Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

1. Dissectie en Dissociatie van darmepitheelcellen

Voorbereiding van de reagentia en apparatuur:

• Warm ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +-vrij} PBS (CMF PBS) tot kamertemperatuur.
• Warm ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +-vrij} HBSS met 5% FBS (CMF HBSS / FBS) en 2 mM EDTA tot kamertemperatuur.
• Warm Orbital Shaker tot 37 ° C.

Opmerking: Stap 1,1 tot 1,7 worden uitgevoerd zo snel mogelijk de mate van celdood te minimaliseren en om een maximale cel opbrengst.

1. Euthanaseren muizen in een CO ₂ kamer en spuit 70% ethanol op de buik en thorax.
2. Maak een kleine horizontale incisie in het midden van de buik met een schaar en pel de huid terug naar het buikvlies bloot te leggen.
3. Ga naar de maag te scheiden van de bovenste dunne darm door te snijden in de pyloric sluitspier. Tease weg het mesenterium met een pincet en snijd opnieuw bijde ileo-cecal klep om de gehele dunne darm te bevrijden van de dikke darm. Maak een snede in de anus en weer plagen elkaar het mesenterium tot de dikke darm is gratis.
4. Snijd de dikke darm lengterichting met een schaar en afwassen fecale inhoud en slijm uit het darmlumen in CMF PBS bij kamertemperatuur.
5. Gebruik een schaar en tang om macroscopisch ontleden van de plaques van Peyer langs de anti-mesenteriale oppervlak van de dunne darm en opengesneden de dunne darm lengterichting.
6. Was de dunne darm lumen die ontlasting en slijm in CMF PBS bij kamertemperatuur.
7. Afzonderlijk snijd de kleine / dikke darm in ongeveer 1,5 cm stukjes en doe ze in aparte 50 ml conische buizen met 30 ml van de voorverwarmde CMF HBSS / FBS en 2 mM EDTA. Voeg niet meer dan 1 darm per 50 ml conische buis.
8. Horizontale positie elk 50 ml conische buis in een orbitale schudder en schudden bij 250 rpm gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </ Li>
9. Plaats een gaas zeef boven een afvalbak emmer en giet de inhoud van elk 50 ml conische buis tot en met het 1,5 cm stukjes darm te herstellen en plaats ze in aparte 50 ml conische buizen met 30 ml van de voorverwarmde CHBSS / FBS met 2 mM EDTA.
10. Herhaal 1.8.

2. Tissue Spijsvertering en isolatie van darmcellen

De voorbereidingen van de reagentia en apparatuur:

• Collagenase oplossing: 1,5 mg / ml Type VIII Collagenase opgelost in voorverwarmde CMF HBSS / FBS met 40 ug / ml DNase I
• Voorverwarmde CMF HBSS / FBS en 2 mM EDTA.
• Voorverwarmde orbitale schudder bij 37 ° C.
• IJskoude CMF HBSS / FBS.

1. Na de tweede ronde van schudden, giet de inhoud van elk 50 ml conische buis door de zeef en over te dragen 1,5 cm stukjes darm naar een klein plastic wegen boot na deppen overtollige media met behulp van een papieren handdoek.
2. Snel gehakt van de 10,5 cm stukjes darm met een schaar direct in het gewicht van de boot en voeg gehakt darm tot 20 ml collagenase oplossing. Horizontaal te plaatsen elk 50 ml conische buis in een orbitale schudder en Digest bij 200 rpm gedurende 10-20 minuten bij 37 ° C. Zie discussie hieronder over optimalisatie.
3. Kort vortex grondig dissociatie van het resterende darmweefsel en filter zorgen door een 100 um zeef cel direct in een 50 ml conische buis.
4. Top off elke 50 ml conische buis met CMF HBSS / FBS en centrifugeer bij 1500 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Indien een vaste pellet niet waargenomen colon monsters na centrifugeren moeten de monsters opnieuw gecentrifugeerd gedurende 3,5 min. Herhaal wasstap weer.
5. Giet het supernatant en resuspendeer de celpellet in ijskoud CMF HBSS / FBS en plaats monsters op ijs.
6. Ga verder met sectie 3 voor FACS verwerving / analyse of Sectie 4 voor magnetische-kraal verrijking voor high-speed cell Sorting.

