Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Схема схема протокола показан на рис. 1 и таблицы реагентов приведены ниже.

1. Инфекция (16 - 24 ч)

1. Семенной из клеток HeLa в 5 150 мм пластиковый культуре клеток блюд в среде Дульбекко изменения Орла (DMEM) высокого среднего глюкозы, например, что они достигнут примерно 80% слияния на следующий день (примерно 5 х 10 ⁸ клеток). Очень важно, что клетки не достигают 100% слияния.
2. На следующий день, развести Strep с метками акции вируса гриппа в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащего 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) до множества инфекций 3.
3. Удалить рост средней из клеток, мыть один раз PBS, и добавить 10 мл PBS, содержащего вируса в клетки. Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Замените инфекции среды DMEM-высокий уровень глюкозы, и продолжают инкубацию при 37 ° C.

2. Субклеточных фракционирования (3 ч)

1. Промойте клетки сразу с холодным ФСБ, а затем приостановить клетки в холодном PBS скребком резиновых и трансфер в 50 мл коническую трубку.
2. Гранул клеток в настольной центрифуге в течение 5 мин при 1000 оборотов в минуту, а затем вдохнуть PBS.
3. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл холодного буфера сахарозы (10 мМ HEPES рН 7,9, 10 мМ KCl, 2 мМ Mg ацетат (MgOAc), 3 мМ CaCl _2, 340 мМ сахарозы, 1 мМ ДТТ (DTT), 1% смеси ингибиторов протеазы) . После подвески, проходят через клетки в 200 мкл кончике пипетки прикреплен к 10 мл сыворотки пластиковых пипетки нарушить клетки сгустки.
4. Выдержите 10 минут на льду. Аккуратно перевернуть периодически ресуспендирования клеток.
5. Добавить Nonidet Р-40 (NP-40) до конечной концентрации 0,5% и вихря на высокой скорости в течение 15 сек. Сразу центрифуги в течение 10 мин при 3500 мкг на 4 ° C в настольный центрифугированияGE.
6. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это цитоплазматической фракции. Осадок должен быть меньше и светлее, чем исходный осадок клеток. Все фракции могут храниться в течение не менее 4 ч при температуре 4 ° C.
7. Промойте осадок в 5 мл холодного буфера сахарозы, повторно центрифуги, как в пункте 2.5 и отказаться от супернатант.
8. Ресуспендируют гранул (содержащих ядра) в 1,5 мл холодной нуклеоплазме буфера для экстракции (50 мМ HEPES рН 7,9, 150 мМ KOAc, 1,5 мМ MgCl _2, 0,1% NP-40, 1 мМ DTT, 1% смеси ингибиторов протеазы).
9. Трансфер в охлажденном, все стекла 4 мл Dounce гомогенизатор с плотно закрывающейся пестик и гомогенизации ядер с 20 ударов.
   Избегать образования пены во время гомогенизации. Сопротивление должно увеличиться после того, как около 10 ударов. Эффективность гомогенизации может быть подтверждено под микроскопом фазового контраста.
   
10. Передача усредненного ядер 1.5 трубки микроцентрифужных мл и инкубировать 20 минут на вращающееся колесо при 4 °C.
11. Центрифуга при 16000 х г в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин.
12. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это нуклеоплазме фракции.
13. Ресуспендируют осадок в 1,5 мл пищеварения буфера (50 мМ HEPES рН 7,9, 10 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl _2, 1 мМ DTT, 1% смеси ингибиторов протеазы 100 ЕД / мл Benzonase (для анализа РНК, замена с 20 Ед / мл РНКазы без ДНКазы I)), предварительно нагревают до 37 ° C, и инкубировать 10 мин при 37 ° C.
14. Добавить 42 мкл 5 М NaCl (для конечной концентрации 150 мМ NaCl) и инкубировать 20 мин дальнейшем при 4 ° C.
15. Центрифуга при 16000 х г в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин.
16. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это CH150 фракции.
17. Ресуспендируют осадок в 1,5 мл холодной высокого соль буфера (50 мМ HEPES рН 7,9, 500 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl _2, 0,1% NP-40, 1 мМ DTT, 1% смеси ингибиторов протеазы) и инкубировать 20 минут на льду.
18. Центрифуга при 16000 х г </ EM> в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин.
19. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это ch500 фракции.

