プラナリアの固定化、部分照射し、組織移植

注：このプロトコルは、潜在的に有害物質の使用（鉛とクロレトン）を示唆している。取得する、読み取り、およびすべての潜在的に有害物質のMSDSに従ってください。

1。動物の文化、選択、および準備

1. 動物の培養と取り扱い利用プラナリアの水（1Xモンジュイック塩^9）とプラスチック製の転送ピペットのために。
2. 通常の培養条件^10の下に、実験室で発生したときに性的なバイオタイプSchmidteaメディを使用することができます。必要なサイズの無性標本を生成するために、S.通常の条件⁹下、室温で提起されたメディは、使用前に1〜2ヶ月は通常の頻度（週に2-3回）トリプルをダブルで供給する必要があります。また、通常の周波数で供給無性生殖動物はそれらの平均サイズを増加させるために、無期限に摂氏10度に保つことができる。
3. 1〜2 cmの間である動物を選択します。長さ2 mmのより広いその後、動物に使用する前に3-7日を飢えさせる。
4. 意図ホスト、ドナー、または部分的に照射された動物の任意の薬理学的または放射線治療を行う場合は、この時点で治療（s）を実行します。
5. 薬理学的治療法が動物の餌を必要とすることが行われた場合、動物に使用する前に、さらに3〜7日を飢えさせる。

2。ソリューションと材料の準備

1. プラナリアの水に0.1から0.2パーセントw / vのクロレトンを溶解し、氷の上でソリューションを冷却することによりクロレトンソリューション、軽度の局所麻酔薬を準備します。
2. 部分照射を行う場合にのみ、2.​​7に進みます。組織移植のために2.3の手順に進みます。
3. ブンゼンバーナーを使用して、90に移植組織を切断するために使用さ0.75ミリメートル内径、および移植片を受け取るホストの穴を作成するために使用さ0.7ミリメートル外径、キャピラリーチューブを曲げる℃で1〜2 cmの角EAの端からchの管。材料を節約するために、それぞれ毛細管の両端を曲げて二つのツールを生成するために半分に分割します。炎管の非常に端をしないように注意してください。
4. 指定されたサイズ以下の用紙をカット。
   • 黒濾紙（長方形約に切る。2.5センチメートル×1.5センチ）
   • ワットマン＃3濾紙（長方形約に切る。2センチメートル×0.5センチ）
   • キムワイプ（折りたたみとワッ約に切る。3センチメートル×0.5㎝×4プライ）
   • たばこ圧延紙（長方形約にガムストリップカットを削除します。3センチメートル×2センチ）
5. 変更されたHoltfreterの溶液（3.5グラム/ LのNaCl、0.2グラム/ L NaHCO _3を 、0.05グラム/ LのKCl、0.2グラム/ L MgSO _4で 、0.1グラム/ LのCaCl _2、pHが7.0から7.5）を準備し、カゼインはHoltfreterのソリューションと寒さの飽和4℃の両方
6. ペルチェクーラープレートまたは解剖顕微鏡下に位置する他の冷却装置でパラと場所の正方形に折りたたまれたキムワイプを添付してください。チルドHoltfとキムワイプを飽和reterのソリューションとキムワイプ上の2つの黒濾紙の長方形を配置します。
7. ワットマン＃2濾紙に沿ったペトリ皿。 Holtfreterの溶液をろ紙を湿らせ、氷上で料理を冷やす。部分的な照射のために大きい皿と濾紙のライナーを使用することができます。

3。麻酔と固定

1. 皿に冷やしたクロレトンソリューションとピペットワームのペトリ皿を記入してください。移植の1つだけのホストと同時に一人のドナーの麻酔。部分的な照射のための多くの（N> 10）動物は、一度に麻酔をすることができます。
2. 彼らが動かないようになるまでのワームはクロレトン溶液に浸漬することができます（5-10分）。
3. チルドHoltfreterの溶液で満たさ皿にそれらをピペッティングすることによりワームをすすいでください。
4. ピンセットで冷やしたHoltfreterのソリューションと東洋それらの腹側を下で飽和させた黒のろ紙上にそれらをピペッティングにより動物を固定する。動物は、LOCにできる場合表参道、過剰Holtfreterのソリューションを浴び、わずかにペルチェまたはコールドプレートの温度を下げる、またはクロレトン治療の長さを増加させる。