3. Antilichaam kleuring voor Multi-Color Flowcytometrische analyse van DCs en macrofagen

De voorbereidingen van de reagentia en apparatuur:

• IJskoude CMF PBS.
• Ice-koude vlekken buffer (CMF PBS + 5% FBS).
• Bereid dode cel vlek in ijskoud CMF PBS bij 1:1000 verdunning met Live / Dead Muur Aqua Dead Cell Stain Kit.
• Bereid het antilichaam kleuring cocktail door het toevoegen van de volgende fluorescentie-gelabelde monoklonale antilichamen (mAb's) om de ijskoude vlekken buffer: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA ^b)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.

1. Breng cellen in een 5 ml polystyreen rondbodemkolf (FACS) buis.
2. Twee keer wassen cellen in ijskoude CMF PBS.
3. Incubate monsters met dode cel kleuring gedurende 15 minuten op ijs in het donker.
4. Twee keer wassen cellen in ijskoude CMF PBS.
5. Blok cellen met 2.4G2 anti-FcγRIII/II in ijskoud vlekkenbuffer gedurende 10 min op ijs.
6. Was de cellen in ijskoude vlekken buffer.
7. Incubeer de monsters met een antilichaam kleuring cocktail voor 20 min op ijs in het donker.
8. Was de cellen met ijskoude vlekken buffer twee keer en opnieuw in suspensie monsters in 400 ul ijskoude vlekken buffer en passeren 40 urn filter dop op FACS buizen.
9. Verwerven van samples op LSR II cytometer (BD) zoals gedefinieerd door gating strategie van punt 5 en figuur 1.

4. Verrijking van DCs en macrofagen uit de darm

De voorbereidingen van de reagentia en apparatuur:

• Ice-koude vlekken buffer (CMF PBS + 5% FBS).

1. Incubeer enkele celsuspensie verkregen uit stap 2.5 met CD11b en CD11c MACS kralen volgens de instructies van de fabrikant.
2. Was cellen met ijskoude buffer kleuring gevolgd door centrifugatie.
3. Gooi supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml ijskoude vlekken bufferen passeren een 100 um zeef cel, gevolgd door een 40 urn cel zeef.
4. Verrijk voor magnetische kraal-aangehechte cellen door positieve selectie met MACS LS magnetische kolom.
5. Herhaal stap 4.2 en gooi supernatant.
6. Incubeer de cellen met een oppervlakte marker mAb's zoals beschreven in stap 3.7.
7. Twee keer wassen magnetische kraal verrijkte cellen met ijskoude vlekken buffer. Resuspenderen celpellets in 500 pL ijskoude vlekken buffer zonder natriumazide, en passeren 40 urn cel zeef in een FACS buis.
8. Ga verder met FACS-sortering van de BD ARIA II Cell Sorter voor intestinale DC en / of macrofagen subsets van belang te sorteren.

5. Gating-strategie voor LP APC's

Let op: Houd er rekening mee dat de ongekleurde intestinale cellen kunnen worden gebruikt als een negatieve controle om te helpen bij de juiste plaatsing van de poorten naar positieve en negatieve populaties te scheiden.

