Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

1. Вскрытие и диссоциации эпителиальных клетках кишечника

Подготовка реагентов и оборудования:

• Теплый Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} без PBS (CMF PBS) до комнатной температуры.
• Теплый Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} без HBSS с 5% FBS (CMF HBSS / FBS) и на 2 мм ЭДТА до комнатной температуры.
• Теплый Орбитальный шейкер до 37 ° C.

Примечание: Шаги 1.1 до 1.7 должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы свести к минимуму степень клеточной смерти и для достижения максимальной доходности клетки.

1. Усыпить мышей в CO ₂ камеры и спрей 70% этанола на брюшной полости и грудной клетки.
2. Сделайте небольшой горизонтальный разрез в середине живота с ножницами и отогните кожи подвергать брюшины.
3. Приступить к отделить живот от верхней части тонкой кишки за счет сокращения на пилорический сфинктер. Дразните от брыжейки с пинцетом и сократить раз вподвздошно-слепой кишки клапана, чтобы освободить весь тонкий кишечник из толстой кишки. Сделайте надрез на ануса и снова дразнят друг от друга до брыжейки толстой кишки является бесплатным.
4. Разрежьте продольно толстой кишки с помощью ножниц и смыть фекального содержимого и слизи из просвета кишечника в CMF PBS при комнатной температуре.
5. Используйте ножницы и щипцы для макроскопически рассекать из патчей Пейера по борьбе с брыжеечной поверхности тонкой кишки и разрезать тонкой кишке продольно.
6. Вымойте небольшой просвет кишечника фекальные содержание и слизи в CMF PBS при комнатной температуре.
7. Отдельно вырезать небольшие / толстой кишки на 1,5 см кусочки и поместите в отдельную 50 мл конические пробирки, содержащие 30 мл подогретого CMF HBSS / FBS и 2 мМ ЭДТА. Не добавляйте более 1 кишечника на 50 мл коническую трубку.
8. Горизонтально разместить по 50 мл коническую трубку в орбитальный шейкер и потрясите для 250 оборотов в минуту в течение 20 мин при 37 ° C. </ LI>
9. Поместите один фильтр сетки над отходами ведро и залейте содержимое по 50 мл коническую трубку, через восстановление части 1,5 см кишечника и поместить их в отдельный 50 мл конические пробирки, содержащие 30 мл подогретого CHBSS / FBS 2 мМ ЭДТА.
10. Повторите 1.8.

2. Пищеварение тканей и выделение клеток кишечника

Подготовка реагентов и оборудования:

• Коллагеназы решение: 1,5 мг / мл Тип VIII коллагеназы растворяется в предварительно нагретой CMF HBSS / FBS с 40 мкг / мл ДНКазы I.
• Предварительно нагретый CMF HBSS / FBS и 2 мМ ЭДТА.
• Предварительно нагретый орбитальном шейкере при температуре 37 ° C.
• Ледяной CMF HBSS / FBS.

1. После второго тура дрожь, вылейте содержимое по 50 мл коническую трубку через сито и передачи части 1,5 см кишечника в небольших пластиковых вес лодки после вытирать излишки носителя с помощью бумажного полотенца.
2. Быстро фарш 10,5 см части кишечника с помощью ножниц прямо на вес лодки и добавить рубленые кишечнике до 20 мл коллагеназы решение. Горизонтально разместить по 50 мл коническую трубку в орбитальном шейкере и дайджест на 200 оборотов в минуту в течение 10-20 минут при температуре 37 ° C. Пожалуйста, см. ниже по оптимизации.
3. Кратко вихрь для обеспечения тщательного диссоциации оставшиеся ткани кишечника и процеживают через 100 мкм ячейка фильтр непосредственно в 50 мл коническую трубку.
4. Топ с каждым 50 мл коническую трубку с CMF HBSS / FBS и центрифуги в 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Если твердый осадок не наблюдается толстой кишки после центрифугирования образца, пробы должны быть снова центрифугировали в течение 3,5 мин. Повторите этот шаг мыть еще раз.
5. Слейте надосадочную и ресуспендируют осадок клеток в ледяной CMF HBSS / FBS и место образцы на льду.
6. Перейдите к разделу 3 для FACS приобретение / или анализа в разделе 4 магнитных шарика обогащения для высокоскоростного клетки сортировонг.