4。部分照射

注：部分的な照射のために動物を準備し、次の手順に従います。代わりに移植を行う場合は、セクション5に進みます。

1. トップソースのX線照射装置の内部に収まるようにアイスバケットの氷の上でステップ2.7から冷やしたペトリ皿を置きます。
2. それらが固定化されている黒のろ紙を移動してペトリ皿の中の麻酔動物を配置します。直接麻酔ワームを移動するために鉗子を使用して、それらを傷つけることがあります。
3. トランスポートは、最上位ソースX線照射に動物を配置し、動物に陰極管からの距離は、このように実効線量率を最大化、最小化されているような氷のバケツを置く。
4. 動物と陰極の間に位置トンの鉛シールド（S）（ 図1）UBEは、必要に応じて。シールズは、325kVのX線ビーム¹¹の97から99パーセントの減衰を可能にするために、厚さ4.5〜6ミリメートルでなければなりません。
5. X線線量を提供します。非シールドの領域から完全に幹細胞のアブレーションが必要な場合は、X線照射を使用して、30 Gyの以上を提供します。参考までに、30 Gyのは、320キロボルトと30センチのフィールドからソースへの距離と精度X線株式会社XRAD320 10ミリアンペアで3.6分に相当します。
6. 直ちに投与後黒濾紙、チルドプラナリアの水への転送動物のワームを処理、完了です。プラナリアの水は黒濾紙から自分自身を取り除くために、室温や動物に温めることをお勧めします。部分的な照射の手順はこれで完了です。

5。組織移植

1. ピペットと鉗子を用いて、Peltiに冷却されたキムワイプ上で黒濾紙の独立した四角形の上に麻酔をかけ、ホストとドナーワームを手配するerまたは解剖顕微鏡下でクーラープレート。
2. 0.75ミリメートル、内径キャピラリチューブを使用すると、ドナーからの移植プラグを切り取って、鉗子を使用して、ホストの道の部分のうちの上に置きます。移植材料はキャピラリーチューブにはまり込む場合は、鉗子で取り除く。
3. 0.7ミリメートル外径キャピラリーチューブは、ホストからプラグを取り外して使用して、残された穴に鉗子の位置グラフトを使用します。
4. ステップ2.7に調製したペトリ皿に、その黒濾紙の長方形に移植されたホストに転送します。
5. カゼイン飽和Holtfreterのソリューションを転がり一枚の紙を濡らし、 図2Aに図解として移植されたホストの上に置きます。
6. カゼイン飽和Holtfreterの溶液に、 図2Bに図解として移植されたホスト包むろ紙4枚を浸す。
7. カゼイン飽和Holtfreterの溶液中でカットキムワイプの4ワッドを浸し、それを上に置くステップ5.6ろ紙（ 図2B）。蓋を交換し、氷の上にペトリ皿を置く。
8. 癒す、回復するためにプラナリア水にドナーワームを転送し、再生成します。
9. すべての移植が完了したら、一晩10℃のインキュベーターに移植されたワームを配置します。
10. 次の朝、移植を乱すワームを発見し、プラナリアの水で満たされたペトリ皿に（その黒濾紙上）それを転送しないように注意しながら。
11. どちらのワームは、ろ紙から自分自身を取り除くか、静かにピンセットでそれを削除することができます。
12. 2〜3日ごとに一度プラナリア水を変更します。

