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 JoVE Clinical and Translational Medicine

人体胰腺的收集协议

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Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

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Cite this Article: 人体胰腺的收集协议

Campbell-Thompson, M. L., Montgomery, E. L., Foss, R. M., Kolheffer, K. M., Phipps, G., Schneider, L., et al. Collection Protocol for Human Pancreas. J. Vis. Exp. (63), e4039, doi:10.3791/4039 (2012).

Abstract: 人体胰腺的收集协议

这解剖和取样程序开发为糖尿病（nPOD）的计划，以规范准备恢复从尸体器官捐献者的胰腺胰腺器官捐赠者的网络。胰腺分为3个主要地区整个横向轴内侧串行的横截面（头，身，尾）。交替部分用于固定石蜡和鲜冻块和残留样品剁碎单元冷冻样品准备，无论有或无RNase抑制剂，DNA，RNA或蛋白质隔离。胰腺的解剖过程的总体目标是保持解剖定位的同时，品尝整个胰腺。

在小岛组成，大小和数字方面的内分泌细胞的异质性是人类胰岛的报告相比，啮齿动物胰岛1。大多数人类胰岛胰头，身体和尾巴地区组成的胰岛素containinGβ-细胞的比例较低，其次是胰高血糖素的α细胞和生长抑素的δ-细胞。胰多肽含PP细胞生长素含小量细胞也存在，但在小数字。相比之下，钩突地区包含主要胰岛胰多肽含PP细胞组成。这些区域的胰岛变化，从发展的差异产生。胰腺发展的前肠和胃和十二指肠，腹侧叶动作和保险丝背3旋转后的腹侧和背侧胰芽。腹侧叶形成的头后部，包括钩突背叶而产生的其他器官。另据报道，尾部区域，具有较高的胰岛细胞密度比其他地区和背叶源性成分，在1型糖尿病的发生选择性萎缩区域胰腺癌的变化

其他器官和组织往往是恢复从器官捐赠者和包括胰腺淋巴结，脾脏和非胰腺淋巴结。这些样品被收回冻存细胞的分离此外胰腺类似的格式。当近端十二指肠与胰腺，十二指肠粘膜可收集石蜡和冰冻块和碎单元冷冻的筹备工作。

Protocol: 人体胰腺的收集协议

1。设置

  1. 石蜡块，用铅笔或自动录像带打印机手动标签的录像带。包括捐赠标识符（CaseID），样本类型，等分数目，以及任何额外的唯一标识（案例表， 附录1 ）。
  2. 标签华侨城模具为永久性标记录音带。剪下铝箔5-10厘米的长方形。
  3. 打印或手工标签永久性标记所有小瓶和管。包括足够瓶碎单元冷冻样品和新鲜出货的RPMI媒体管。为冷冻小瓶与RNAlater单元的，加1毫升RNAlater每个离心管。
  4. 在生物安全罩和柜台设置清扫与消毒清扫工具（镊子，手术刀，刀片，纱布垫（4×4））以及磁带和华侨城模具板在使用顺序排列。
  5. 通过把准备冻结浴干冰在一个中型泡沫塑料箱（10×10厘米）至少有3厘米的深度，并添加异戊烷，直到完全覆盖干冰。
  6. 可选：填写一个小杜瓦液氮容器。
  7. 如果需要电子显微镜（EM）胰腺，准备加入1.25毫升16％多聚甲醛，8毫升1.25％戊二醛，7.5毫升0.1M PBS TAAB固定液。准备加入2.5毫升16％多聚甲醛7.5毫升0.1M PBS Lowicryl固定液。
  8. 准备用于分离细胞的解决方案。以500毫升瓶装的DMEF（谷氨酰胺），遵循无菌技术，同时添加以下：
    1. 胎牛血清（FBS），附加50毫升，最后的10％。
    2. 青霉素/链霉素（PEN /链球菌，1万U /毫升/ 10000微克/毫升股票） - 添加5毫升笔/链球菌股票的的RPMI终浓度为100 U / ml的/ 100ug/ml的。还可以添加5毫升至500毫升瓶举行淋巴结或脾样本使用时DPBS。

2。人员

三名工作人员，但该程序可以有一个训练有素的个人进行过程优化完成。两个人一般可以在90分钟内完成的过程。实际工期是依赖于接受组织的数量和减轻胰腺淋巴结的发现。细胞隔离的样品在4日举行°C，直到完成组织剥离，而并行处理的血清标本。
  • 病理学家，病理学助理，或相当于一个经验丰富的工作人员，导致了组织处理和执行主要包括胰头部（S）和收获胰腺淋巴结清扫。最初的努力是针对胰腺检查胰周淋巴结的脂肪。
  • 实验室技师或相当于工作人员培训，组织修剪，其主要职责是衡量固定及冷冻块和单元冷冻至五胰腺和地区，修剪组织IALS。接收从病理学助理十二指肠和脾脏和处理，而这些器官的病理学助理处理胰腺。
  • 实验室助理工作人员，帮助别人，包括块，小瓶标签，样品切碎的冷冻管，血清处理。

