Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Un diagramma di flusso schematico del protocollo è mostrato in fig. 1 e una tabella di reagenti è presentato di seguito.

1. Infezione (16 - 24 h)

1. Seed le cellule HeLa in 5 mm 150 piatti di plastica di coltura di cellule in terreno Dulbecco modificato Eagle (DMEM)-medio-alta di glucosio, in modo tale che arriveranno circa l'80% di confluenza il giorno seguente (circa 5 x 10 ⁸ cellule). È importante che le cellule non raggiunge il 100% di confluenza.
2. Il giorno successivo, diluire il Strep-tag stock di virus influenzale in tampone fosfato isotonico (PBS) contenente 0,3% di sieroalbumina bovina (BSA) ad una molteplicità di infezione di 3.
3. Rimuovere il mezzo di crescita delle cellule, lavare una volta con PBS, e aggiungere 10 ml di PBS contenente il virus alle cellule. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Sostituire il mezzo infezione con DMEM-alto glucosio, e continuare incubazione a 37 ° C.

2. Frazionamento subcellulare (3 h)

1. Lavare le cellule una volta con PBS freddo e poi sospendere le cellule in PBS freddo con un raschietto in gomma e il trasferimento ad un tubo da 50 ml.
2. Cellule pellet in una centrifuga da tavolo per 5 minuti a 1.000 rpm e quindi aspirare PBS.
3. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di tampone saccarosio freddo (10 mM HEPES pH 7,9, KCl 10 mM, 2 mM acetato di Mg (MgOAc), 3 mM CaCl _2, saccarosio 340 mM, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1% mix inibitore delle proteasi) . Dopo la sospensione, le cellule passano attraverso una punta di pipetta 200 microlitri attaccato ad una pipetta 10 ml di siero di interrompere grumi di cellule.
4. Incubare 10 minuti sul ghiaccio. Capovolgere periodicamente per risospendere le cellule.
5. Aggiungere Nonidet P-40 (NP-40) ad una concentrazione finale di 0,5% e vortice ad alta velocità per 15 sec. Immediatamente centrifugare per 10 min a 3500 xga 4 ° C in una centrifuga da tavologe.
6. Rimuovere il surnatante e conservare a 4 ° C. Questa è la frazione citoplasmatica. Il pellet deve essere più piccolo e più bianco il pellet di cellule originale. Tutte le frazioni possono essere conservate per almeno 4 ore a 4 ° C.
7. Lavare il pellet in 5 ml freddo tampone saccarosio, re-centrifuga come nel punto 2.5 e scartare il surnatante.
8. Risospendere il pellet (contenente nuclei) in 1,5 ml di tampone di estrazione a freddo nucleoplasmic (50 mM HEPES pH 7,9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl _2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% mix inibitori delle proteasi).
9. Trasferire in una fredda, completamente in vetro, 4 ml Dounce omogeneizzatore con un aderente pestello e omogeneizzare i nuclei con 20 colpi.
   Evitare la formazione di schiuma durante omogeneizzazione. La resistenza dovrebbe aumentare dopo circa 10 colpi. Omogeneizzazione efficiente può essere confermata con un microscopio a contrasto di fase.
   
10. Trasferire la nuclei omogeneizzato in una provetta 1,5 ml microcentrifuga e incubare 20 min su una ruota girevole a 4 °C.
11. Centrifugare a 16.000 x g in una microcentrifuga a 4 ° C per 10 min.
12. Rimuovere il surnatante e conservare a 4 ° C. Questa è la frazione nucleoplasmic.
13. Risospendere il pellet in 1,5 ml di tampone di digestione (50 mM HEPES pH 7,9, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl _2, 1 mM DTT, 1% mix inibitore della proteasi, 100 U / ml Benzonase (per analisi RNA, sostituirlo con 20 U / ml RNasi senza DNasi I)) pre-riscaldato a 37 ° C, e incubare 10 min a 37 ° C.
14. Aggiungere 42 microlitri di NaCl 5 M (per concentrazione finale di 150 mM NaCl) e incubare ulteriori 20 min a 4 ° C.
15. Centrifugare a 16.000 x g in una microcentrifuga a 4 ° C per 10 min.
16. Rimuovere il surnatante e conservare a 4 ° C. Questa è la frazione CH150.
17. Risospendere il pellet in 1,5 ml freddo alto sale tampone (50 mM HEPES pH 7,9, 500 mM NaCl, 1,5 mM MgCl _2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% mix inibitore di proteasi) e incubare 20 min in ghiaccio.
18. Centrifugare a 16000 x g </ Em> in una microcentrifuga a 4 ° C per 10 min.
19. Rimuovere il surnatante e conservare a 4 ° C. Questa è la frazione ch500.