3. Strep-теги очистки (2 ч)

1. Добавить 300 мкл 5 М NaCl в цитоплазматической фракции (для конечной концентрации 150 мМ NaCl).
2. Алиготе 100 мкл упакованы Strep-Tactin бисером сефарозе в долю в 15 мл коническую трубку.
3. Добавить 10 томов буфер Strep стирки (20 мМ HEPES рН 7,9, 150 мМ NaCl (500 мМ NaCl для ch500 образцов), 1 мМ ЭДТА) для бисера, переверните пробирку перемешать, и центрифуги 5 минут при 1000 х г в настольном центрифуги.
4. Удалить супернатант, повторите шаг 3,3 раза, а затем ресуспендируют шарик шарик в равном объеме промывочного буфера Strep.
5. Добавить 200 мкл промытый Strep-Tactin суспензии шарик для каждой фракции (в 1,5 мл микроцентрифужных труб для nuceloplasmic, CH150 и ch500 фракций и 15 мл коническую трубку для цитоплазматической фракции).
6. ВращатьТрубы 1 час при температуре 4 ° C на вращающемся колесе.
7. Пробирок 1 мин при 1000 х г при 4 ° C. Удалить супернатант.
8. Добавить 1 мл холодной промывочного буфера Strep в каждую пробирку. Передача бусы из 15 мл трубку (цитоплазматической фракции) до 1,5 мл трубки. Вымойте все трубы 1 мин при 4 ° С, после центрифугирования, как в пункте 3.7. Повторите этот шаг мыть два раза.
9. После того, как последний этап стирки, удаление всех следов моющего буфера с помощью плоской кончиком пипетки. Добавить 100 мкл буфера для элюции (Strep промывочного буфера, содержащего 2,5 мМ desthiobiotin) и аккуратно перемешать.
10. Выдержите 15 минут на льду. Аккуратно перемешайте бисер иногда, нажав в нижней части трубы.
11. Пробирки центрифужные 1 мин при 1000 х г при 4 ° С в микроцентрифужных. Соберите супернатант, содержащий элюированных Strep с метками vRNPs.

4. Представитель Результаты

Эффективность фракционирования лучше всего судить по Вестерн-блот анализе фракционированного лизатов использованием Антибodies специфичные для субклеточных маркеров (рис. 2). В частности, успешный субъядерных фракционирования должен показать мало или нет сотовой РНК-полимеразы II (Пол II) в нуклеоплазме или растворимый ядерной фракции ^4, и большинство должны быть извлечены с 150 мМ NaCl, ^5. Деградация Pol II также воспроизводимо наблюдается при гриппе инфицированных вирусом клеток по сравнению с неинфицированных клетках, в соответствии с литературными ^6.

Очистка vRNPs лучше всего судить по серебра или окрашивание Кумасси, как показано на цитоплазматической элюата на рис. 3. По нашему опыту, наиболее Strep-PB2 очищается в качестве части полностью сформированный vRNP, т.е. мало растворим полимеразы в плен. Это нашло свое отражение в высоких Н.П.: PA/PB1/PB2 соотношение наблюдалось серебра или Кумасси окрашивания. Низкое соотношение предлагает буфер загрязнения РНКазы, а несколько вездесущий РНКазы (например, РНКазы), как известно, расщепляет вирусную РНК таким образом, чтобы диссоциацииели-полимеразы из НП мультимеры ^7. Интересно, что лечение с Benzonase в одиночку, а достаточно, чтобы переварить вирусной РНК, по-видимому, не влияет на стехиометрических отношениях vRNP белков. Хотя мы не можем объяснить этот феномен, мы наблюдали нарушение vRNPs после переваривания с другими РНКазы (данные не представлены), предполагая, что Benzonase может оставить определенные структурно важных РНК регионах нетронутыми. После очистки vRNPs из цитоплазмы и нуклеоплазму (выполняется без пищеварение нуклеазы), 8 слабый, но дискретные группы с высоким молекулярным весом можно наблюдать, серебрения, которые соответствуют предсказанным молекулярным весом 8 сегментов генома гриппа (см. ссылку 3. ).

Относительные количества vRNPs очищенный от каждой фракции в 9 ч после инфекции, показаны на рис. 4. Распределение vRNPs меняется в течение инфекции, с сильным накоплением в CH150 долю на ранних моментов времени, иповышенное накопление в нуклеоплазме и цитоплазмы в конце моменты времени.

Рисунок 1. Блок-схема субклеточном фракционирования. Адаптировано из работы. 3.

