L'analyse de la maturation des cellules dendritiques pulmonaire et de la migration au cours de l'inflammation allergique des voies respiratoires

1. Sensibilisation des souris avec de l'ovalbumine

1. Préparer une solution d'OVA (grade V; Sigma, MO) dans du PBS stérile à une concentration de 1 mg / ml (solution peut être conservée à -80 ° C).
2. Afin de préparer OVA-Alum mélange, prendre alun dans un tube et ajouter la solution d'OVA dans un goutte à goutte tout en vortex le tube à un ratio de 1:1. Remuer le mélange pendant 30 minutes et utiliser tout de suite après le mélange.
3. En utilisant une seringue de 1 ml, injecter 0,2 ml du mélange dans la cavité péritonéale de la souris et répétez l'injection à nouveau au bout de 2 semaines.

2. Défi intranasale de souris avec de l'ovalbumine étiqueté FITC

1. 7 jours après la deuxième injection de OVA-Alum, les souris sont prêts à être contestée par voie intranasale avec OVA-FITC.
2. Préparer une solution d'OVA-FITC (Sigma) à l'aide du PBS stérile à une concentration de 1 mg / ml et conserver en aliquots à -80 ° C.
3. Placez une gaze stérile au fond d'un tube Falcon de 50 ml et dans un h chimiqueood, ajoutez 5 ml de Aerrane sur la gaze. Afin d'anesthésier les souris, diriger l'animal dans le tube pendant quelques secondes environ 5-10.
4. Maintenez l'animal anesthésié dans une position verticale et en utilisant des pointes de pipette stériles, pipette 100 ul de la solution d'OVA-FITC sur les narines de souris dans un mode goutte à goutte.
5. Répétez défi intranasale avec de l'OVA-FITC pour les deux prochains jours.

3. Préparation de la simple cellule de suspension à partir des poumons et les ganglions lymphatiques drainant

1. Sacrifiez les souris en utilisant une injection intrapéritonéale de Euthanyl.
2. Afin de réduire la contamination des macrophages, ce qui peut compliquer l'analyse DC, lavage du poumon est réalisée. Pour un lavage des poumons, trachées de souris sont brièvement exposés et une canule avec un cathéter et d'une seringue; en utilisant PBS glacé avec 5 mM d'EDTA, du tractus respiratoire inférieur est rincé 3 fois pour enlever les cellules à partir des espaces alvéolaires.
3. Perfuser les poumons avec 10 ml de PBS contenant 10 U / ml hepardans le ventricule droit par l'intermédiaire du cœur, pour éliminer les cellules sanguines du système vasculaire des poumons. Effectuez les perfusions jusqu'à ce que les poumons deviennent blancs, indicative de la suppression de la plupart des cellules sanguines. Ceci est particulièrement important pour éliminer les cellules contaminantes du sang périphérique.
4. Disséquer les poumons et enlever les ganglions lymphatiques médiastinaux (MLN) et placez les ganglions lymphatiques dans un plat à part. (Essayez de minimiser l'exposition des tissus à la lumière pour éviter la trempe de FITC fluorescence.)
5. Placez les poumons sur une boîte de Pétri et émincer l'aide de ciseaux. Suivant digérer les poumons pendant 25 minutes à 37 ° C en utilisant 250 U / ml de collagénase D (Roche) et ajouter de l'EDTA (10 mM de concentration finale) pour les 5 prochaines minutes pour arrêter l'activité de la collagénase.
6. Passez les fragments de poumons digérés à travers une passoire 100 um cellulaire et d'effectuer une lyse hypotonique à éliminer les érythrocytes. La suspension cellulaire unique est prêt pour une analyse plus poussée des pays en développement.
7. Afin de préparer la suspension cellulaire unique à partir du MLN, tfaciliter la MLN l'aide d'aiguilles fines et digérer avec de la collagénase comme décrit ci-dessus suivie par la tension à travers un tamis cellulaire.

