Одноместный мутагенеза бисульфит ооцитов

День 1

Подготовьте следующие решения свежий в день яйцеклетки коллекции стерильной дистиллированной воды, таких как вода GIBCO. Чтобы снизить вероятность загрязнения ДНК, изменить перчатки часто и использовать фильтр советы. Хранить трубы под углом же, когда открыты, и резюмировать все трубы, когда они не используются. Мы рекомендуем, что решения принимаются, как N +1.

3% агарозном LMP

30 мг низкую температуру плавления (LMP) агарозном
до 1 мл GIBCO H ₂ O
растворяют при 70 ° C

Лизис решения

8 мкл буфера для лизиса
1 мкл протеиназы К
1 мкл 10% Igepal
место на льду, пока готов к использованию

2:01 агарозы: Лизис решения (10 мкл в отдельные ооциты, сумма составляет 3 ооцитов)

20 мкл 3% агарозном LMP
10 мкл Решение Лизис
смешивать при 70 ° C

SDS LySIS буфера (501 мкл на отдельные ооциты)

1. Коллекция ооцитов

1. Поместите мышь расчлененный яйцеводы в М2 средства массовой информации, и разорвать ампулы для извлечения комплекса кучевые клетки.
2. Отделите от ооцитов комплекса кучевые ячейки с помощью 0,3 мг / мл в растворе гиалуронидазы 30 мкл капли M2 СМИ. Держите ооцитов в раствор до тех пор, как он принимает, чтобы удалить клетки кумулюса, как длительное воздействие может повредить их. Промойте ооциты 3 раза в 30 мкл капли M2 средств массовой информации, удаление клеток кумулюса периодически.
3. Удалить зона pellucida использовании решение кислой Тирода. Поместите ооцитов в одном 30 мкл каплю раствора, а затем передать еще 30мкл капли, как и любые средства массовой информации осуществляется по будет разбавить кислоту и снижая ее эффективность. Держите ооцитов в раствор до тех пор, как он принимает, чтобы удалить зона, так как длительное воздействие может повредить их. Примечание: повышение концентрации раствора кислой Тирода или проназой могут быть использованы для человека образцов, как человеческая зона pellucida более устойчивы к лечению раствором кислого Тирода, чем мышь.
4. Промойте ооциты еще раз в 30 мкл капли M2 СМИ.

2. Агарозном вложения и Лизис

1. Для выполнения агарозном вложение, поместите лизиса решение на 70 ° C heatblock. Добавить предварительно разогретой LMP агарозном к лизису решение, производя 2:1 агарозы: лизис решение.
2. Положите одну яйцеклетку на чистое предметное стекло в минимальных M2 СМИ. Возьмите 10 мкл агарозы: лизис решение в кончике пипетки, и (под микроскопом) мягко исключить небольшое количество (~ 1 мкл или менее) на стекло, что позволяет ему общаться с минимдр. СМИ. Аккуратно поднимите яйцеклетки в кончике пипетки и поставить все 10 мкл в пробирку Эппендорфа 300 мкл минерального масла, так что шарик образует сферу.
   Примечание: этот процесс должно быть сделано достаточно быстро, как агароза затвердеет, если температура падает всего на 5 ° C ниже 70 ° С.
3. Инкубируйте пробирку на льду в течение 10 минут. Для выполнения лизис, удалить 300 мкл минерального масла и добавить 500 мкл буфера для лизиса SDS. Выдержите в течение ночи в 50 ° С на водяной бане.
   Примечание: Лизис решения (табл. 1) также может быть использована для этой цели.

ДЕНЬ 2

Подготовьте следующие решения свежий в день бисульфит мутагенеза. Чтобы уменьшить возможность загрязнения ДНК, изменить перчатки часто и использовать фильтр советы. Хранить трубы под углом же, когда открыты, и резюмировать все трубы, когда они не используются. Мы рекомендуем, что решения принимаются, как N +1.

