בסיסי

Montserrat Porta-de-la-Riva^1,2, Laura Fontrodona¹, Alberto Villanueva^1,2, Julián Cerón^1,2

¹Department of Cancer and Human Molecular Genetics, Bellvitge Institute for Biomedical Research, ²C. elegans Core Facility, Bellvitge Institute for Biomedical Research

1. פרוטוקול: תולעים culturing עבור הלבנה ¹¹

אוכלוסיות גדולות של C. elegans ניתן להשיג על ידי culturing אותם גם בתקשורת נוזליים או מוצקים התקשורת צלחות. הם גדלים בדרך כלל עם א 'על NGM מוצק (צמיחה Media נמטודות) והאכילה קולי חיידקים, אשר מתווסף לוחות אם חיים או מתים (נהרג על ידי UV ^{12, 13} על ידי חום או קור ^14). ההליך הנפוץ ביותר עושה שימוש בשידור חי OP50 א ' coli, שהוא פגום בסינתזה של אורציל ולא יכול לגדול יותר אל תוך שכבה עבה כי היה לטשטש את התולעים.

1. מערבבים 3 גרם של NaCl, 17 גרם של אגר ו -2.5 גרם של peptone ולהוסיף 975 מ"ל של H ₂ O. החיטוי דקות 50.
2. לצנן את הבקבוק עד 55 ° C.
3. הוסף 1 מ"ל של 1 מ 'CaCl _2, 1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול באתנול, 1 מ"ל של 1 M MgSO ₄ ו - 25 מ"ל של 1 חיץ M ₄ KPO (כולם אבל הכולסטרול בעבר autoclavאד).
4. באמצעות נהלים סטריליים לוותר פתרון NGM לתוך צלחות פטרי, למלא צלחות עד 2/3 של עוצמת הקול שלהם.
5. לאחר יבש, מומלץ לעזוב את לוחות בטמפרטורת החדר למשך 2-3 ימים לפני השימוש לאיתור מזהמים. הכן פס OP50 א ' coli מהמלאי גליצרול (OP50 ניתן לקבל גנטיקה Caenorhabditis מרכז).
6. פיק למושבה אחת ולגדול אותו LB לילה ב 37 ° C בהתרגשות.
7. אפשר עודף הלחות להתאדות מן הצלחות על ידי הסרת מכסה בזרימה למינרית ולהוסיף OP50 למרכז הצלחות עם סטרילית פיפטה פסטר.
8. אפשר א OP50 הדשא coli לגדול בין לילה בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות.
9. מוסיפים את הסכום הרצוי של תולעים ללוחות (אם מודגרות על 37 מעלות צלזיוס צלחות צריך להיות מקורר בטמפרטורה של חדר לפני השימוש).

טיפים:

• לשפוך את אותה כמות של התקשורתאת הצלחות עם טפטפת או מנפק המשאבה מבטיחה באותו נפח של אגר ללוחות ומקל על העברת צלחת ללא צורך למקד מחדש סטראו.
• צלחות (הן seeded ו unseeded עם חיידקים) ניתן להשתמש מספר שבועות לאחר מוכנים כאשר הם מאוחסנים במיכל בטמפרטורת החדר או 4 ° C.
• הימנע ציפוי חיידקים לקצה הצלחת. אם הדשא משתרע על שולי הצלחת התולעים יכול לסרוק את הצדדים, להתייבש ולמות.
• התולעים לחיות זמן רב יותר אם החיידקים שנזרעו על הצלחות הם כבר מת ^15.

2. פרוטוקול ב ': טיפול באמצעות פתרון hypochlorite בסיסי ("הלבנה") ¹¹

הטכניקה הלבנת משמש לסינכרון ג elegans תרבויות בשלב הזחל 1 (L1). העיקרון של השיטה הוא בכך כי תולעים רגישים אקונומיקה תוך מעטפת הביצית מגן על דוארmbryos ממנו. לאחר הטיפול עם פתרון hypochlorite בסיסי, עוברים מודגרת בתקשורת נוזלי ללא מזון, המאפשר הבקיעה אבל מונע התפתחות נוספת.