4. Coloration pour DC Marqueurs pour évaluer la maturation / migration

1. Afin d'identifier les pays en développement dans les poumons, la coloration est effectuée pour CD11c et CD11b. En outre d'évaluer la maturation, la coloration est effectuée pour CD86 et CD80, qui sont régulés à la hausse comme PED subissent une maturation. ^CD11c + CD11b cellules ^{+ +} OVA-FITC dans le MLN sont identifiés comme les PED pulmonaires migrateurs à partir des poumons vers le MLN en réponse au défi des voies respiratoires OVA.
2. Suspendre les cellules à une concentration de 10 x 10 ⁶ cellules / ml dans tampon FACS (PBS avec 1% de FBS et 1 mM EDTA) et aliquote 150 pi de suspension cellulaire / tube pour la coloration FACS. Pour l'identification des pays en développement du poumon, taches suivantes sont nécessaires: le contrôle non marqué (cellules pulmonaires de souris ne sont pas exposés à l'OVA-FITC), OVA-FITC de contrôle, CD11c de contrôle unique, CD11b de contrôle unique, CD11b⁺ CD11c ⁺ double contrôle, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ double contrôle, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ double contrôle, CMH II de contrôle unique, CD86 de contrôle unique, CD80 de contrôle unique et des échantillons colorés pour OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ^{+ +} MHCII , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD86 ⁺ CD11b ⁺ et OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD80 ⁺ CD11b ^+.
3. À évaluer la migration DC, la numération des cellules absolues de la suspension cellulaire unique à partir MLN et ensuite préparer les tubes suivantes: le contrôle non marqué (MLN cellules de souris non exposées à l'OVA-FITC), les OVA-FITC de commande, CD11c ^{+ de} contrôle unique, ^CD11b + double contrôle, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ double contrôle, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ double contrôle et ^CD11c + CD11b échantillons ^{+ +} OVA-FITC.

5. Les résultats représentatifs

Les points dans le temps requis pour la sensibilisation par voie intrapéritonéale à induire une inflammation allergique des voies respiratoires est important et doit être réalisée comme le montre la figure 1. Après une sensibilisation par voie intrapéritonéale et le défi OVA voies respiratoires, afin de confirmer l'induction de l'inflammation des voies allergique, certaines souris peuvent être sacrifiés et les analyses histologiques peuvent être effectués sur les sections du poumon comme le montre la figure 2. Présence de cellules inflammatoires peuvent être confirmés par hématoxyline et éosine (Figure 2A) et la présence de la production de mucus peuvent être évaluées par périodique-acid-Schiff tache (figure 2B). Au total, ce sera de confirmer l'induction de l'inflammation des voies allergique suite à l'OVA défi d'OVA-souris sensibilisées ^8. En revanche, les articles du poumon chez les souris traitées au sérum devraient être libres de toute inflammation ainsi que l'absence de toute la production de mucus. En outre, suivant défi OVA, pulmonaire PED UEDN la maturation et la migration RGO après les ganglions lymphatiques drainant. L'analyse des cellules ^CD11c + dans les ganglions lymphatiques médiastinaux (MLN) à partir de souris sensibilisées et a contesté avec de l'OVA est prévu pour afficher une plus grande proportion de cellules ^CD11c + par rapport à la solution saline souris traitées (figure 3A). En outre, l'analyse de la numération absolue de CD11c ^{+ CD11b} + OVA-FITC ⁺ cellules dans le MLN de souris OVA-sensibilisés et contestée, devrait montrer une significativement plus élevé (c.-à-plusieurs fois supérieures) compte que les homologues de salins les souris traitées ( La figure 3B).

Figure 1. Le protocole expérimental pour l'induction de l'ovalbumine (OVA) induit l'inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris le long des voies aériennes avec le défi avec FITC étiqueté ovalbumine (OVA-FITC).

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Sensibilisation figure 2. OVA suivie par défi voies aériennes OVA conduit à l'induction de voies aériennes inflammation allergique identifiée par coloration d'hématoxyline et éosine de sections du poumon indiqués dans (A) et mène également à la production de mucus dans les voies respiratoires telles qu'identifiées par coloration de Schiff acide périodique des poumons sections comme indiqué dans (B).