    • 3。胰腺解剖

    1. 取出十二指肠和脾脏，用钝，锐性剥离，清除多余的脂肪，血管和神经，胰腺
    2. 将清洁用纸巾覆盖在解剖板胰腺。胰腺的前表面上沾了蓝墨水和蔓延的棉签。吸干多余的。
    3. 可选：沾在黑色墨水和传播新的胰腺后表面撒施。与前表面面临解剖员返回胰腺正常的方向。
    4. 切成3个地区的胰腺头部，身体，尾巴（ 图1）。削减HEA之间的交界处d和身体，然后分为身体和尾巴〜等份的剩余部分。
    5. 权衡各地区胰腺和记录重量（案例相关检验表（ 附录1 ））。
    6. 胰腺中的一横的“面包”的方式（ 图1）各地区组（约0.5厘米）。
    7. 使用碎样本地区之间的两个路口的部分。根据胰腺大小，从体尾交界地区的样本可能很难获得石蜡块的数量，在这种情况下，可以降低获得碎样品或从胰头体地区唯一的样品，可以得到。标签冷冻管头部或身体来表示近端地区的交界处。
      1. 百果片和冷冻管（≥1克每瓶）之间均匀地划分。迅速冻结在液氮或干冰RNALater小瓶 - 异戊烷浆，​​然后转移ţOA -80°C冰箱。
      2. 保持与RNALater小瓶30分钟，在室温下，以便平衡，混音，并迅速冻结在液氮或干冰戊烷浆，然后转移到-80℃冰箱。
    8. 删除石蜡和OCT块石蜡（ 图1）开始交替部分。
    9. 瘦到正确的横截面。
    10. 〜1.5×1.5×0.5厘米的录音带的部分地方。如果横截面过大，减少了一半（ 图2b）。蓝色标签为“A”和后半段为“B”的前半录音带。
    11. 如果件仍然过大，每节垂直削减前切（ 图2c）。公元标签录音带以顺时针的方式。修剪进一步需要，以适应在录音带的片断。
    12. 数块的顺序，在区域范围内，最内侧的部分开始。
    13. 对于石蜡块，位置C所以标签assettes是左边和地方组织成磁带，保持其方向。关闭录像带盖和转移到一个容器〜500毫升10％的中性福尔马林（NBF）。开始计时当最后录像带被放置在固定液固定。
    14. 十月块，倒入一层薄薄的华侨城媒体prelabeled模具1模具一定要保持方向，并覆盖组织与华侨城奠定了组织。迅速沉浸在干冰华侨城模具 - 戊烷浆〜1分钟。从泥浆和删除临时存储干冰或-80°C下长期储存的冷冻。
    15. 获得头体交界处，从电子显微镜（EM）〜0.5×0.5厘米的薄片。片在TAAB固定液和Lowicryl固定液的其他片的地方之一。储存在4°C两种类型的固定液与样品至少48小时和/或无限期直至EM进一步处理。

    4。脾，淋巴结节点Dissections和十二指肠黏膜夹层

    1. 从脂肪中分离胰腺癌淋巴结（兹罗提）和结缔组织修剪所有的节点舱。在无菌细胞培养DMEF菜的地方。根据分离的总数，分为新鲜的出货量，冻存细胞隔离，石蜡和/或十月块，小瓶分装兹罗提。剁碎切成不超过0.5厘米的大节点。
    2. 剁碎成小立方体（约0.5厘米）的非胰腺淋巴结和脾脏。新鲜样品供货或冻存细胞隔离，根据起始原料的金额固定，华侨城媒体，或培养液中的地方。
    3. 打开十二指肠，轻轻擦拭干净，用湿纱布粘膜，十二指肠粘膜。削减部分的黏膜石蜡和/或冷冻十月块和碎小瓶样品，与RNAlater。冻结为其他样品。

    5。 WRAP十月预标记的铝箔和地方十月块和块在长期储存箱小瓶在-80°C。

    6。提交固定标本，石蜡处理

    1. 使用自动的石蜡处理器或使用手动计时，修复组织了16个小时（范围为20±4小时）。工艺蜡块，用自动处理器（ 附录2 ）。
    2. 录像带标签左侧的解剖员放置在准确定位的嵌入部分。嵌入与十二指肠黏膜切面允许检查黏膜垂直粘膜下层。