1. תולעים אפשר לגדול עד לשלב הבוגר.
2. שחזור מבוגרים הרה להולדת ב -15 צינורות מ"ל ידי שטיפת צלחות עם חיץ M9.
3. גלולה תולעים על ידי צנטריפוגה במשך 2 דקות על 400xg (~ 1500 סל"ד על צנטריפוגות שולחן רגיל) בטמפרטורת חדר וזורקים supernatant.
4. ביצוע שוטף 1-3 עד למאגר מופיע ברורה של חיידקים.
5. מוסיפים את פתרון הלבנת הרצוי (טבלה I) ו להתסיס כמה דקות (הרס רקמת הבוגרת יש לעקוב תחת מיקרוסקופ לנתח והתגובה הפסיק כאשר עקבות של המבוגרים עדיין נראה לעין, אשר נמשכת בדרך כלל בין 3 ל 9 דקות תלוי כמה בעיות, כגון נפח של התולעת גלולה, ציין בדיון) (איור 3).
6. עצור תגובה על ידי הוספת M9 buffeR כדי למלא את הצינור.
7. מהר סרכזת (מאז הטיפול עשוי עדיין להיות פעיל) למשך דקה 1 ב XG 400 וזורקים supernatant.
8. לשטוף גלולה שלוש פעמים נוספות על ידי מילוי צינור עם חיץ M9.
9. הוסף 1 מ"ל של חיץ M9 כדי גלולה, או למקם את הביצים צלחות NGM unseeded, ו דגירה בטמפרטורה הרצויה עם תסיסה עדינה. אוורור נאות יש לספק (איור 4).

טיפים:

• ישנם פתרונות הלבנת שונים, בחר אחד שפועל טוב יותר בידיים שלך (טבלה 1, איור. 1).
• ביצים כבר על הצלחות יכול לשחזר מבטל את פני השטח של אגר עם חומר רך כמו פיסת סרט צילום רנטגן.
• שרידים רבים של בעלי חיים מבוגרים מדי עלול לפגום הסנכרון כפי שהם מהווים אספקת מזון הזחלים בקעו לאחרונה.
• טמפרטורות גבוהות מעט להאיץ את הפיתוח שהוא לא נוח ליF כל מדלג תולעת סינכרון כי ההבדל בהתפתחות בין תולעים מסונכרנים מסונכרנת תהיה גדולה יותר בטמפרטורות גבוהות.
• פתרון הלבנת יש לבצע רק לפני השימוש בו. בנוסף, אקונומיקה מאבד עוצמה אחרי שהוא היה פתוח במשך זמן מה, בין השאר בשל רגישות שלו. אנו ממליצים aliquot כל בקבוק חדש לתוך בקבוקים קטנים ענבר למנוע אובדן כזה לצמצם את החשיפה לאור.

3. פרוטוקול C: ציפוי תולעת

1. המתן בין 12 ל 24 שעות (זמן כדי להשלים ההתפתחות העוברית תלויה בטמפרטורה) לאחר הלבנת בוצעה ולשחזר תולעים על ידי צנטריפוגה (2 דקות XG 400).
2. מחק supernatant, תולעים זרע על צלחות הנדרשים ולתת לנוזל שנותר יבש.
3. מניחים צלחות בטמפרטורה הנדרשת.

טיפים:

• הזחלים L1 ב M9 חיץ אפשר לשמור על 15 מעלות צלזיוס נדנדה לפחות למשך שבוע, Without שינויים ברורים.
• להיזהר בעת חישוב התולעים אתה זרע כי רבים מדי עלול להתיש את המזון מהר יותר מהצפוי להרוס את הניסוי. כ 500 L1 יכול להגיע לבגרות בצלחת 55 מ"מ ללא ואוזל של מזון.

4. פרוטוקול D: ג elegans תצפית

D.1 Nomarski תצפית

הפרעות ההפרש מיקרוסקופיה לעומת זאת הוא מיקרוסקופיה אופטית תאורה טכניקה המשמשת כדי לשפר את החדות בדגימות בלא כתם שקוף. Nomarski המילה מתייחסת פריזמה בשימוש, על שם הממציא שלו. על ידי התבוננות בבעלי חיים בעודם בחיים אנו יכולים לבחון את הפיזיולוגיה של החיה עם שינויים ספורים הנגזרות immobilization. בנוסף, לא מקבע הוא הוסיף, סמנים ניאון ניתן לראות in vivo. עובדה זו וכן את האפשרות של סמנים פיוזינג ניאון לגן עניין לעשות את זה אפשרי לעקוב אחר תהליכים Which חלבון המחקר עשויים להיות מעורבים. באמצעות הטכניקה המתוארת פרוטוקול זה, לא רק תולעים חיות ניתן לראות, אבל הם יכולים גם להיות התאושש מצופה שוב.