3. Strep-tag Purificazione (2 h)

1. Aggiungere 300 pl del 5 M NaCl alla frazione citoplasmatica (per concentrazione finale di 150 mM NaCl).
2. Aliquotare 100 pl di Strep-confezionati Tactin perle Sepharose per frazione in un tubo da 15 ml.
3. Aggiungere 10 volumi di tampone di lavaggio Strep (20 mM HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl per ch500 campioni), 1 mM EDTA) a perline, invertire la provetta per miscelare, e centrifugare 5 min a 1.000 x g in un tavolo centrifugare.
4. Eliminare il surnatante, ripetere il punto 3,3 due volte e poi risospendere il pellet tallone in un volume uguale di tampone di lavaggio Strep.
5. Aggiungere 200 microlitri di lavato Strep-Tactin impasto tallone per ogni frazione (in provette per microcentrifuga da 1,5 ml, i nuceloplasmic CH150 e ch500 frazioni e un tubo 15 ml conica per la frazione citoplasmatica).
6. Ruotareprovette 1h a 4 ° C su una ruota girevole.
7. Centrifugare provette 1 min a 1.000 x ga 4 ° C. Gettare il surnatante.
8. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio a freddo Strep in ciascun tubo. Trasferire perline provetta da 15 ml (frazione citoplasmatica) a 1,5 ml provetta. Lavare tutti 1 min tubi a 4 ° C, dopo centrifugazione come nel passaggio 3,7. Ripetere questa fase di lavaggio due volte.
9. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere tutte le tracce di tampone di lavaggio con una punta piatta pipetta. Aggiungere 100 ul tampone di eluizione (tampone di lavaggio Strep contenente 2,5 mM desthiobiotin) e mescolare delicatamente.
10. Incubare 15 min in ghiaccio. Mescolare delicatamente di tanto in tanto perle toccando il fondo delle provette.
11. Provette per centrifuga 1 min a 1000 x ga 4 ° C in microcentrifuga. Raccogliere il supernatante contenente eluite Strep-tag vRNPs.

4. Risultati rappresentativi

L'efficienza del frazionamento è meglio giudicato mediante analisi Western blot di lisati frazionati utilizzando antibodies specifici per i marcatori subcellulari (Fig. 2). In particolare, successo frazionamento subnucleare dovrebbe mostrare poca o nessuna cellulare RNA polimerasi II (Pol II) in nucleoplasmic, o frazione solubile nucleare ^4, e più devono essere estratti con 150 mM NaCl ^5. Un degrado di Pol II è riproducibile osservata in influenzali cellule infettate da virus rispetto alle cellule non infette, in linea con la letteratura ^6.

La purificazione di vRNPs è meglio giudicato da argento o colorazione con Coomassie, come mostrato per un eluato citoplasmatica in Fig. 3. Nella nostra esperienza, la maggior parte Strep-PB2 viene purificato come parte di un mercato completamente formata vRNP, vale a dire polimerasi poco solubile viene catturato. Ciò si riflette in alto NP: PA/PB1/PB2 rapporto osservato argento o colorazione Coomassie. Un rapporto inferiore suggerisce la contaminazione tampone con RNasi, come diverse RNasi onnipresenti (come RNasi A) sono noti a RNA virale clivare in modo tale da dissocimangiato la polimerasi dalla NP multimeri ^7. Interessante, il trattamento con BenzonaseTM sola, mentre sufficiente a digerire RNA virale, sembra non avere alcun effetto sui rapporti stechiometrici di proteine ​​vRNP. Anche se non possiamo spiegare questo fenomeno, abbiamo osservato interruzione delle vRNPs dopo digestione con RNasi altri dati non mostrati), suggerendo che Benzonase può lasciare alcune regioni strutturalmente importanti RNA intatto. Dopo purificazione del vRNPs dal citoplasma e nucleoplasma (eseguita senza digestione nucleasi), 8 deboli bande discrete ma ad alti pesi molecolari può essere osservato da colorazione con argento, che corrispondono ai pesi molecolari previsti dei segmenti genomici influenza 8 (vedi rif. 3 ).

Le quantità relative di vRNPs purificati da ogni frazione a 9 h dopo l'infezione sono mostrati nella fig. 4. La distribuzione di vRNPs varia nel corso dell'infezione, con forte accumulo nella frazione CH150 in punti temporali iniziali, eaumentato accumulo nel nucleoplasma e citoplasma in punti temporali tardivi.

Figura 1. Diagramma di flusso del frazionamento subcellulare. Adattato da ref. 3.