6。代表的な結果

すぐに部分的な照射プラナリアの後は、通常の影響を受けないと表示されます。線量および使用シールドのジオメトリに応じて、照射された組織が ​​退縮し、さらに^7を分解することができます。シールドされた組織はそのまま維持する必要があります。 Follにより組織の回帰と組織の整合性の損失は、芽が形成され、不足している構造（ 図3A）再生成されます。切断が部分的に照射領域で行われている場合は、照射組織（ 図3B）（すなわち、回帰または崩壊防止）救出されます。切断された非照射プラナリア（ 図3C）と比較して、両方に無傷と切断された場合、再生が遅れます。 30 GyのX線線量が配信された、部分的に照射された動物が無傷されている場合は、使用される鉛シールドに対応するパターンで成功した幹細胞のアブレーションは、幹細胞のためのin situハイブリダイゼーションによる部分照射後2〜3日を確認することができるマーカーSMED-PIWI-1 ^12（別名smedwi-1）（ 図4）。

移植、移植組織の成功した移植片は、次の朝は明白ワットでなければなりませんホスト（ 図5A）の背腹両面に付着した、ホスト組織をithin。時折、移植だけで腹側または背側表面に付着します。移植は完全に失敗した場合、移植の兆候は、ホスト（ 図5B）のいずれかの背側または腹側表面から見えなくなります。まもなくSMED-PIWI-1（ 図5C主に移植内で幹細胞が存在することを明らかにするためのin situハイブリダイゼーション致死照射^13,14によって、幹細胞のアブレーションされたホストに非照射組織の成功した移植後の。）さらに、致死的に照射されたホストへの非照射組織の成功した移植片は宿主組織とホスト¹⁵の長期生存の救助になります。

図1。基本的なコンポーネントの一般的な配置部分的な照射のためのsは、トップに配置X線源（陰極管）とX線照射では、麻酔プラナリアは、照射野内で直接X線源の下に配置されています。 X線の線量率を最大にするために、プラナリアとX線源との間の距離は最小限に抑える必要があります。鉛遮蔽体は、実用としてワームの近くに、冷陰極管と麻酔ワームの間に配置する必要があります。鉛シールドは、設計、製造、およびそれを盾所望の組織が完全にワームの残りの部分を公開するように配置する必要があります。多くの商業的製造には、シンプルなデザイン·ダイアグラムからカスタム鉛シールドを生成します。我々は正常にAlphaシステム株式会社（Bluffdale、UT）を使用しています。リード線はシールドの所望の量を可能にするために十分な厚さでなければなりません。 320 kVのX線ビームの遮蔽を完全に近い所望される場合、例えば、鉛は厚さ4.5〜6ミリメートルでなければなりません。プラナリアとシールドに配置されていますHoltfreterの浸したろ紙は、氷のバケツにかかっているペトリ皿に並んでいた。十分な大きさのX線照射野と同じ鉛シールドの数を考えると、多くの標本は、部分的に1時間（図示せず）に照射されることがあります。

図2。回復室を構築しています。組織移植の回復室（A）分解図、カゼイン飽和Holtfreterの溶液に浸漬された後に互いの上に積層されているすべてのコンポーネントを示している。 （B）はほぼ完成し、回復室、治癒時の動きを防止するため麻酔プラナリア包むぴったり、ワットマン＃3濾紙の長方形の連動配置を示す。回復室の慎重な構造が迅速な治癒や組織の移植のより大きな効果を促進し、動物の動きや乾燥を防ぎます。

図3。シンプルな後部部分照射の代表的な成果。デュボア^7に記載されているように、（A）プラナリアの後部半分が鉛でシールドして、X線照射に前方の組織を暴露された照射とシールドの間の境界に戻って退縮が観察された組織その時点で無着色blastemasが形成され、動物が生成し始めた。 （B）一方、動物は（）で行われた同じ部分照射後に断頭したときに、組織の退縮は認められなかったし、残りの照射前組織が救助された。部分的に照射した動物は（B）の頭を再生し斬首斬首された非照射コントロール（C）と比較して、しかし、再生が大幅に遅れた。