Рисунок 2. Вестерн-блот анализа субклеточных фракций из инфицированных вирусом гриппа клетки. 10 ⁹ HeLa клетки были инфицированы штаммом вируса гриппа WSN за 9 ч до субклеточном фракционирования. Равные количества общего белка были загружены в каждом переулке и проанализированы с помощью антител показано на рисунке. РНК-полимеразы II (Пол II) было обнаружено использование клонов 8WG16, который признает все формы С-концевой домен (hypophosphorylated группы наиболее заметно). Адаптировано из работы. 3.

Рисунок 3.Серебряное пятно анализ очищенной vRNPs. HeLa клетки были инфицированы rWSN (в качестве отрицательного контроля) или rWSN-PB2-Strep за 9 ч, после чего Strep очистки от цитоплазматической фракции. Asterisk обозначает группы, которые не видны после переваривания РНКазы. Адаптировано из работы. 3.

Рисунок 4. Серебряный пятна анализ vRNPs очищается от различных клеточных фракциях. 10 ⁹ HeLa клетки были инфицированы rWSN-PB2-стрептококками или rWSN за 9 ч следует субклеточном фракционирования и Strep очистки. Равное количество элюата от каждой фракции были загружены. Адаптировано из работы. 3.

Хотя многие исследования недавно выявили отдельные белки или сотовой сети, участвующие в вирус гриппа инфекцию ^8, функциональное значение большинства этих взаимодействий остается неясным. Учитывая абсолютную зависимость хроматина на основе функций для вируса гриппа синтез РНК и сложных биофизических и биохимических природу ядра ^9, новые технологии должны будут выяснить эти функции. Субъядерных фракционирования мы представляем здесь, в сочетании с близостью очистки vRNPs, позволяет характеристику важнейших вирусной РНК заводов, которые ранее были недоступны.

Многие протоколы субклеточном фракционирования были ранее описаны в литературе. Мы заметили, что большинство из этих традиционных методов приводит к преждевременной утечки vRNPs от ядра, явление также описано для Pol II ^10. Используя короткий инкубационный предварительно увеличилось клеток с низким сoncentration слабого моющего средства, NP-40, эффективный лизис мембраны плазмы происходит без существенной ядерной утечки. Интересно, что выполнение нашего субклеточном фракционирования использования A549 и HEK293T клеток, а не HeLa клеток привела к сильной ядерной утечки vRNPs в обеих клеточных линиях. Снижение NP-40 концентрации примерно 0,2% уменьшить этот вопрос, однако из-за некоторых изменчивости этих клеточных линий, оптимальные условия должны быть определены опытным путем. Другим возможным altermative является использование не-человека, вирусом гриппа восприимчивы клеточных линий, таких как MDCK или Vero клетках.

Наша добыча соли протокол отличается от традиционного хроматина добычи процедур, которые часто используют ниже концентрации соли и / или высокой концентрации ЭДТА. Наш протокол отделяет хроматина в двух конкретных фракций, фракция Пол II-high/histone-low и взаимным. Тем не менее, другие методы добычи хроматина могут быть совместимы с аффинной очистки от VRNPs. Так как большинство хроматина процедуры извлечения были направлены на ДНК-белковых взаимодействий по сравнению с белок-белковые взаимодействия, новые технологии, необходимые для извлечения плотно хроматин-связанными нескольких белковых комплексов ^11.

В общем, длина инфекции должны быть определены эмпирически из-за различий между штаммами вируса и клеточных линиях. Использование rWSN-PB2-Strep деформации при МВД 3, мы провели субклеточном фракционирования в моменты времени от 3 до 10 ч после инфекции. По нашему опыту, менее чем за 3 ч инфекция дает слишком мало очищенный vRNPs полезных Вестерн-блот анализе, в то время как инфекция более 3 ч в сильных цитопатического эффекта и последующего смешивания фракций.

Возможность изолировать неповрежденных, прочно связанных хроматина вирусных комплексов открывает несколько возможностей. Хотя мы использовали рекомбинантный вирус выражения Strep с метками PB2, другие теги близость также может быть использован, а также традиционныйitional иммунопреципитации ориентации других вирусных белков. Кроме того, в то время как наш анализ vRNPs был ограничен к характеристике их белка и РНК компонентов, очищенный комплексов также может быть использован для выполнения функциональных анализов в лабораторных синтеза. И, наконец, разделение vRNPs в грубых функциональных видов путем фракционирования субъядерных может также позволить более внимательном изучении нескольких недавно описанный пост-трансляционной модификации вирусных белков, необходимых для эффективного синтеза вирусной РНК ^12,13.