Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

1. Sensibilização de camundongos com ovalbumina

1. Preparar uma solução de OVA (grau V; Sigma, MO) em PBS estéril a uma concentração de 1 mg / ml (solução pode ser armazenada a -80 ° C).
2. A fim de preparar OVA Alum-mistura, toma Alum num tubo e adicionar solução de OVA em uma forma gota a gota, enquanto o tubo de vórtice em uma proporção de 1:1. Agita-se a mistura durante 30 minutos e utilizar imediatamente após a mistura.
3. Utilizando uma seringa de 1 ml, 0,2 ml de injectar a mistura em rato cavidade peritoneal e repetir a injecção de novo depois de 2 semanas.

2. Desafio intranasal de camundongos com ovalbumina Identificada FITC

1. 7 dias após a segunda injecção de OVA-Alum, os ratinhos estão prontos para serem desafiados intranasalmente com OVA-FITC.
2. Preparar uma solução de OVA-FITC (Sigma) utilizando PBS estéril a uma concentração de 1 mg / ml e armazenar em alíquotas a -80 ° C.
3. Colocar uma gaze estéril, na parte inferior de um tubo Falcon de 50 ml e em um h químicaood, adicionar 5 ml de Aerrane sobre a gaze. A fim de anestesiar ratinhos, dirigir o animal para dentro do tubo para segundo aproximadamente 5-10.
4. Segurar o animal anestesiado em posição vertical e utilizando pontas de pipeta estéreis, Pipetar 100 da solução de OVA-FITC para as narinas de ratinhos de uma forma gota a gota,.
5. Repita desafio intranasal com OVA-FITC para os próximos dois dias.

3. Preparação de uma única célula Suspensão dos pulmões e os linfonodos de drenagem

1. Sacrificar os ratos usando injeção intraperitoneal de Euthanyl.
2. A fim de reduzir a contaminação de macrófagos, que pode complicar análise DC, lavagem pulmonar é realizada. Para a lavagem dos pulmões, traqueias de rato são brevemente exposta e canulada com um cateter e uma seringa; usando PBS gelado com 5 mM de EDTA, o tracto respiratório inferior é enxaguado 3 vezes para remover as células dos espaços alveolares.
3. Perfundir os pulmões com 10 ml de PBS contendo 10 U / ml heparem através do ventrículo direito do coração, para remover as células de sangue a partir da vasculatura do pulmão. Executar as perfusões até que os pulmões virar branco, indicativo de remoção da maior parte das células do sangue. Isto é especialmente importante para remover as células contaminantes a partir do sangue periférico.
4. Dissecar os pulmões para fora e remover os gânglios linfáticos do mediastino (MLN) e coloque os linfonodos em um prato separado. (Tente minimizar a exposição dos tecidos à luz para evitar extinção de fluorescência FITC).
5. Colocar os pulmões em uma placa de Petri e mediu utilizando uma tesoura. Em seguida digerir os pulmões durante 25 minutos a 37 ° C, utilizando 250 U / ml de colagenase D (Roche) e adicionar EDTA (10 mM de concentração final) para os próximos 5 minutos para parar a actividade da colagenase.
6. Passar os fragmentos digeridos de pulmões através de um filtro de células de 100 um e realizar a lise hipotónico para remover eritrócitos. A suspensão de células única está pronto para posterior análise de DCs.
7. A fim de preparar a suspensão de célula única a partir do MLN, taliviar a MLN utilizando agulhas finas e digerir com colagenase tal como descrito acima, seguido por esforço através de um filtro de célula.