3. Антитела Окрашивание для многоцветной проточной цитометрии ДК и макрофаги

Подготовка реагентов и оборудования:

• Ледяной PBS CMF.
• Ледяной окрашивания буфера (PBS CMF + 5% FBS).
• Подготовить мертвые клетки пятно в ледяной CMF PBS в разведении 1:1000 использованием LIVE / DEAD Исправимые Аква Dead Cell пятен Kit.
• Подготовка коктейль антител окрашивание, добавив следующие флуоресценции-меченных моноклональных антител (МАТ) к ледяного буфера окрашивание: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c АПК, MHC-II (ИА ^б) Alexa Fluor +700, CD11b eFluor-450, F4/80-PE-Cy7.

1. Передача клеток в 5 мл полистирола с круглым дном (FACS) трубы.
2. Промойте клетки дважды в ледяной CMF PBS.
3. Инкубируйте образцы мертвых клеток пятно в течение 15 минут на льду в темноте.
4. Промойте клетки дважды в ледяной CMF PBS.
5. Блок ячеек с 2.4G2 anti-FcγRIII/II в ледяной окрашиваниембуфера в течение 10 минут на льду.
6. Вымойте клеток в ледяной окрашиванием буфера.
7. Инкубируйте образцы с антителами окрашивания коктейль в течение 20 минут на льду в темноте.
8. Промойте клетки с ледяного буфера окрашивания в два раза и образцы ресуспендируют в 400 мкл ледяного буфера окрашивания и проходит через 40 мкм фильтр крышки на трубах FACS.
9. Получить образцы на LSR II цитометр (BD), как определено стробирования стратегии в разделе 5 и на рисунке 1.

4. Обогащение ДК и макрофаги из кишечника

Подготовка реагентов и оборудования:

• Ледяной окрашивания буфера (PBS CMF + 5% FBS).

1. Инкубируйте суспензии отдельных клеток, полученных из шага 2.5 с CD11b и CD11c MACS бусины в соответствии с инструкциями производителя.
2. Промойте клетки с ледяной окрашиванием буфера с последующим центрифугированием.
3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ледяной окрашиванием буфери проходить через ячейки 100 мкм сито следуют ячейки 40 мкм фильтр.
4. Расширьте возможности для магнитных шарика подключенных клеток положительной селекции с использованием MACS LS магнитные колонки.
5. Повторите шаг 4.2 и отказаться от супернатант.
6. Инкубируйте клетки с поверхности маркер МКА, как описано в пункте 3.7.
7. Вымойте магнитных шарика обогащенного клетки дважды ледяной окрашиванием буфера. Ресуспендируйте клетки гранулы в 500 мкл ледяной окрашиванием буфера без азид натрия, и пройти через сито 40 мкм клетки в трубку FACS.
8. Приступить к FACS-сортировки на BD ARIA II Сотовые Сортировщик для сортировки кишечного постоянного тока и / или макрофагов множества интересов.

5. Память стратегии LP БТР

Примечание: Обратите внимание, что неокрашенные клетки кишечника могут быть использованы в качестве отрицательного контроля для оказания помощи в надлежащий вид ворот к разделению положительных и отрицательных населения.