1. Zoals in figuur1, een dot plot en zijn inclusief alle cellen die positief zijn voor de doden cel vlek (Fig. 1A), gevolgd door de uitsluiting van doublet evenementen (afb. 1B en C). Dan hek aan de cellen van belang op basis van vooruit en zijwaartse verstrooiing en zorg ervoor dat vuil uit te sluiten (fig. 1D).
2. Maak nog een dot plot en verder hek aan CD45 ⁺ en IA ^{b +} cellen, die fenotypisch kenmerkt APC's (fig. 1E).
3. Op een aparte dot plot, analyseren CD11b en CD11c expressie van specifieke DC en macrofaag subsets (R1, R2, en R3.; Figuur 1F) te onderscheiden. Cellen van R1 zijn CD11c ⁺ CD11b ^{saai / -} cellen. De regio, R2, wordt afgebakend, zodanig dat deze cellen een vergelijkbaar niveau van oppervlakte-expressie hebben voor CD11c als in de cellen van R1, maar cellen van R2 ook de expliciete CD11b. Daarna wordt de R3 regio is voor cellen die CD11b ⁺ en CD11c ^{dof / -.}
4. Eenalyze regio's R1, R2, R3 en verder voor F4/80 en CD103 expressie macrofagen en DC populaties te onderscheiden, respectievelijk. De CD11c ⁺ CD11b ^{saai / -} cellen van R1 hebben hoge niveaus van de αE integrine, CD103 en een laag gehalte van F4/80 (fig. 1G). CD11b ⁺ CD11c ⁺ cellen van R2 zijn samengesteld uit zowel de DC's en macrofagen op basis van hun dichotome expressie van CD103 en F4/80 (fig. 1H). Ten slotte, CD11b ⁺ CD11c ^{saai / -} cellen van R3 vormen macrofagen op basis van de fenotypische profiel van F4/80 ⁺ en CD103 ^- (Fig. 1I) ^16.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1. Gating strategie voor intestinale DCs en macrofagen. Dead cellen (A) en doubletten (B en C) werd eerst uit de analyse en kleine darminterne cellen waren gated dienovereenkomstig door te sturen en zijwaartse verstrooiing (D) en APC's werden gedefinieerd als CD45 ⁺ IA ^{b +} (E). Macrofagen en DC's werden geïdentificeerd door de expressie van CD11b en CD11c (F). CD103 en F4/80 uitdrukking voor cellen pre-gated op R1 (G), R2 (H) en R3 (I) populaties werd geanalyseerd.

Figuur 2. Cel opbrengst en antilichaam vlekken kwaliteit hangt af van de spijsvertering tijd. CD11b en CD11c kleuringspatroon en de totale opbrengst van de cel onder-(A, D), optimaal-(B, E) of over-verteerd (C, F) darmweefsel.

Intestinale cellen werden geïsoleerd uit een C57BL / 6 muis dunne darm en DCs en macrofagen werden geanalyseerd door FACS op BD LSR II. Spanning en compensatie werden ingesteld met behulp van ongekleurde en single fluorochroom-gekleurde splenocyten. Dode cellen (Fig. 1A) en doubletten (Fig. 1B en C) werd eerst uitgeslotende analyse. Cellen van belang werden vervolgens geanalyseerd op basis van vooruit en zijwaartse verstrooiing (fig. 1D), gevolgd door gating op CD45 ⁺ en IA ^{b +} cellen (fig. 1E). Daarna CD11b en CD11c expressie werd gemeten onder de CD45 ⁺ IA ^{b +} cellen drie gebieden (R1, R2 en R3.; Figuur 1F) af te bakenen. CD103 en F4/80 uitdrukking in de drie regio's werd geëvalueerd om onderscheid te maken tussen DC's en macrofagen, respectievelijk. De CD11c ⁺ CD11b ^{saai / -} cellen van R1 uitgedrukt hoge niveaus van de αE integrine, CD103 en een laag gehalte van F4/80 (fig. 1G). CD11b ⁺ CD11c ⁺ cellen van R2 waren samengesteld uit zowel de DC's en macrofagen op basis van hun dichotome expressie van CD103 en F4/80 (fig. 1H), terwijl CD11b ⁺ CD11c ^{saai / -} cellen van R3 vormen macrofagen op basis van de fenotypische profiel van F4 / 80 ⁺ en CD103 ^- ( 16. Macrofagen in de R2-poort en macrofagen in de R3 poort hebben dezelfde voor-en zijwaartse verstrooiing eigenschappen en zijn te onderscheiden door CD11c expressie. De functionele tweedeling van deze subsets nog niet volledig begrepen.

De verhouding tussen de duur van weefsel afbraak van de totale opbrengst cel en de expressie van CD11b en CD11c is weergegeven in figuur 2. Darmweefsel dat was geknipt 3 min (onder-digestie) leverde lage totale aantal cellen (Fig. 2D) en dus weinig DCs en macrofagen voor karakterisering (Fig. 2A). Weefsel spijsvertering voor 11 minuten produceerde een robuuste opbrengst van levende cellen (fig. 2E) met een bevolking van DCs en macrofagen dat hoge niveaus van CD11b en CD11c uitgedrukt en waren fenotypisch verschillende (figuur 2C). Daarentegen destructie 50 min (over-digestie) resulteerde in een soortgelijke cel als opbrengst compared geoptimaliseerde digestie (Fig. 2E en F), maar afbakening van verschillende celpopulaties met CD11b en CD11c werd onbekende de expressie van CD11c verminderde (Fig. 2C) en het aantal dode cellen verhoogd (data niet getoond).