2,5 М бисульфит решение

1. 3,8 г бисульфита натрия
   5,5 мл дистиллированной GIBCO H ₂ O
   1 мл 3 М NaOH
   растворяться @ комнатной температуре
2. 110 мг гидрохинона
   1 мл дистиллированной GIBCO H ₂ O
   растворяют при 90 ° C (только до тех пор, как это имеет распустить, смешать регулярно)

Когда полностью растворяются, перемешать раствор (а) и (б)
* Хранить вдали от света *

3. Бисульфит мутагенеза

1. Полностью удалить 500 мкл лизис SDS буфера и добавить 300 мкл минерального масла (~ 20 часов). Любой лизис буфера остальных будут разводить йэлектронной агарозы, когда он нагревается и шарик будет более восприимчива к растворению в последующих шагах. Продолжайте бисульфит мутагенеза немедленно или хранить при -20 ° C в течение 5 дней.
2. Если возможно, удалите ооцитов из морозильной камеры и пусть оттепели (только до агарозном шарика относительно полупрозрачного). Выдержите в течение 2,5 минут на 90 ° C тепла блока, после чего инкубировать на льду в течение 10 минут.
   Примечание: Не смешивать или пошевелиться, расширить более 2,5 минут, или колебаться температура.
3. Для выполнения денатурации, удалить минеральные масла и добавьте 1 мл 0,1 М NaOH в каждую пробирку, фильм и перевернуть 5-6 раза.
4. Инкубировать 15 минут при 37 ° С водяной бане, переворачивая каждые 3-4 минут. Бусинка должна плавать в NaOH.
5. Для выполнения бисульфит лечения, вращать трубку осторожно, а затем удалить NaOH и добавляют 300 мкл минерального масла и 500 мкл раствора бисульфита. Инкубируйте пробирку в течение 3,5 часов в 50 ° С водяной бане. * Хранить вдали от света * Примечание: Время инкубации, возможно, придется эмпирически для гена.
6. Для выполнения desulfonation, инкубировать на льду в течение 3 минут, затем снимите нефтепродуктов и бисульфит решение, спина слегка и добавьте 1 мл 0,3 М NaOH. Флик и перевернуть 5-6 раза.
7. Инкубировать 15 минут при 37 ° С водяной бане, переворачивая каждые 3-4 минут. Бусинка должна плавать в NaOH.
8. Вымойте образцы, сначала вращается мягко, а затем удалить NaOH и добавляют 1 мл 1x TE рН 7,5. Встряхните в течение 5-10 минут при комнатной температуре (на качалке). Спиновая мягко снова, а затем удалить 1x TE. Повторите этот процесс стирки в два раза.
9. Добавить 1 мл автоклавного DDH ₂ O. Встряхните в течение 5-10 минут при комнатной температуре (на качалке). Спиновая осторожно, а затем удалить H ₂ O. Повторите DDH ₂ O мыть два раза.
10. Проверьте рН надосадочной, она должна быть рН 5,0. Если еще слишком основной, снова вымыть с H ₂ O. Удалите все супернатант, оставив только агарозном бытьобъявление.

4. ^1-й и ^2-го Круглого ПЦР-амплификации

1. Подготовка ^1-й раунд ПЦР смесь ** при мытье **

Добавить в Illustra прет-а-К Горячий старт ПЦР бисера
Аккуратно вставьте твердый шарик агарозы в ПЦР-пробирку (~ 10 мкл)
Нагреть до 70 ° C и смесь
Добавить 25 мкл минерального масла
Всего: 50 мкл

2. Усиливать
   Примечание: например, велосипедного условия для мыши Snrpn является денатурация в течение 2 минут при 94 ° С, после 40 циклов по 30 секунд при 94 ° С, 1 мин при 50 ° С, а 1минут при 68 ° C, а последние 10 минут шаг удлинение при 68 ° C. Отжиг температуре в течение ^{1-го тура} ПЦР для мыши H19 и Peg3 50 ° C.
3. Подготовка ^2-й раунд ПЦР смеси

Добавить в Illustra прет-а-К Горячий старт ПЦР бисера
Добавьте 5 мкл ^1-й Круглый продукт в качестве шаблона. Нагрейте ^1-й тур продукта до 70 ° С в течение 1 минуты, чтобы смягчить агарозы. Будьте уверены, чтобы пипеткой под слоем минерального масла.
Добавить 25 мкл минерального масла
Всего: 50 мкл

Примечание: Вложенные последовательности грунт для Snrpn, H19 и Peg3 может быть найдено в Маркет-Velker и др. ¹⁰12.