1. Как показано на рисунке1, создайте точку сюжета и исключить клетки, которые являются положительными для мертвых клеток пятна (рис. 1) с последующим исключением дублет событий (рис. 1B и C). Затем ворота на клетки интерес по передней и боковой разброс убедившись, исключить мусор (рис. 1D).
2. Создайте еще ​​одну точку сюжета и дальше ворот на CD45 ⁺ и И.А. ^{б +} клеток, которые фенотипически характеризует БТР (рис. 1д).
3. На отдельном участке точка, анализировать для CD11b и CD11c выражение выделить конкретный округ Колумбия, и макрофагов подмножеств (R1, R2 и R3,. Рис 1F). Клетки R1 являются CD11c ⁺ CD11b ^{тупой / -} клеток. Региона, R2, очерчена так, что эти клетки имеют одинаковый уровень поверхности выражение для CD11c как в клетках R1, но клетки R2 также экспресс CD11b. После этого региона R3 предназначена для клеток, которые CD11b ⁺ и CD11c ^{тупой / -.}
4. alyze регионах R1, R2, R3 и в дальнейшем для F4/80 и CD103 выражение дифференцировать макрофагов и постоянного населения, соответственно. CD11c ⁺ CD11b ^{тупой / -} клетки R1 экспресс высокого уровня аЕ интегрина, CD103, а также низкий уровень F4/80 (рис. 1Г). CD11b ^{+ +} CD11c клетки R2 состоит из обоих контроллеров домена и макрофагов на основе их дихотомического выражение CD103 и F4/80 (рис. 1 полугодие). Наконец, CD11b ⁺ CD11c ^{тупой / -} клетки макрофаги R3 составляют на основе фенотипических профиля F4/80 ⁺ и CD103 ^- (рис. 1I) ^16.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1. Память стратегии кишечного ДК и макрофагов. Мертвые клетки (А) и дублеты (B и C) впервые были исключены из анализа, а затем небольшой intestiNAL клетки закрытого соответственно вперед и стороной рассеяния (D), и БТР были определены как CD45 ^{+ B +} IA (E). Макрофагов и ДК были определены по выражению CD11b и CD11c (F). CD103 и F4/80 выражение для клетки предварительно закрытый на R1 (G), R2 (H) и R3 (I) населения была проанализирована.

Рисунок 2. Выход клеток и антител, качество окрашивания зависит от пищеварения времени. CD11b и CD11c окрашиванием и общий выход ячейки под-(A, D), оптимально (B, E) или по-перевариваются (C, F) ткани кишечника.

Кишечные клетки были выделены из C57BL / 6 мышей тонкой кишки и ДК и макрофаги были проанализированы FACS на BD LSR II. Напряжения и компенсации были установлены с помощью безупречной и один флуорохромом окрашенных спленоцитов. Мертвые клетки (рис. 1А) и дублеты (рис. 1B и C) впервые были исключены изанализа. Клетки интерес затем анализируются в соответствии с передней и боковой рассеяния (рис. 1D), а затем стробирования на CD45 ⁺ и И.А. ^{б +} клеток (рис. 1д). После этого CD11b и CD11c выражение оценивается среди CD45 ⁺ И.А. ^{б +} клеток очертить трех регионах (R1, R2 и R3,. Рис 1F). CD103 и F4/80 выражение в трех регионах была оценена провести различие между ДК и макрофагов, соответственно. CD11c ⁺ CD11b ^{тупой / -} клетки R1 выразили высокий уровень аЕ интегрина, CD103, а также низкий уровень F4/80 (рис. 1Г). CD11b ^{+ +} CD11c клетки R2 были составлены как контроллеры домена и макрофагов на основе их дихотомического выражение CD103 и F4/80 (рис. 1 полугодие), а CD11b ⁺ CD11c ^{тупой / -} клетки макрофаги R3 представляет собой основанный на фенотипические профиля F4 / 80 ⁺ и CD103 ^- ( 16. Макрофаги в ворота R2 и макрофагов в ворота R3 имеют аналогичные свойства вперед и стороной разброс и различаются по CD11c выражения. Функциональные дихотомии этих подмножеств остается полностью поняты.

Отношения между продолжительностью ткани пищеварения на общий выход ячейки и выражение CD11b и CD11c показано на рисунке 2. Кишечные ткань, которая переваривается в течение 3 минут (под-пищеварение) дает низкий общего числа клеток (рис. 2) и, следовательно, несколько контроллеров домена и макрофагов для характеристики (рис. 2). Ткань для пищеварения 11 мин производится надежный выход из живых клеток (рис. 2Е) с населением домена и макрофагов, что выражается высоким уровнем CD11b и CD11c и фенотипически различны (рис. 2). В отличие от пищеварения в течение 50 минут (по-пищеварение) в результате аналогичного выход ячейки при сотрудничествеmpared оптимизированной пищеварения (рис. 2Е и F), однако, разграничение различных клеточных популяций использованием CD11b и CD11c стал более темным, как выражение CD11c уменьшение (рис. 2) и число погибших клеток увеличивалось (данные не представлены).