משטח הכנה אגר (לפני השימוש):

1. הכן agarose 2% במים וממיסים. שמור נמס ב 65 ° C.
2. מניחים שתי שקופיות עם חתיכת סרט על אותם שני הצדדים של השקופית, 3 נקי.
3. באמצעות מקום פיפטה פסטר ירידה של אגר על משטח נקי.
4. מכסים את אגר עם שקופית אחר נקי מונח על גבי שלוש שקופיות בניצב.
5. לחץ בעדינות כדי ירידה אגר הוא שטוח בעובי של מפרידי הקלטת.
6. לאחר אגר מתמצק, בעדינות לשלוף את השקופיות מוקלטות ולהפריד את שתי שקופיות הנותרים על ידי הזזה 1 ביחס אחר.

הרכבה בעלי חיים

7. מקום אחד ירידה (10 μl) levamisole של 1 מ"מ או נתרן אזיד 10-30 mM על tהוא מרכז השיגור.
8. להעביר את בעלי החיים אל תוך ירידה באמצעות הבחירה תולעת.
9. בעדינות להניח coverslip על בעלי החיים ולתקן אותה בשני הצדדים עם כמה הלק או סיליקון.

טיפים:

• שמור aliquots של 2% agarose ב 4 ° C.
• Agarose מומסת אפשר לשמור על 65 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות.
• הערה: Levamisole הוא אגוניסט קולטן ניקוטינית אשר מעוררת שיתוק שרירים ספסטית ^16.
• היה זהיר, אזיד הנתרן הוא רעיל ביותר!

D.2 אתנול קיבעון ו מכתים DAPI

פרוטוקול המתוארת כאן מהווה דרך מהירה צביעה של תולעים עם DAPI, לעומת זאת בגלל dissecation של התולעת מבנים מסוימים עשויים להציג כמה שינוי. ישנן שיטות אחרות כדי לתקן תולעים קודמים מכתים DAPI כגון קיבוע עם הפתרון של Carnoy או פורמלדהיד, כי טוב יותר לשמר את היושרה של תולעת ¹⁷.

קיבעון אתנול (שונה מ ¹⁸⁾

1. מקום ~ 10 μl של M9 חיץ (או מים) על המיקרוסקופ שקופית.
2. באמצעות תולעת ולבחור בזהירות להעביר 10-25 תולעים לירידה.
3. באמצעות נייר פילטר או מיקרו פיפטה להסיר כמה שיותר חיץ M9 ככל האפשר מבלי להסיר את התולעים או לתת להם יבש.
4. הוסף ~ 10 μl של אתנול 90% ולתת לו להתייבש.
5. חזור על שלב 4 פעם או פעמיים.

4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מכתים

6. מערבבים DAPI עם התקשורת הרכבה הרצוי הריכוז הסופי של ng 2 / μl.
7. לאחר אתנול התאדו לגמרי, להוסיף 7 μl של DAPI: הרכבה תערובת התקשורת.
8. מניחים coverslip ולתקן אותה על שני הצדדים עם כמה הלק או סיליקון. שקופיות יהיה מוכן דקות התצפית כ 5 לאחר תוספת של DAPI.

טיפים:

• הרכבה מדIA מכיל גליצרול, כך כמות קטנה מספיקה כדי לכסות את כל ההכנות.
• קיים מגוון רחב של אמצעי תקשורת גובר מסחריות (Fluoromount או להאריך, למשל), איכות ומחיר תלוי כמה זמן אתה רוצה לאחסן המדגם שלך.
• תיזהר, הוא DAPI mutagen ידוע אשר נקשר חזק על אזורים עשירים ב-DNA.

מתכונים

צמיחה נמטודות בינוני (NGM)

1.7% (W / V) אגר
50 mM NaCl
0.25% (w / v) Peptone
1 mM CaCl ₂
5 מיקרוגרם / מ"ל ​​כולסטרול
25 מ"מ KPO ₄
1 mM MgSO ₄

M9 חיץ

22 מ"מ KH ₂ PO ₄
42 mM Na ₂ HPO ₄
86 mM NaCl
1 mM MgSO ₄

פתרונות הלבנה בדקה

לוח ט מתכונים שונים פתרון הלבנת נבדק לכתבה. המתכונים # 3 ו # 4 הם 2x, ויש להוסיף נפח זהה של M9. מתכונים # 1, # 2 ו # 5 דווחו בעבר ^{2, 11, 19.} הריכוזים האחרונים: # 1 NaOH 0.25M, ~~~V NaOCl 0.8% , # 2 NaOH 0.5m, NaOCl ~ 0.8%, # 3 0.625M NaOH, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1.6%, # 5 NaOH 0.5m, NaOCl ~ 0.8%.