図4。代表outco部分照射は、次の部分幹細胞アブレーションの私。ホールマウントin situハイブリダイゼーション （ウィッシュ）幹細胞のマーカーSMED-PIWI-1は、野生型のプラナリアは、前方の組織を除いて自分の体全体に分散した幹細胞を持って明らかにする光受容体（矢印）と適切な咽頭（アスタリスク^）14。 （A）照射が完全にシールドされたコントロールでSMED-PIWI-1を望むプラナリアは、照射後3日は、野生型プラナリアのものから区別がつかない幹細胞の分布を示しています修正しました。 （B）一方、前部と後部に露出したまま、部分的にしかシールドされた動物のSMED-PIWI-1を願うだけでなく、幹細胞は、非シールドの領域からアブレーションされていることを照射ショー後3日修正されました。スケールバーは500ミクロンです。

図5。エクサ成功および失敗した組織移植のmples。（）が正常に移植プラナリアの背腹ビュー移植後3日のライブ映像。移植は、（示されています）背腹両面にはっきりと表示され、移植片 - 宿主の界面での特性無着色組織で囲まれています。 （B）に対応して、失敗した移植は、移植部位（表示）で表示可能な移植組織を表示しない代わりに、失敗した移植から治癒、無着色、横方向の傷を示しています。 （B）他から見て背側または腹面のみに付着した一方の側から見たときに成功した移植（）似ている移植片と移植失敗した。 （C）野生型（wt）組織が ​​常駐し、幹細胞、移植幹細胞のアブレーションされた照射宿主に移植された場合、後で移植後SMED-PIWI-1の 2日間WISHによって明らかにされている移植の成功は、明確にのみ移植場所や周りの幹細胞（矢頭）の具体的な存在で表示されます。スケールバーは500ミクロンです。

固定化の重要性

固定化ははるかにこれらのプロセスのいずれかが正常に完了するための最も重要なステップです。プラナリアが不適切な部分照射の前に固定化されている場合、それらは矛盾した交絡結果を生成し、鉛シールドの下に移動する可能性があります。動物が不十分移植後の固定化している場合はさらに、ホストのワームは、おそらくホストに適切に癒すために移植の失敗、その結果、移植組織から離れて移動します。適切な固定化はクロレトン治療とプラナリアの残りのろ紙の温度と水分の濃度または長さを調整することによって達成されます。 1時間半までの0.2パーセントでクロレトン治療は毒性であることが表示されません、しかし、その長さの治療は咽頭の放出を誘発する可能性があります。プラナリアは、この時間の長さの間にはまだ、部分的な照射の影響を受けやすいままになります。私たちの経験があることを示している乾燥しすぎや動物が乾燥するでしょう。あまりにもウェットと動物が簡単に移動 - 水分ではなく、クロレトンの治療よりも、最も重要な要因である。すべてのケースで濾紙が完全ではなく、コンテナ内または表面上に立って水を作成するためのポイントに飽和する必要があります。余分な液体をペトリ皿から動揺することができます。ろ紙を飽和するために使用される液体の量は、特定の環境湿度に応じて調整する必要は間違いないでしょう。

移植の速度

速度は部分的な照射と移植の両方の効果を向上させる上で不可欠である。もはや部分的に照射した動物は、どの特定のアッセイの結果を歪曲かもしれ損傷の大きなチャンスや組織の整合性で骨盤を固定しています。移植が予め形成される速度は、おおよそ成功したグラフト率と相関しています。移植を受信するホストの穴は空のままにされている場合あまりにも長い間、負傷した腹側と背側表面はこうして失敗した移植の結果、お互いにではなく、移植組織の治癒が開始されます。我々の手では、移植プラグはたまにしか毛細管で提出となります。それらの場面で、プラグは通常、微細な鉗子、あるいは口の中でキャピラリーチューブを通して空気を強制することにより、迅速に外れることができます。一度一つは移植手順を練習し、多くの移植した動物を生産するために必要な時間が大幅に前の組を移植しながら、次のドナーとホストのペアを麻酔によって減少することができますになります。同時に麻酔、移植を行うことにより、それぞれ移植した動物を生成するために必要な実際の時間はわずか5分にドロップすることができます。