Рисунок 3. Факторы, важные для оптимизации выхода клеток и экспрессия поверхностных антигенов. Выход клеток и экспрессия поверхностных антигенов напрямую зависят от продолжительности ткани пищеварения, специфику коллагеназы, степень измельчения ткани, а также наличие или отсутствие воспаления, которые могут повлиять на целостность тканей и клеточного. Длительное пищеварения ткани может привести к снижению жизнеспособности клеток и экспрессии поверхностного антигена в то время как недостаточное переваривание тканей может привести к недостаточности клеток для анализа.

Здесь мы подробно методику для быстрого выделения мышью кишечного домена и макрофагов на фенотипические характеристики использованием многоцветной проточной цитометрии и обогащения с использованием MACS бисером и сортировки клеток для проведения функциональных исследований на очищенную клеток. Оптимизация концентрации коллагеназыи продолжительность ткани пищеварения необходимо производить надежные выход клетки без ущерба для жизнеспособности и выражение поверхностного антигена. Заместитель пищеварения приводит к низкой общего числа клеток и нехватка домена и макрофагов для характеристики (рис. 2 и D). С другой стороны, чрезмерная пищеварения дает общего числа клеток похож на оптимальных условиях (рис. 2F), но число погибших клеток значительно увеличился (данные не представлены) и качество окраски находится под угрозой. Подобный под-пищеварение, по-переваривание тканей усложнит фенотипические характеристики и очистки.

Несколько дополнительных параметров для рассмотрения с помощью этого протокола являются производитель, тип и конкретной партии коллагеназы, целостность и клеточности кишечника, а степень измельчения ткани. Как различия в активности коллагеназы могут существовать между различными производителями, типа коллагеназы, а вот производствотс, потенции пищеварения могут значительно варьироваться, и требует оптимизации. Таким образом, выбор наиболее подходящего типа коллагеназы имеет решающее значение при разработке эксперимента, как качество и воспроизводимость данных могут быть затронуты. По нашему опыту, коллагеназы тип VIII получил от Sigma-Aldrich предоставила наилучшие результаты, однако, мы также имели успех, используя коллагеназы тип IV от Sigma-Aldrich.

Хотя приведенные выше подробный протокол был оптимизирован для использования на здоровую тонкого и толстого кишечника, она может быть успешно использован для изоляции домена и макрофаги из воспаленных тканей выставке повышения клеточного и архитектурных искажений, связанных с воспалением. Наличие воспаления кишечника может значительно влиять на скорость пищеварения, часто повышая чувствительность кишечных тканей к действию протеолитических ферментов, основанный на нашем опыте. Таким образом, продолжительность пищеварения или concentratioп коллагеназы должны быть адаптированы в соответствии с изменениями в целостности тканей, связанных с воспалением.

Кроме того, степень измельчения ткани влияет на продолжительность ткани пищеварения. Измельчение ткани на более мелкие куски увеличивает площадь поверхности для пищеварения и дает больше клеток, но меры предосторожности должны быть приняты, так как ткани могут быть более восприимчивы к чрезмерной пищеварения. Следовательно, продолжительность пищеварения, возможно, придется быть уменьшена. В отличие от бедных мясорубки приведет больших кусков ткани, которые будут плохо переваривается в результате низкой совокупной доходности клетки. Увеличение длительности пищеварения могут компенсировать плохие мясорубки до некоторой степени.

После оптимизации параметров для кишечного пищеварения ткани коллагеназы, надежный выход ячейки может быть быстро достигнуто. В результате, кишечная DC и макрофагов населения может быть более точно охарактеризовать и очищается для функциональных исследований для оценки цитокиновпроизводство, презентации антигена, а также регулирование иммунных клеток.