4. Усиливать
   Примечание: Велоспорт условия для мыши Snrpn является денатурация в течение 2 минут при 94 ° С, после 40 циклов по 30 секунд при 94 ° С, 1 мин при 50 ° С, а 1 минута при 68 ° C, а последние 10 минут удлинение шагом в 68 ° C ^10. Мышь H19 и Peg3 требуют 50 ° C температура отжига для ^{2-го тура} ПЦР.
5. В качестве диагностического теста, второй тур образцы могут быть сокращены с ограничением фермент, который является метилирование или деформации специфичны.

6. Electrophorese переваривания продуктов на 8% акриламида гель. Любые гетерогенные группы представляют собой более одного sequeNCE.

5. Т.А. Клонирование и колонии PCR

1. Чтобы клонировать ^{2-го тура} продукт, в первую тепла до 70 ° С в течение 1 минуты, чтобы смягчить агарозы, то перевязывать в вектора с использованием Promega pGEM-T векторные системы (Fisher Scientific Cat # A1360).

Инкубируйте ночь при 4 ° С в ПЦР машины.

2. Таяние компетентных клеток E.coli на льду в течение 15 минут (Zymo Research Corp Cat # T3009). Добавить 3 мкл реакции лигирования до 8 мкл E.coli и инкубировать перевязка на льду в течение 15 минут.
3. Теплового шока в течение 40 секунд в 42 ° С водяной бане,и инкубировать на льду в течение 2 минут. Добавить 60 мкл среды SOC и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 часа (в шейкере).
4. Поместите все в реакционной смеси на LB / Агар / IPTG / Xgal / Amp плиты и пластины инкубируют при температуре 37 ° С в течение ночи.
5. Подготовить смесь колонии PCR

Добавить 35 мкл колонии PCR Master Mix в ПЦР-пробирку. Выберите белый бактериальных колоний от пластины с кончика пипетки, и закружить в реакции ПЦР.

6. Усиление с денатурация в течение 10 минут при 94 ° C, а затем 30 циклов за 45 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 57 ° С, а 1 минута при 72 ° С, а последние 10 минут удлинение шагом в 72 ° C. Electrophorese 4 мкл на 1,5% агарозном геле. Отправить ~ 30 мкл продукта ПЦР для секвенирования.
   Примечание: Для ооцитов, 5 колонии PCR продукты последовательно.
7. После секвенирования результаты получаются, метилирования может быть прочитан. Любые оригинальные CG, которые остались в CG был метилированный, и любые оригинальные CG, что в настоящее время TG была неметилированной.

6. Представитель Результаты

В нашей работе мы запечатлены анализа метилирования в отдельных ооцитов и эмбрионов (рис. 1). После вложенный ПЦР использованием бисульфита превращается грунтовки, можно подтвердить успешный переход к визуализации правильный размер фрагмента на агарозном геле (рис. 2). Отдельные яйцеклеткипредставляет собой один родительский аллель, и в теории, имеет один запечатлел метилирования. Таким образом, второй раунд ПЦР-продукты могут быть проверены на непреднамеренного загрязнения. Рестрикции чувствительны к метилирования ДНК (например, HinfI или DpnII) могут быть использованы, чтобы переварить второй раунд ПЦР-продукт оценить, насколько он содержит метилированные или неметилированной аллели (рис. 3). Метилированных C в последовательности ферментов расщепляется признания в то время как неметилированной C, который преобразуется в T больше не признаются фермента и режиссерский. Любой образец MII яйцеклетки, содержащие как метилированные и неметилированной аллелей должны быть отброшены, так как это свидетельствует о кучевых клетки загрязнения (рис. 3). После перевязки и преобразования, успешно колонии ПЦР-амплификации могут быть визуализированы в агарозном геле для обеспечения образцы правильного размера продукта направляются для секвенирования (рис. 4). Наконец, последовательность из пяти отдельных слте из ооцитов MII должны произвести пять одинаковых моделей метилирования и одинаковые nonCpG конверсии (рис. 5а). Любые образцы, которые содержат более чем один шаблон должен быть уничтожен (рис. 5б). С овулировавших ооцитов MII два хромосомы копии или прилагаемой полярное тельце, есть возможность получения двух одинаковых моделей последовательность (рис. 5в). Мы рекомендуем отбросить данные из яйцеклеток, которые имеют весьма разнородные модели метилирование с загрязнением кучевые клетка не может быть исключена.

Рисунок 1. Схема единого анализа бисульфит мутагенеза яйцеклетки.

