Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

1. Dissecção e dissociação das células epiteliais intestinais

Preparação de reagentes e equipamento:

• Quente Ca ^{2 +} / ^{Mg2 +} livre de PBS (CMF PBS) à temperatura ambiente.
• Ca quente ^{2 +} / Mg ^{+ 2-free} HBSS com FBS a 5% (CMF HBSS / FBS) e EDTA 2 mM à temperatura ambiente.
• Quente agitador orbital a 37 ° C.

Nota: Os passos 1,1 a 1,7 deve ser realizado tão rapidamente quanto possível para minimizar o grau de morte celular e para atingir o rendimento máximo de célula.

1. Euthanize ratos em uma câmara de CO ₂ e etanol spray de 70% sobre o abdômen e tórax.
2. Fazer uma pequena incisão horizontal no meio do abdómen com uma tesoura e retirar a pele para expor o peritoneu.
3. Continuar a separar o estômago do intestino delgado superior, cortando no esfíncter pilórico. Tease longe do mesentério com uma pinça e cortar novamentea válvula íleo-cecal para libertar todo o intestino pequeno a partir do intestino grosso. Faça um corte na borda anal e novamente provocar uma separação do mesentério até o intestino grosso é gratuito.
4. Corte abrir o cólon longitudinalmente com tesoura e lave conteúdo fecal e muco do lúmen intestinal em CMF PBS à temperatura ambiente.
5. Use tesouras e pinças para dissecar macroscopicamente placas de Peyer ao longo da superfície anti-mesentérica do intestino delgado e cortado e aberto no intestino delgado longitudinalmente.
6. Lave as lumen do intestino delgado de conteúdos fecais e muco em CMF PBS à temperatura ambiente.
7. Separadamente cortar o intestino delgado / grande em aproximadamente 1,5 cm pedaços e colocá-las separadas tubos de 50 ml cónico contendo 30 ml de pré-aquecida CMF HBSS / FBS e 2 mM de EDTA. Não adicione mais de 1 intestino por 50 tubo ml.
8. Horizontalmente colocar cada tubo cónico de 50 ml em um agitador orbital e agitar durante a 250 rpm durante 20 min a 37 ° C. </ Li>
9. Coloque um coador de malha de arame única ao longo de um balde de resíduos e despejar o conteúdo de cada tubo cónico de 50 ml através de recuperar os pedaços de 1,5 cm de intestino e colocá-los em separadas de 50 ml contendo tubos cónicos de 30 ml de pré-aquecidos CHBSS / FBS com 2 mM de EDTA.
10. Repita 1,8.

2. A digestão do tecido e isolamento de células intestinais

Preparações de reagentes e equipamento:

• Solução de colagenase: 1,5 mg / ml Tipo VIII colagenase dissolvido em pré-aquecida CMF HBSS / FBS com 40 ug / ml de DNase I.
• Pré-aquecida CMF HBSS / FBS e 2 mM de EDTA.
• Pré-aquecida agitador orbital a 37 ° C.
• Ice-frio CMF HBSS / FBS.

1. Após a segunda rodada de agitação, despejar o conteúdo de cada tubo cónico de 50 ml através do filtro e transferir 1,5 cm pedaços de intestino de um plástico pequeno barco pesar depois esfregando afastado o excesso de mídia, utilizando uma toalha de papel.
2. Rapidamente mediu a 1.5 Peças cm de intestino usando tesouras directamente no barco peso e adicionar intestino picada a 20 ml de solução de colagenase. Horizontalmente colocar cada tubo cónico de 50 ml em um agitador orbital e digerir a 200 rpm durante 10-20 min a 37 ° C. Favor ver discussão abaixo em relação optimização.
3. Resumidamente vórtice para assegurar a dissociação completa de qualquer tecido restante intestinal e filtrar através de um coador de célula 100 uM directamente num tubo cónico de 50 ml.
4. Top fora de cada tubo cónico de 50 ml com CMF HBSS / FBS e centrifugar a 1500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Se um sedimento sólido não é observado para as amostras de cólon depois da centrifugação, as amostras devem ser novamente centrifugado durante 3,5 min. Repetir este passo de lavagem mais uma vez.
5. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em HBSS CMF gelada / FBS e amostras de colocar no gelo.
6. Vá para a Seção 3 para aquisição FACS / análise ou na Seção 4 para magnética talão de enriquecimento para alta velocidade célula Sórting.