    7。清洁夹层领域和消毒。洗清扫工具，并重新消毒。生物医学废物贮存，放置在福尔马林固定液残留的人体组织。根据当地法规丢弃在一个月内的生物医学废物。

    8。更新的样品库存系统

    ve_title“> 9代表结果。

    此过程将处理整个器官，包括三大区域，即，头部，身体和尾部2小时内划分的抽样代表一个完整的人类胰腺。钩突的地区，发现在后头部区域，包括在头部解剖。在没有糖尿病的器官捐赠者的平均胰腺重量为82.4克（52.7 - 139.0克）。胰腺区域重分别为约等于（ 图3）。

    这个过程也可以让重建整个胰腺利用连续石蜡和华侨城块的彩色幻灯片。多种格式允许的最大利用率，为当前和未来的技术是可行的。当前nPOD情况表（ 附录1 ），用于记录回收样品和随后的PROCessing由等分的种类和数量。

    图1
    图1。程序的总体方案。整个胰腺进行处理，同时保持解剖方向。头地区是在优越的上下轴，由于腹胰叶后的地区，其中包括钩突地区的存在。孵化面积在路口表示用于碎样本在冷冻管的地区。磷，石蜡，O，华侨城。

    图2
    图2。刻字胰腺部分计划。横向胰腺切片可进一步分为两半或季度字母以顺时针的方式。

    图3
    图3。胰腺重量从没有糖尿病的器官捐赠者。从成年捐赠者（> 17岁）的完整胰腺称重，然后分为区域和区域的权重获得。数据是手段±标准差（n = 15）。

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    Discussion: 人体胰腺的收集协议

    此过程的目标是定义一个标准的胰腺处理，可以跨多个收集点统一，从而使不同群体得到的结果进行比较。剥离的方法是基于标准的注释主要胰腺区域内细分区域的额外步骤与手术病理做法。标准化的biospecimen处理方法是必需的，以便收集高品质的最佳做法biospecimen收集出版由国家组织，如国家癌症研究所6 biobanking体现样品。从捐助者代表糖尿病和适当的控制人口的各个阶段的人类胰腺样本biobanking已报告7-9。然而，为从胰头地区收集这些样本的具体细节一直缺乏。相当多的个体间的胰岛细胞的异质性是众所周知的Wi日到5倍胰岛大小分布变化，使胰腺区域的注解时，需要分析固有的异质性10。胰腺样品处理标准格式，将协助解决个别病人因素，使其他潜在的主要疾病的因素，可以更好地解决。

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    Disclosures: 人体胰腺的收集协议

    没有利益冲突的声明。

    Acknowledgements: 人体胰腺的收集协议

    作者感谢捐助者的家庭和组织的专家协助参与这项研究和玛丽亚·马蒂诺和伊琳娜Kusmartseva器官采购。这项工作是由青少年糖尿病研究基金会（MC-T.，马萨诸塞州）在对糖尿病患者的胰腺器官捐赠者的网络支持。

    Materials: 人体胰腺的收集协议

    Name Company Catalog Number Comments
    Dissection instruments including scalpels with 22 blades Various Various
    Centrifuge tubes (15 and 50 ml) Fisher Scientific 05-539-5, 430828 Sterile
    Cryotubes(1.8 ml) VWR North America 89004-300 Sterile, bar codes optional
    RNAlater Ambion AM7021
    Surgical Pathology Ink
    Cassettes Mercedes Medical CAS ECO109
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 23-245-685
    OCT Freezing Media TissueTek 4583
    Molds Thermo Fisher Scientific, Inc. 58952 Various sizes
    Isopentane Fisher Scientific O3551-4 OCT chilling bath
    Dry ice OCT chilling bath
    Liquid nitrogen in Dewar flask Snap freezing cryovials
    Cell culture dish (100mm) Corning 430167 Sterile
    Hyclone DMEF Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30023.01 Sterile, store refrigerated, glutamine included
    Fetal Bovine Serum Cellgro 35-010-CV Sterile, store frozen aliquots
    Penicillin/Streptomycin/Antifungal GIBCO, by Life Technologies 15240-062 Sterile, store frozen aliquots
    Type 9 Paraffin Richard-Allan Scientific 8337
    1X D-PBS GIBCO, by Life Technologies 14190-144 Sterile
    16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Make fresh, store refrigerated
    8% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16019 Make fresh, store refrigerated
    Biosafety Level 2 hood Various
    Ultra-low freezer Various
    Sakura Cassette Printer Sakura Finetek
    Sakura VIP300 Sakura Finetek Automatic paraffin processor
    Paraffin Embedding Station Thermo Fisher Scientific, Inc.
    Table 1. Specific reagents and equipment.

    References: 人体胰腺的收集协议

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