Figura 2. Analisi Western blot delle frazioni subcellulari da influenza cellule infettate da virus. 10 ⁹ cellule HeLa sono state infettate con WSN ceppo del virus influenzale per 9 ore prima di frazionamento subcellulare. Uguali quantità di proteine ​​totali sono state caricate in ciascuna corsia e analizzati utilizzando gli anticorpi mostrate. RNA polimerasi II (Pol II) è stato rilevato usando clone 8WG16, che riconosce tutte le forme del dominio C-terminale (la banda ipofosforilata è più prominente). Adattato da ref. 3.

Figura 3.Argento analisi macchia di vRNPs purificata. Cellule HeLa sono state infettate con rWSN (come controllo negativo) o rWSN-PB2-Strep per 9 h, seguito da purificazione Strep dalla frazione citoplasmatica. Asterisco indica le bande che non sono visibili dopo la digestione RNasi. Adattato da ref. 3.

Figura 4. Argento analisi macchia di vRNPs purificati da diverse frazioni cellulari. 10 ⁹ cellule HeLa sono state infettate con rWSN-PB2-Strep o rWSN per 9 h, seguito da frazionamento subcellulare e purificazione Strep. Uguali quantità di eluato da ogni frazione sono stati caricati. Adattato da ref. 3.

Mentre molti studi hanno recentemente identificato singole proteine ​​o reti cellulari coinvolti nella infezione da virus dell'influenza ^8, il significato funzionale della maggior parte di queste interazioni è ancora chiaro. Data la dipendenza assoluta di cromatina basati funzioni per la sintesi di RNA del virus influenzale e la natura complessa biofisica e biochimica del nucleo ^9, nuove tecniche saranno necessari per chiarire tali funzioni. Il frazionamento subnucleare che presentiamo qui, insieme con purificazione per affinità di vRNPs, consente la caratterizzazione di cruciali fabbriche di RNA virale, che prima erano inaccessibili.

Molti protocolli di frazionamento subcellulari sono stati precedentemente descritti in letteratura. Abbiamo osservato che la maggior parte di questi metodi tradizionali portare alla prematura perdita di vRNPs dal nucleo, un fenomeno descritto anche per Pol II ^10. Utilizzando una breve incubazione di cellule pre-soffiati con un basso concentration di un detergente debole, NP-40, efficiente lisi della membrana plasmatica si è verificato, senza significative perdite nucleare. Interessante, svolgimento del nostro frazionamento subcellulare con A549 e le cellule HEK293T piuttosto che le cellule HeLa hanno portato a forti perdite nucleare vRNPs in entrambe le linee cellulari. Abbassando la concentrazione NP-40 a circa il 0,2% ridotto questo problema, tuttavia, a causa di una certa variabilità di queste linee cellulari, condizioni ottimali deve essere determinato empiricamente. Un'altra possibile altermative è l'uso di linee cellulari non-umano, il virus dell'influenza-sensibili, quali cellule MDCK o Vero.

Il nostro protocollo di estrazione del sale si differenzia da procedure tradizionali di estrazione della cromatina che spesso utilizzano concentrazioni di sale inferiore e / o alte concentrazioni di EDTA. Il nostro protocollo separa cromatina in due frazioni specifiche, una frazione II-high/histone-low Pol e la sua reciproche. Tuttavia, altri metodi di estrazione cromatina può anche essere compatibile con la purificazione di affinità VRNPs. Poiché la maggior parte delle procedure di estrazione cromatina sono concentrati su DNA-proteina rispetto alle interazioni proteina-proteina, nuove tecniche sono necessarie per estrarre cromatina strettamente associati a multi-proteina complessi ^11.

In generale, la lunghezza di infezione dovrebbe essere determinato empiricamente a causa di variazioni tra ceppi di virus e linee cellulari. Utilizzando il rWSN-PB2-Strep deformazione ad una MOI di 3, abbiamo eseguito frazionamento subcellulare in punti temporali variabili 3-10 h dopo l'infezione. Nella nostra esperienza, a meno di 3 ore di infezione produce vRNPs purificati troppo pochi utili per l'analisi Western blot, mentre l'infezione più di 3 risultati h in forte effetto citopatico e una successiva miscelazione di frazioni.

La capacità di isolare intatti, strettamente complessi virali cromatina-bound apre diverse possibilità. Mentre abbiamo utilizzato un virus ricombinante che esprime una Strep-tag PB2, tag di affinità altri possono anche essere usati, come pure tradimmunoprecipitazione itional di mira altre proteine ​​virali. Inoltre, mentre la nostra analisi di vRNPs era limitata alla caratterizzazione di proteine ​​e loro componenti RNA, i complessi purificate possono anche essere utilizzati per eseguire test funzionali in vitro di sintesi. Infine, la separazione di vRNPs in grossolani specie funzionali attraverso subnucleare frazionamento può anche permettere lo studio più di recente descritte diverse modificazioni post-traduzionali di proteine ​​virali necessari per la sintesi di RNA virale efficiente ^12,13.