3. Coloração do anticorpo para Multi-Color citometria de fluxo e DCs e macrófagos

Preparações de reagentes e equipamento:

• Ice-frio CMF PBS.
• Tampão gelado de coloração (CMF PBS + 5% de FBS).
• Prepare célula morta mancha na gelada CMF PBS a diluição 1:1000 utilizando VIVO / MORTO fixável do Aqua Kit Dead Cell Stain.
• Preparar o cocktail de coloração de anticorpo, adicionando os seguintes fluorescência-rotulados anticorpos monoclonais (mAbs) para o tampão gelado de coloração: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA ^b)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.

1. Transferir as células em um ml de poliestireno 5 de fundo redondo de tubo (FACS).
2. Lave as células duas vezes em gelada CMF PBS.
3. Incubar as amostras com célula morta mancha durante 15 min em gelo, no escuro.
4. Lave as células duas vezes em gelada CMF PBS.
5. Bloco com células anti-FcγRIII/II 2.4G2 na gelada coloraçãotampão durante 10 min em gelo.
6. Lave as células em tampão gelado de coloração.
7. Incubar as amostras com cocktail de anticorpos de coloração durante 20 min em gelo, no escuro.
8. Lave as células com tampão gelado de coloração duas vezes e ressuspender as amostras em 400 uL de tampão gelado de coloração e passar através de 40 uM tampa de filtro em tubos de FACS.
9. Adquirir amostras em LSR II citómetro (BD), definidas pela estratégia de propagação na Seção 5 e Figura 1.

4. Enriquecimento de DCs e macrófagos do Intestino

Preparações de reagentes e equipamento:

• Tampão gelado de coloração (CMF PBS + 5% de FBS).

1. Incubar única suspensão celular obtida a partir do passo 2.5 com CD11b e grânulos CD11c MACS de acordo com as instruções do fabricante.
2. Lave as células com tampão gelado de coloração seguido de centrifugação.
3. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão de coloração geladae passar através de um filtro de células de 100 um seguido de um filtro de célula 40 uM.
4. Enriqueça para magnéticos talão inscritos células por seleção positiva usando MACS coluna LS magnético.
5. Repita o passo 4,2 e elimine o sobrenadante.
6. Incubar as células com mAbs de superfície do marcador, como descrito no passo 3.7.
7. Lavar magnéticos grânulo enriquecidas células duas vezes com tampão gelado de coloração. Ressuspender sedimentos celulares em 500 uL de tampão de coloração gelada sem azida de sódio, e passar através do filtro 40 uM de células para um tubo de FACS.
8. Vá para a FACS-ordenação no separador de células BD ARIA II para classificar DC intestinal e / ou subconjuntos de macrófagos de interesse.

5. Estratégia para Gating LP APCs

Nota: Note-se que as células intestinais não coradas pode ser utilizado como um controlo negativo para ajudar na colocação adequada das portas para separar as populações positivas e negativas.