Figuur 3. Factoren die belangrijk zijn voor het optimaliseren van cel-opbrengst en oppervlakte-antigeen expressie. Cell opbrengst en oppervlakte-antigeen expressie worden rechtstreeks beïnvloed door de duur van weefsel de spijsvertering, de specifieke kenmerken van de collagenase, de mate van weefsel hakken, en de aanwezigheid of afwezigheid van ontsteking, die van invloed kunnen weefsel integriteit en cellulariteit. Langdurige weefsel afbraak kan een verminderde levensvatbaarheid van de cellen en oppervlakte antigen expressie terwijl onvoldoende weefsel afbraak kan leiden tot een gebrek aan cellen analyse.

Hier hebben we gedetailleerd een methode voor de snelle isolatie van de muis intestinale DCs en macrofagen voor fenotypische karakterisering met behulp van multi-color flow cytometrie en voor verrijking met behulp van MACS kralen en cel sortering tot functionele studies uit te voeren op gezuiverde cellen. Het optimaliseren van de concentratie van collagenaseen de duur van weefsel afbraak moet een robuuste celopbrengst produceren zonder levensvatbaarheid en oppervlakte antigen expressie. Onder-digestie levert een lage totale aantal cellen en een gebrek van DCs en macrofagen voor het karakteriseren (Fig. 2A en D). Anderzijds, over-digestie levert een totale aantal cellen vergelijkbaar geoptimaliseerde condities (fig. 2F), maar het aantal dode cellen aanzienlijk verhoogd (gegevens niet getoond) en de kwaliteit van de kleuring wordt aangetast. Net als onder-vergisting, zou de over-vergisting van weefsel compliceren fenotypische karakterisering en zuivering.

Een aantal extra parameters, welke het gebruik van dit protocol zijn de fabrikant, het type en specifieke partij van collagenase, de integriteit en de celeigenschappen van de darm, en de mate van weefsel wordt gehakt. Als variatie in collagenase-activiteit kunnen bestaan ​​tussen verschillende fabrikanten, soorten collagenase, en de productie Lots, de sterkte van de spijsvertering kan sterk variëren en vereist optimalisatie. Vandaar dat de selectie van de meest geschikte vorm van collagenase is van cruciaal belang bij het ontwerpen van een experiment als de kwaliteit en de reproduceerbaarheid van de gegevens kan worden beïnvloed. In onze ervaring, collagenase type VIII verkregen van Sigma-Aldrich heeft de beste resultaten met dien verstande echter hebben we ook succes gehad met collagenase type IV van Sigma-Aldrich.

Hoewel de hierboven genoemde protocol is geoptimaliseerd voor gezonde kleine en grote darmen, kan met succes worden toegepast voor de isolatie van DCs en macrofagen ontstoken weefsel vertonen verhoogde cellulariteit en bouwkundige vervorming geassocieerd met ontsteking. De aanwezigheid van intestinale ontsteking kan dramatisch effect op de snelheid van de spijsvertering-vaak het verhogen van de gevoeligheid van het darmweefsel bij de actie van proteolytische enzymen op basis van onze ervaring. Daarom de vertering of concentration van collagenase moet worden aangepast aan veranderingen in weefselintegriteit geassocieerd met ontsteking.

Bovendien zal de mate van hakken het weefsel invloed op de duur van weefsel spijsvertering. Hakken het weefsel in kleinere stukken verhoogt de oppervlakte voor de spijsvertering en geeft meer cellen, maar voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, omdat het weefsel kunnen gevoeliger zijn om over-vergisting. Bijgevolg kan de vertering moeten worden verlaagd. Daarentegen zal een slechte hakken leiden tot een grotere stukjes weefsel die zal verteren slecht wat resulteert in een laag totaal cel opbrengst. Verhoging de vertering kan voor gebrek hakken zekere mate.

Bij optimalisatie van de parameters voor darmweefsel digestie met collagenase, een robuuste celopbrengst snel gebeuren. Hierdoor kan intestinale DC populaties en macrofaag beter worden gekarakteriseerd en gezuiverd voor functionele studies cytokine beoordelenproductie, antigeen presentatie, en de regulering van immuuncellen.