ⁶ celler / ml i FACS-buffer (PBS med 1% FBS og 1 mM EDTA) og alikvot 150 gl cellesuspension / rør i FACS-farvning. Til identifikation af lunge udviklingslandene, er følgende pletter behov: Ufarvet kontrol (lungeceller fra mus ikke er udsat for OVA-FITC), OVA-FITC-kontrol, CD11c enkelt kontrol, CD11b enkelt kontrol, CD11b⁺ CD11c ⁺ dobbelt kontrol, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbelt kontrol, CD11 c ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbelt kontrol, MHC II enkelt kontrol, CD86 enkelt kontrol, CD80 enkelt kontrol og prøver farves for OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ MHCII ⁺ , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ og OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. For at vurdere DC migration, udføre absolutte celletal på det indre cellesuspensionen fra MLN og derefter forberede de følgende rør: Ufarvet kontrol (MLN celler fra mus, ikke er udsat for OVA-FITC), æg-FITC kontrol, CD11c ⁺ enkelt kontrol, CD11b ⁺ dobbelt kontrol, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbelt kontrol, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbelt kontrol og CD11c ⁺ CD11 b ⁺ OVA-FITC ⁺ prøver.

5. Repræsentative resultater

De tidspunkter, der kræves for intraperitoneal sensibilisering at inducere luftvejene allergisk inflammation er vigtig og bør udføres som afbildet i figur 1. Efter intraperitoneal sensibilisering og luftvejs OVA udfordring at bekræfte induktion af luftvejs allergisk inflammation, kan nogle musene aflivet, og histologiske analyser kan udføres på lungesnit som vist i figur 2. Tilstedeværelsen af inflammatoriske celler kan bekræftes ved hematoxylin og eosinfarve (figur 2A) og nærvær af slimproduktion kan vurderes ved periodisk syre-Schiff-farvning (fig. 2B). Alt dette vil bekræfte induktion af luftvejene allergisk inflammation efter OVA udfordring OVA-sensibiliserede mus ^8. I modsætning hertil er lungesnit fra saltvandsbehandlede mus forventes at være fri for inflammation sammen med fravær af nogen slimproduktion. Desuden følgende OVA udfordring, pulmonal udviklingslandene unde RGO modning og efterfølgende migration til de drænende lymfeknuder. Analyse af CD11c ^+-celler i de mediastinale lymfeknuder (MLN) fra mus sensibiliseret og udfordret med OVA forventes at udvise en højere andel af CD11c ^+-celler sammenlignet med saltvandsbehandlede mus (figur 3A). Desuden analyse af absolut celletal CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ^+-celler i MLN af OVA-sensibiliserede og udfordret mus, forventes at udvise en signifikant højere (dvs. flere gange højere) tæller at modstykker fra saltvandsbehandlede mus ( Figur 3B).

Figur 1. Eksperimentel protokol for induktion af ovalbumin (OVA) induceret allergisk luftvejsinflammation i mus sammen med luftvejene udfordring med FITC-mærket ovalbumin (OVA-FITC).

fig2.jpg "/>
Figur 2. OVA sensibilisering efterfulgt af OVA i luftvejene udfordring fører til induktion af luftvejs allergisk inflammation, som identificeres ved hematoxylin og eosin-farvning af lungesnit vist i (A) og fører også til slimproduktion i luftvejene, som er identificeret ved periodisk syre Schiff-farvning af lungen sektioner som vist i (B).

Figur 3. OVA-FITC udfordring inducerer DC migration fra lungerne til de mediastinale lymfeknuder (MLN). (A) Flow-cytometriske plots viser andelene af CD11c ^+-celler i MLN kontrol eller OVA-sensibiliserede mus. (B) absolutte tællinger af CD11c ⁺ CD11 b ⁺ OVA-FITC ^+-celler i MLN af saltvand eller OVA-sensibiliserede mus. * P <0,05. Klik her for at se større figur .

Metoden præsenteres her tilbyder en flowcytometri tilgang til analyse pulmonale DCS, baseret på levering af OVA-FITC for luftvejene udfordring. Dette muliggør selektiv kontrol af pulmonære DC'er, som optager OVA-FITC og derfor DC populationer, der overvåges, er effektivt dem, der deltager i luftvejene immunrespons i løbet af OVA-induceret allergisk luftvejsinflammation. I kontrolmus, i fravær af allergisk luftvejsinflammation antallet af migrerende DCS (OVA-FITC + DC'er) er identificeret i MLN indikerer basalrater DC migration, som accelererer reaktion på allergisk luftvejsinflammation resulterer i signifikant stigning i absolut tælling af OVA-FITC + udviklingslandene i MLN. Den beskrevne strategi giver fordel i forhold til traditionelle immunhistokemiske / immunfarvning tilgange, fordi analysen kan udføres i kortere tidsrum og effektiviteten / følsomhed er langt højere. Det er derfor equally vigtigt at sikre, at korrekt kontrol som beskrevet i metoder anvendes i flowcytometrianalyse. En anden parameter, som kan påvirke resultaterne er fremstillingen af ​​en enkelt cellesuspension fra lungen. Derfor må drages omsorg for at undgå væsentlig eksponering af vævet for lys i det kan påvirke fluorescensen af ​​OVA-FITC og det skal også tages under enzymatisk fordøjelse af lungen i over fordøjelse kan føre til spaltning af overflademarkører på celler, der vil påvirke nedstrøms analyse. Alveolære makrofager og DCS deler lignende sæt af overflademarkører, hvilket yderligere komplicerer analysen af pulmonale DC befolkninger ^9. Derfor er det afgørende at lavage lungerne for at fjerne alveolære makrofager, som kan forstyrre DC analyse.

Ud over at analysen af ​​pulmonal DC vandring under allergisk luftvejsinflammation, kan den beskrevne metode kan potentielt modificeres til at vurdere immunrespons på andre entigens, hvorved specifikke antigener kan mærkes med et fluorescerende farvestof og leveres intranasalt. Efterfølgende lignende analyser som beskrevet ovenfor kan udføres for at vurdere pulmonal DC respons. I tilfælde, hvor antigenet ikke kan mærkes, kan få timer før antigen levering, FITC-dextran eller CFSE leveres til mus. Efterfølgende, efter antigen levering, kan analysen udføres for at overvåge migrering af FITC-dextran eller CFSE mærket udviklingslandene til MLN, der angiver de kinetiske forhold pulmonal DC migration efter inokulering med det specifikke antigen ^10,11. I vores tidligere arbejde har vi anvendt denne strategi til at vurdere modning / migration af pulmonære DC'er som reaktion på levering af adenovirusgenterapivektorer ^10. Idet DC'er er fagocytisk, intranasal levering af FITC-dextran resulterer i hurtig optagelse af pulmonære DC'er, som derefter kan overvåges ved hjælp af flowcytometri. I tilfælde, hvor overvågningen af ​​pulmonær plasmacytoid DC'er ønskes, bør CFSE være medarbejYED idet plasmacytoid DC'er ikke optagelsen FITC-dextran så effektivt som andre lungesygdomme DC delmængder ^10.

Alt i alt, den beskrevne strategi giver fordele i forhold til andre traditionelle tilgange til det giver en kvantitativ analyse af pulmonal DC modning / migration i løbet af luftvejene.