5. נציג תוצאות

באיור 1. השוואה בין חמישה פתרונות הלבנת שונים בו פעמיים דגירה שונים. תולעים N2 נשטף פעמיים עם M9 חולקו חמישה צינורות חרוטי 15 מ"ל המכילים כל פתרון הלבנה. צינורות הזדעזעו במרץ 1 מ"ל להעביר צינור חדש עם M9 לעצור את התגובה לאחר זמן מוגדר. לאחר הליך הלבנת תולעים היו מודגרות עם 1 מ"ל של M9 על 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. בכל מקרה, התמונה התחתונה צולמה מיד לאחר הלבנה, התמונה העליונה 24 שעות מאוחר יותר.

_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" איור 2 "/>
איור 2. טמפרטורה של תמיסת הלבנה משפיע על היעילות של הטיפול. כמויות שוות של תולעים N2 היו מולבן עם פתרון הלבנת אותו או קר בעבר במשך 20 דקות על קרח או כל הזמן על 25 מעלות צלזיוס במשך זמן זהה. שני טורים על הצג תמונות השמאל רק לאחר הלבנה. לאחר טיפול תולעים היו מודגרות ב -15 צינורות חרוטי מ"ל עם 1 מ"ל של M9 על 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. עמודות על תמונות תצוגה הנכונים 24 שעות לאחר מכן.

איור 3. תולעת יחס גלולה: זמן הדגירה hypochlorite בסיסי משפיע על היעילות של טיפול 50, 100, 250 ו - 500 μl של התולעת גלולה היו מודגרות עם 2 מ"ל של הלבנת פתרון # 3 דקות 3, 6 ו -9.. בקעו, L1 עוברים מתים ושרידי שברי מבוגרים היו לכמת לאחר הדגירה על 20 מעלות צלזיוס למשך 2 4 שעות ב -15 צינורות חרוטי מ"ל עם 1 מ"ל של חיץ M9. כשלושה confluent 55 מ"מ צלחות עם תולעים בוגרות יש צורך לקבל 100 התולעת גלולה μl.

באיור 4. אוורור נאות נדרש הבקיעה ההישרדות של C. elegans עוברים. 100 גלולה μl של תולעים N2 היו מולבן במשך 6 דקות ו מודגרות ב -15 צינורות חרוטי מ"ל עם מ"ל 1, 5 או 10, כפי שצוין, של M9 על 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. החלק העליון של הדמות ומציג תמונות של התרבויות לאחר 24 שעות, כאשר החצים מצביעים על ביצים לא בוקעות. בתחתית, יש גרף המתאר את כמות הזחלים (אפור בהיר) ואת העוברים המתים (אפור כהה) 48 שעות לאחר הלבנת על התנאים האמורים.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "alt =" איור 5 "/>
איור 5. מחזור החיים של ג elegans. . אורך משוער של התולעים בשלבים שונים. שעות שנדרש כדי להתחבר כל שלב תלוי בטמפרטורה (שונה מ ^20). ב. Nomarski (למעלה) ו DAPI (למטה) תמונות של תולעים שונים בשלבים התפתחותיים הצביע. התכונות המשמעותיות ביותר בשלב זה הם הגדילו L1: החץ מצביע על סימנים מקדימים של בלוטת המין סומטי לבין הקו נבט מוקדם L4: החץ השחור (Nomarski) מציין את הפות פיתוח, חצים לבנים (DAPI) מצביעים על שתי זרועות האשכים אמצע... מאוחר L4: החץ מצביע על הפות פיתוח בשלב חג המולד שנקרא עץ צעירים למבוגרים. החץ השחור מצביע על העובר בתוך הרחם, ראש חץ מצביע אל spermatheca, לבן החץ מצביע על הביצית הרה להולדת מבוגר:. ראש חץ (DAPI) מציין עוברים מופרים. החץ מצביע על תמונה DAPI spermatheca.