4. A coloração para DC Marcadores para Avaliar a maturação / migração

1. A fim de identificar DCs nos pulmões, a coloração é realizada para CD11c e CD11b. Além disso para avaliar a maturação, a coloração é realizada para CD86 e CD80, que são upregulated como DCS sofrer maturação. ^CD11c + CD11b ⁺ células OVA-FITC ⁺ no MLN são identificados como DCs pulmonares migratórias dos pulmões para o MLN em resposta ao desafio das vias aéreas OVA.
2. Suspender as células a uma concentração de 10 x 10 ⁶ células / ml em tampão FACS (PBS com 1% de FBS e EDTA 1 mM) e uL aliquota de suspensão de células 150 / tubo para a coloração de FACS. Para a identificação dos DCs de pulmão, manchas seguintes são necessários: controle corado (células pulmonares de camundongos não expostos à OVA-FITC), controle de OVA-FITC, controle de CD11c único, controle de CD11b único, CD11b⁺ CD11c ⁺ duplo controlo, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ controle duplo, controle de CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dupla, MHC II único controle, CD86 único controle, CD80 único controle e amostras coradas para OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ^{+ +} MHCII , OVA-FITC ^{+ +} CD11c CD11b ⁺ CD86 ⁺ e OVA-FITC ^{+ +} CD11c CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. Para avaliar a migração DC, realizar a contagem de células absolutos da suspensão de células única a partir de MLN e, subsequentemente, preparar os tubos seguintes: controlo não corado (células MLN de ratinhos não expostos à OVA-FITC), OVA-FITC de controlo, CD11c ⁺ controlo único, CD11b ^{+ de} duplo controlo, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ duplo controle, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ duplo controle e ^CD11c + CD11b ^{+ de} amostras OVA-FITC ^{A +.}

5. Os resultados representativos

Os pontos de tempo necessários para a sensibilização intraperitoneal para induzir a inflamação das vias aéreas alérgica é importante e deve ser realizada como descrito na Figura 1. Após sensibilização intraperitoneal e desafio com OVA das vias aéreas, para confirmar a indução da inflamação das vias aéreas alérgica, alguns ratinhos pode ser sacrificado e as análises histológicas pode ser efectuada nas secções de pulmão como mostrado na Figura 2. Presença de células inflamatórias pode ser confirmada por hematoxilina e eosina (Figura 2A) e presença de produção de muco pode ser avaliada por ácido periódico de Schiff-mancha (Figura 2B). No conjunto, este irá confirmar a indução de inflamação das vias aéreas alérgica após o desafio com OVA de OVA-sensibilizados ratos ^8. Em contraste, as secções de pulmão a partir de ratinhos tratados com solução salina são esperados para estar livre de qualquer inflamação, juntamente com a ausência de qualquer produção de muco. Além disso, o desafio com OVA seguinte, pulmonar DCs unde RGO maturação e posterior migração para os linfonodos de drenagem. Análise de ^CD11c + células dos nodos linfáticos mediastinal (MLN) de ratinhos sensibilizados e desafiados com OVA é esperado para mostrar uma maior proporção de células ^CD11c + em comparação com ratinhos tratados com solução salina (Figura 3A). Além disso, a análise da contagem de células absoluta de CD11c ⁺ CD11b ^{+ de} OVA-FITC ^{+ de} células no MLN de ratinhos OVA-sensibilizadas e desafiados, espera-se que mostram uma significativamente maior (isto é, várias vezes superior) de contagem que os homólogos de salinas ratinhos tratados ( A Figura 3B).

Figura 1. Protocolo experimental para a indução de ovalbumina (OVA) a inflamação das vias aéreas induzida em ratinhos alérgica, juntamente com desafio das vias aéreas com FITC ovalbumina rotulada (OVA-FITC).

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Figura 2. Sensibilização OVA seguido por desafio das vias aéreas OVA conduz a indução de inflamação das vias aéreas alérgica como identificado por hematoxilina e eosina coloração de secções de pulmão mostrados em (A) e conduz também à produção de muco nas vias aéreas tal como identificado por coloração pelo ácido periódico de Schiff de pulmão secções como mostrado em (B).