1. Como mostrado na Figura1, criar um gráfico de pontos e não incluem células que são positivas para a célula morta mancha (Fig. 1A), seguido pela exclusão de eventos dupleto (Fig. 1B e C). Então, a porta sobre as células de interesse de acordo com a encaminhar e dispersão lateral certificando-se de excluir os detritos (Fig. 1D).
2. Criar um outro lote de ponto e portão mais adiante CD45 ⁺ e ^{+ b} IA células, o que caracteriza fenotipicamente APCs (Fig. 1E).
3. Em um gráfico de pontos separados, para analisar CD11b e expressão CD11c para distinguir DC específico e subconjuntos de macrófagos (R1, R2, e R3;. Fig. 1F). Células de R1 são CD11c ⁺ CD11b ^{maçantes / -} células. A região, R2, é delineada de tal modo que estas células têm níveis semelhantes de expressão de superfície para CD11c como em células de R1 mas as células de R2 também expressa CD11b. Depois disso, a região R3 é designada para as células que são CD11b ⁺ e CD11c ^{opaca / -.}
4. Umalyze regiões R1, R2, e de expressão adicional para F4/80 e CD103 R3 para diferenciar macrófagos e as populações de CC, respectivamente. O CD11c ⁺ CD11b ^{opaca / -} células de níveis elevados de R1 expressas a integrina αE, CD103, e baixos níveis de F4/80 (Fig. 1G). CD11b ^{+ +} CD11c células de R2 são compostos de ambos os DCs e macrófagos com base na sua expressão dicotômica de CD103 e F4/80 (Fig. 1H). Por último, CD11b ⁺ CD11c ^{baços / -} células de R3 constituem macrófagos com base no perfil fenotípica de F4/80 ⁺ e CD103 ^- (Fig. 1I) ^16.

6. Os resultados representativos

Figura 1. Estratégia gating para DCs intestinais e macrófagos. Células mortas (A) e dupletos (B e C) foram primeiro excluídos da análise e, em seguida intesti pequenaAs células foram nal gated em conformidade para transmitir e do lado de dispersão (D), e APCs foram definidos como CD45 ⁺ IA ^{b +} (E). Os macrófagos e DCs foram identificados pela expressão de CD11b e CD11c (F). CD103 e F4/80 expressão para células pré-gated em R1 (G), R2 (H) e R3 (I) populações foi analisada.

Figura 2. Rendimento celular e de qualidade de coloração de anticorpo depende do tempo de digestão. CD11b e padrão de coloração CD11c e rendimento celular total de sob-(A, D), optimamente-(B, E) ou sobre-digerido (C, F) de tecido intestinal.

As células intestinais foram isoladas a partir de um intestino C57BL / 6 pequeno rato e DCs e macrófagos foram analisadas por FACS sobre o LSR BD II. Tensão e compensação foram criados usando imaculado e único fluorocromo manchadas de esplenócitos. As células mortas (Fig. 1A) e dupletos (Fig. 1B e C) foram excluídos da primeiraa análise. Células de interesse foram então analisados ​​de acordo com a transmitir e do lado de dispersão (Fig. 1D), seguido por gating em CD45 ⁺ e IA ^{b +} células (Fig. 1E). Posteriormente, CD11b e expressão CD11c foi avaliada entre o CD45 ^{+ b +} células IA para delinear três regiões (R1, R2, e R3;. Fig. 1F). CD103 e F4/80 expressão nas três regiões foi avaliada para distinguir entre DCs e macrófagos, respectivamente. O CD11c ⁺ CD11b ^{/ aborrecido -} células de R1 expressa níveis elevados da integrina αE, CD103, e baixos níveis de F4/80 (Fig. 1G). CD11b ^{+ +} CD11c células de R2 foram compostas de ambos os DCs e macrófagos com base na sua expressão dicotômica de CD103 e F4/80 (Fig. 1H), enquanto CD11b ^{+ de} CD11c ^{baços / -} células de R3 constituem macrófagos com base no perfil fenotípica de F4 / 80 ⁺ e CD103 ^- ( 16. Macrófagos dentro do portão R2 e macrófagos no portão R3 têm a frente semelhante e propriedades de dispersão laterais e são distinguíveis por expressão CD11c. A dicotomia funcional desses subconjuntos permanece incompletamente compreendida.

A relação entre a duração da digestão do tecido sobre o rendimento de total de células e expressão de CD11b e CD11c é ilustrado na Figura 2. Tecido intestinal que foi digerido durante 3 min (sob a digestão-) rendeu o número de células total baixo (Fig. 2D) e DCS assim poucos e macrófagos disponíveis para a caracterização (Fig. 2A). Digestão de tecido para 11 min produziu um rendimento robusto de células vivas (fig. 2E) com populações de DCs e macrófagos que expressavam níveis elevados de CD11b e CD11c e foram fenotipicamente distinta (Fig. 2C). Em contraste, a digestão durante 50 min (mais de digestão-) resultou num rendimento celular semelhante, quando compared à digestão optimizado (2E Fig. e F), no entanto, o delineamento da populações de células diferentes, utilizando CD11b e CD11c tornou-se mais obscura como a expressão de diminuída CD11c (Fig. 2C) e do número de células mortas aumentada (dados não mostrados).