איור 6. הפות מורפולוגיה ב L3, L4 ו בשלבים למבוגרים. בשלב L3 רק לומן קטן שבו הפות נוצר ניתן לראות. ב L4, לומן זה מרחיב ויצרו את מה שנקרא "עץ חג המולד". אצל אדם מבוגר הפות כבר סגור. הקווים הצהובים מציינים את המיקום של הפות על שלושת השלבים.

איור 7. מכתים DAPI ב L3, L4 מוקדם, בשלבים המאוחרים L4 ו - למבוגרים בלבד. ב L3, קו נבט הוא מוארך. ב L4, זרועות בלוטת המין מורפולוגיה כיום U-צורה. על הזרע מאוחר L4 שלב ניתן לצפות בחלק הדיסטלי של בלוטת המין. צעירים להציג ביציות. קו נבט למבוגרים מציגה ביציות ועוברים. קווי זהב delimitate קווי נבט בבית הבשלבים שונים אלקטרוני כאמור.

איור 8. ג פיתוח elegans ב 15 ו 25 ° תולעים ג N2 היו מולבן, מודגרות לילה M9 והסתה על 15 מעלות צלזיוס, הועבר הצלחות גדל הפעמים הצביע על טמפרטורות המוצהרות.

נמטודות סנכרון

פתרונות הלבנת מספר תוארו. ניסינו חמישה מתכונים שונים (טבלה I) ו, בידינו, הם לא הראו הבדלים משמעותיים הסנכרון של אוכלוסיות תולעת (איור 1). עם זאת, בניסויים שלנו לא מראים פרמטרים כגון טמפרטורה (איור 2), הפתרון יחס הלבנת: נפח של תולעים (איור 3) וכן את נפח M9 עם שבו עוברים מודגרת של הבקיעה (איור 4) עושים משפיע ההישרדות של תולעים, בהיותו קשור אוורור תקין של תרבות. בתנאים שלנו רועדות, בעוד שפופרת של 15 מ"ל בנפח של 1 מ"ל מאפשר הישרדות של תולעים כל, בנפח של 5 מ"ל כבר יותר מדי על מנת לאפשר בקיעה ביצים נאות דומה לנפח מרבי של 15 מ"ל (לא מוצג) .

סי אלגנס פיתוח

במהלך הפיתוח שלה, (איור 5) לפני לשלב הבוגר. קו נבט הוא אינדיקטור טוב של השלב ההתפתחותי של C. elegans. התכונה הקלה ביותר של ג elegans פיתוח ניתן לראות תחת Nomarski אופטיקה הוא פיתוח של הפות, אשר מתחיל להיווצר בשלב מוקדם L4. בהתחלה, רק לומן קטן הוא ציין, שאחר כך מתרחב שנקרא הצורה "עץ חג המולד", על ידי L4 באמצע מאוחר. בסופו של דבר, עד סוף שנת L4 הפות סוגר (איור 6). מצד שני, מכתים DAPI מאפשר התבוננות בהתפתחות בלוטת המין. מתוך ארבעת התאים L1 כדי בלוטת המין חלוקת תאים מתארך ב L2 ו L3. ב L3 התאים קצה דיסטלי ניתן לראות, החל להעביר dorsally. גם המיוזה מתחילה עד סוף L3. על קצה דיסטלי L4 תאים להגיע מעמדה הסופי שלהם בתאי הנבט לבדל את הזרע. עד סוף שנת הייצור L4 הזרע מסתיים וייצור הביצית מתחיל. ב adulטי עוברי תולעים ניתן לראות בתוך הרחם (איור 7).

פיתוח טמפרטורה

סי אלגנס מתפתח בקצב שונה בהתאם לטמפרטורה: אמנם זה לוקח בערך 90 שעות מרגע הטלת הביצה ועד תולעת חדש מתחיל להטיל ביצים שלה ב 15 מעלות צלזיוס, 45 שעות זה מספיק כאשר גדל במהירות של 25 ° C (איור 6). המחקר של שיעור ההפרש פיתוח בטמפרטורות שונות מוביל גמישות יחסית בהקמת תנאי וביצוע ניסויים. בנוסף, היא מציעה את האפשרות לא רק לעקוב אחר ההשפעות של טיפול מסוים או שינוי (לדוגמה אללים רגישים לטמפרטורה), אלא גם כדי ליצור את התנאים הטובים ביותר בהם מבצעת ניסוי מסוים.