Figura 3. OVA-FITC desafio induz DC migração dos pulmões para os gânglios linfáticos do mediastino (MLN). (A) parcelas de citometria de fluxo que descreve proporções de ^CD11c + células no MLN de controlo ou de OVA-sensibilizadas ratinhos. (B) As contagens absolutas de ^CD11c + CD11b ⁺ células OVA-FITC ⁺ no MLN de ratos salina ou OVA-sensibilizados. * P <0,05. Clique aqui para ver maior figura .

O método aqui apresentado oferece uma abordagem baseada em citometria de fluxo para análise de DCs pulmonares, com base na entrega de OVA-FITC para o desafio da via aérea. Isto permite a monitorização selectiva de DCs pulmonares, que ocupam OVA-FITC e, portanto, as populações de CC, que são acompanhados são efectivamente as que participam na resposta das vias aéreas imune durante o curso de OVA induzida por inflamação das vias aéreas alérgica. Em ratinhos de controlo, na ausência de inflamação das vias aéreas alérgica, os números de DCs migratórias (OVA-FITC + DCs), identificadas no MLN são indicativos de taxas basais de DC migração, o que acelera em resposta à inflamação alérgica das vias aéreas, resultando em aumento significativo na contagem absoluta de OVA-FITC + DCS no MLN. A estratégia descrita, oferece vantagens sobre os tradicionais imunohistoquímicos / imunocoloração abordagens baseadas porque a análise pode ser realizada em curto período de tempo ea eficiência / sensibilidade é muito maior. Por isso, é e-qually importante para assegurar que os controlos apropriados, conforme descrito nos métodos são empregadas durante a análise de citometria de fluxo. Outro parâmetro que pode afectar os resultados é a preparação de suspensão de células individuais a partir do pulmão. Assim deve ser tomado cuidado para evitar a exposição significativa do tecido à luz por isso pode afectar a fluorescência de OVA-FITC e cuidados também devem ser tomadas durante a digestão enzimática do pulmão para a digestão durante pode levar a clivagem de marcadores de superfície em células, a qual afetará análise a jusante. Macrófagos alveolares e DCs partilhar conjuntos semelhantes de marcadores de superfície, o que complica ainda mais a análise de populações pulmonares DC ^9. Por isso, é crucial para a lavagem dos pulmões para remover os macrófagos alveolares que podem interferir com a análise de DC.

Além da análise da migração DC pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas, a metodologia descrita pode ser potencialmente modificada para avaliar a resposta imune a um outrotigens, segundo o qual antigénios específicos podem ser marcados com um corante fluorescente e entregues por via intranasal. Subsequentemente análises semelhantes, como descrito acima pode ser realizada para avaliar a resposta DC pulmonar. Nos casos em que o antigénio não podem ser rotulados, poucas horas antes da entrega de antigénio, FITC-dextrano ou CFSE podem ser entregues aos ratinhos. Subsequentemente, após a entrega de antigénio, a análise pode ser realizada para monitorar a migração de FITC-dextrano ou CFSE rotulado DCs ao MLN, que irá indicar a cinética da migração DC pulmonar após a inoculação com o antigénio específico ^10,11. Em nosso trabalho anterior, nós empregamos essa estratégia para avaliar a maturação / migração de DCs pulmonares em resposta a entrega de vetores de genes adenovirais terapia ^10. Uma vez que DCs são a entrega, fagocítica intranasal de FITC-dextran resulta em absorção rápida pela DCS pulmonares, que pode então ser monitorizadas por citometria de fluxo. Em casos, quando a monitorização de pulmonar plasmocitóides DCs for desejado, CFSE deve ser employed desde DCs plasmocitóide não fazer captação de FITC-Dextran tão eficiente quanto outros subconjuntos DC pulmonares ^10.

No conjunto, a estratégia descrita oferece vantagens sobre outras abordagens tradicionais para que ele oferece uma análise quantitativa de maturação pulmonar DC / migração durante o curso da inflamação das vias aéreas.