部分照射と移植の多様性

麻酔と部分照射の条​​件は、特定の実験environmeに応じて最適化されたらNTおよび使用可能なX線照射は、部分的な照射技術を用いて行うことができます別の実験の数が大きくなる。高度なリード加工技術は、多くの生物学的複製するの迅速な作成を可能にして、特定の臓器や組織だけでなく、同​​一のシールド、多数の製造をターゲットにすることができ、複雑な照射シールドのみならず生産が可能になります。今後の調査では、間違いなく、ローカライズされた幹細胞のアブレーションとプラナリアのさまざまな部分に存在する幹細胞集団の機能的な違いをin vivoでの細胞応答でテストするには、この方法を活用しています。それは興味のある科学的な問題に関係して部分照射の汎用性は、唯一の電流リード加工技術と、自分の想像力によって制限されます。したがって、部分的な照射技術の真の力は、まさに、ほぼすべての異なった位置付けを保護し、除去する能力にあるのかもしれない幹細胞の集団。

移植にも幹細胞の亜集団の分離を可能にする一方、この技術のより重要な利点は、差動ホストまたは移植前にドナーを治療する能力である。薬物またはRNA干渉を使用してホストまたはドナーの治療は、移植細胞が治療の環境で動作しますか、未処理の環境でどのように処理した細胞どのように動作するか未処理の調査のためにできるようになります。実験でこれらのタイプは確かに細胞機能を食い止めるために、自律および非自律的な分子の貢献を離れていじめるのに役立ちます。

プラナリアにおける古典的な移植実験は既に^5,6を示し^ているようにさらに、組織移植、再生中に別の組織の誘導可能性を探索するのに理想的なテクニックです。プラナリアの研究は分子の時代に入ると、我々は、IMPの非常に特定のローカライズされた表現を明らかにし始めている直接再生^16を制御ortantシグナル伝達分子。再生中に異所に、これらのシグナル伝達分子を含む移植組織は、優れた再生構造の形態形成を誘導における役割を理解するために私たちを助けることができます。

他の技術上の部分照射と組織移植の利点

お互いに比較した場合、部分的な照射と組織移植が持っている固有の特定の強みに加えて、彼らはまた、プラナリアの再生分野で使用される他の技術上の特定の利点を提供しています。我々は致死照射プラナリア幹細胞をどのように影響するかを知らないので、例えば、低線量照射は、しかしそうでなければ、幹細胞を欠いてホスト^4,17内で幹細胞の少数を分離する方法として利用されている、我々は確認することはできませんこれらの実験で観察された携帯電話の動作が特徴的に正常であること。放射線被ばくは、適切な厚さの鉛で99％以上、簡単に減衰させることができるので、低線量照射のこの警告は、部分照射での懸念が少ないです。幹細胞の小集団がこれまでに放射線に移植された細胞をさらすことなく幹細胞を欠いてホスト内で単離することができるので、さらに、移植は完全にこの警告を回避することができます。低線量照射を生き残った細胞が動物全体にランダムに配置されているのに対し、さらに、健康な幹細胞の正確な位置は、知られており、部分的な照射と移植の両方で制御することができます。単一細胞移植は、エレガントなシングルプラナリア幹細胞の⁴のポテンシャルの高さを実証したのに対し、それはより速く、より面倒であるので、最後に組織移植も同様に強力な技術を証明することができ、細胞の数の機能や動作を同時に観察することができます各ホストインチ細胞の小集団の分析対単一のセルだけではなく、データのより効率的な収集を可能にしますが、それはまた、単一細胞移植アッセイで見逃される細胞間相互作用を明らかにすることができます。

結論

部分的な照射と組織移植は、古い技術が、プラナリア幹細胞の機能と同様に再生の基礎となる一般的な分子メカニズムを解剖において重要な役割を果たすことになります。現代的な機能アッセイおよび分子技術の統合を可能にしながら、これらの古典的な技術の近代化は、高いスループットと一貫性をもたらしています。一度プラナリア再生の主要な問題を概説するために使用されたこれらの古典的な技法は、現在これらの質問に対する答えを発見するため、さらに幹細胞生物学の我々の理解するために使用することができます。