Figure 3. OVA-FITC défi induit la migration DC à partir des poumons vers les ganglions lymphatiques médiastinaux (MLN). (A) des parcelles par cytométrie en flux représentant des proportions de cellules ^CD11c + dans le MLN de contrôle ou de l'OVA souris sensibilisées. (B) des valeurs absolues de ^CD11c + + ^{cellules CD11b} + OVA-FITC dans le MLN de souris salines ou OVA-sensibilisés. * P <0,05. Cliquez ici pour agrandir la figure .

La méthode présentée ici propose une approche basée sur la cytométrie de flux pour analyser les PED pulmonaires, basées sur la livraison d'OVA-FITC pour le défi des voies respiratoires. Ceci permet la surveillance sélective des PED pulmonaires, qui prennent OVA-FITC et par conséquent, les populations de DC, qui sont contrôlés sont effectivement ceux qui participent à la réponse immunitaire des voies respiratoires au cours de l'inflammation induite par OVA allergique des voies respiratoires. Chez les souris de contrôle, en l'absence d'inflammation allergique des voies respiratoires, le nombre de pays en développement migrateurs (OVA-FITC + CD) identifiés dans le MLN sont révélateurs de débits de base de DC migration, ce qui accélère en réponse à l'inflammation allergique des voies respiratoires entraînant une augmentation significative de la nombre absolu d'OVA-FITC + DCS dans le MLN. La stratégie décrite, offre un avantage plus traditionnels immunohistochimiques / immunocoloration approches fondées sur l'analyse, car peut être effectuée dans les plus courts en temps et durée de l'efficacité / la sensibilité est beaucoup plus élevé. Par conséquent, il est eQually important de s'assurer que des contrôles appropriés tels que décrits dans les méthodes sont employées lors de l'analyse par cytométrie en flux. Un autre paramètre qui peut affecter les résultats est la préparation de la suspension cellulaire unique à partir du poumon. Ainsi les soins doivent être prises pour éviter une exposition significative du tissu à la lumière, il peut influer sur la fluorescence de OVA-FITC et de soins doivent également être prises lors de la digestion enzymatique du poumon au cours de la digestion peut conduire à un clivage de marqueurs de surface sur les cellules, ce qui aura une incidence sur l'analyse en aval. Les macrophages alvéolaires et les PED partager des ensembles similaires de marqueurs de surface, ce qui complique encore l'analyse des populations de DC pulmonaires ^9. Par conséquent, il est crucial pour un lavage des poumons pour éliminer les macrophages alvéolaires qui peuvent interférer avec l'analyse DC.

En plus de l'analyse des DC migration pulmonaire au cours de l'inflammation allergique des voies respiratoires, la méthodologie décrite peut être éventuellement modifié pour évaluer la réponse immunitaire à d'autres unetigens, dans lequel des antigènes spécifiques peut être marqué avec un colorant fluorescent et livrés par voie intranasale. Par la suite des analyses semblables à celles décrites ci-dessus peuvent être effectuées pour évaluer la réponse pulmonaire DC. Dans les cas où l'antigène ne peut pas être étiquetés, quelques heures avant la livraison antigène, FITC-dextran ou CFSE peuvent être livrés à des souris. Par la suite, après la livraison d'antigène, l'analyse peut être effectuée pour surveiller la migration de FITC-dextran ou CFSE marqué les PED à la MLN, qui indiquera la cinétique de DC migration pulmonaire après l'inoculation avec l'antigène spécifique ^10,11. Dans nos précédents travaux, nous avons utilisé cette stratégie pour évaluer la maturation / migration des pays en développement pulmonaire en réponse à la prestation de adénoviraux vecteurs de thérapie génique ^10. Depuis les PED sont phagocytaire, l'administration intranasale de FITC-Dextran résultats dans l'adoption rapide par les PED pulmonaires, qui peuvent ensuite être suivis par cytométrie de flux. Dans ce cas, où la surveillance des pays en développement pulmonaire plasmacytoïdes est souhaitée, CFSE devrait être employed depuis PED plasmacytoïdes ne absorption FITC-Dextran aussi efficacement que d'autres sous-ensembles DC pulmonaires ^10.

Au total, la stratégie décrite offre des avantages par rapport aux autres approches traditionnelles car il propose une analyse quantitative de la maturation pulmonaire DC / migration au cours de l'inflammation des voies respiratoires.