Figura 3. Factores importantes para a optimização do rendimento celular e de expressão antigénio de superfície. Rendimento celular e de expressão antigénio de superfície estão directamente afectada pela duração da digestão do tecido, as características específicas da colagenase, o grau de tecido picagem, ea presença ou ausência de inflamação, o que pode afetar a integridade dos tecidos e celularidade. Digestão prolongada dos tecidos pode resultar em viabilidade celular diminuiu e expressão antigénio de superfície, enquanto a digestão do tecido inadequado pode resultar em uma escassez de células para análise.

Aqui, detalhou uma metodologia para o isolamento rápido de DCs e macrófagos intestinais do rato para a caracterização fenotípica utilizando multi-cor citometria de fluxo e para o enriquecimento usando Macs contas e classificação celular para realizar estudos funcionais em células purificadas. Optimizar a concentração de colagenaseea duração da digestão do tecido é necessária para produzir um rendimento celular, sem comprometer a viabilidade robusto e expressão antigénio de superfície. Sob-digestão produz um número de células total baixo e uma escassez de DCs e macrófagos para a caracterização (Fig. 2A e D). Por outro lado, ao longo de digestão-produz um número total de células semelhantes às condições optimizadas (Fig. 2F), mas o número de células mortas são sensivelmente aumentado (dados não mostrados) ea qualidade da coloração é comprometida. Semelhante ao sob-digestão, a sobre-digestão de tecido complicaria caracterização fenotípica e purificação.

Vários parâmetros adicionais para consideração utilizando este protocolo, o fabricante, o tipo ea lote específico de colagenase, a integridade e celularidade do intestino, e do grau de tecido picagem. Como variabilidade na atividade da colagenase pode existir entre diferentes fabricantes, tipos de colagenase, e eis produçãots, a potência da digestão pode variar grandemente e requer optimização. Assim, a selecção do tipo mais adequado de colagenase é crítica na concepção de um experimento como a qualidade ea reprodutibilidade dos dados pode ser afectada. Em nossa experiência, colagenase tipo VIII obtidos da Sigma-Aldrich tem proporcionado os melhores resultados, no entanto, também tivemos sucesso com colagenase tipo IV da Sigma-Aldrich.

Enquanto o protocolo acima detalhada foi optimizado para utilização em saudáveis ​​intestinos delgado e grosso, ele pode ser utilizado com sucesso para o isolamento de DCs e macrófagos de tecido inflamado exibem aumento da celularidade e distorção arquitectónico associada com a inflamação. A presença de inflamação intestinal pode afectar dramaticamente a taxa de digestão, muitas vezes o aumento da sensibilidade do tecido intestinal para a acção de enzimas proteolíticas com base na nossa experiência. Portanto, a duração da digestão ou da concentration de colagenase deve ser adaptada de acordo com alterações na integridade do tecido associadas com inflamação.

Além disso, o grau de tecido por picagem irá afectar a duração da digestão do tecido. O tecido picar em pedaços menores aumenta a área de superfície para a digestão e produz mais células, mas as precauções devem ser tomadas, como o tecido pode ser mais suscetível a mais de digestão. Consequentemente, a duração da digestão pode ter de ser diminuída. Em contraste, picagem pobre irá resultar em pedaços maiores de tecido que irá digerir mal resultando num rendimento de célula total baixo. O aumento da duração da digestão pode compensar picagem pobre em certa medida.

Após a optimizar os parâmetros para a digestão de tecido intestinal com colagenase, um rendimento celular robusto pode ser rapidamente conseguida. Como resultado, DC intestinal e populações de macrófagos pode ser caracterizado de forma mais precisa e purificada para estudos funcionais para avaliar citocinaprodução, apresentação de antígenos, ea regulação das células imunes.