Рисунок 2. Представителю результаты ^{2-го тура} для усиления Snrpn от поютле MII ооцитов на 1,5% агарозном геле. Дорожки 1-4 четырех отдельных ооцитов MII и переулок 5 отрицательного контроля (не яйцеклетки). Ожидаемый размер ампликона Snrpn 420 базисных пунктов. L, лестницы.

Рисунок 3. Представитель результаты ^{2-го тура} метилирования конкретных ограничений для пищеварения Snrpn из одной яйцеклетки MII на 8% акриламида гель. HinfI диагностических пищеварения ограничение показывает неметилированной ДНК, которые таит в себе т, что отменяет ограничение сайта (420bp, переулок 1) или метилированных ДНК, которая содержится в C сайт узнавания (вырезать, 262, 103 и 54 б.п., дорожка 2). Пищеварение показывая и метилированных и неметилированной сайты рестрикции (сокращения и режиссерский полосы, полоса 3) свидетельствуют о кучевых загрязнения клетки. L, лестницы.

Рисунок 4. Snrpn из одной яйцеклетки MII на 1,5% агарозном геле. Ожидаемый размер ампликонов после перевязки Snrpn в pGEM-T Easy вектор и использовании M13 прямого и обратного праймеров составляет 656 базисных пунктов. Лейн 1-8 ампликонов из клонов 1-8. Клон 5 имеет неправильный размер ампликона и не должны быть направлены для секвенирования.

Рисунок 5. Представитель последовательности результатов Snrpn из одной яйцеклетки MII. Snrpn метилируется в ооциты. Черные кружки метилированных CpGs. Белые кружки неметилированной CpGs. CpG количество и расположение является репрезентативной для B6 деформация женских мыши. а) Ожидаемые результаты секвенирования Snrpn из одной яйцеклетки MII. Только одна нить ДНК должны усилить во всех пяти клонов. Яйцеклетки с одним метилирования и одинаковые, не CpG преобразования скороговоркойп. должны быть включены в анализ (процент конверсии, не CpGs указано право рассчитывался как количество не-CpG цитозина в тимин превращается в процентах от общего числа не-CpG цитозина). б) Последовательность результатов Snrpn из одной яйцеклетки MII с кучевые загрязнения клетки. Обратите внимание на различие между метилирование государства и преобразования модели указывает несколько усиление цепи. в) Последовательность результатов Snrpn из одной яйцеклетки MII с обеих хромосом копии или полярные включения тела.

Это один анализ ооцитов содержит много шагов, число которые имеют решающее значение и требуют особого ухода. Первый яйцеклетки стирки. Это особенно важно мыть каждую яйцеклетку несколько раз в свежей среде падает после гиалуронидазы лечение, чтобы удалить как многие клетки кучевые насколько это возможно. Кроме того, при передаче ооцитов к решению кислой Тирода для удаления зона pellucida убедиться, окружающая среда ясно клеток кумулюса. Ооцитов очень липкая после удаления зона, и любые окружающие клетки кучевые могут легко застрять в яйцеклетку. Это очень трудно удалить кучевые ячейки, которая прилипла к зона свободной яйцеклетки. Хотя этот протокол обеспечивает обнаружение кучевые загрязнения ячейки в более поздние моменты времени, это не конструктивно, ни экономических, пройти полный протокол о ооцитов, что, вероятно, будут отброшены.

Вторым важным шагом является яйцеклетки вложения. При внедрении яйцеклетки в агарозном и Лисимеет решение, важно отметить, что низкая температура плавления (LMP) агарозном застынет при температуре всего 5 ° C ниже 70 ° С. Таким образом, мы рекомендуем смешивания агарозы и лизис решение при 70 ° С, а затем размещение отдельных ооцитов на предметное стекло в минимальной среде. Когда готово, пипетки агарозы / лизис решение и внедрить в яйцеклетку подготовленную трубу Эппендорф в минеральном масле, при тщательном еще своевременно.

Очень важно, чтобы тепло инактивации протеиназы К проводиться при температуре 90 ° С в течение 2,5 минут. Отклонение от этого не рекомендуется. Более высокие температуры и более раз может привести к повреждению ДНК, в то время как низкие температуры или более короткое время не может инактивировать протеиназы К.

Напомним, бисульфит натрия и гидрохинон являются светочувствительные. Решения должны быть подготовлены, а затем завернуть в фольгу, янтарь труб и / или поместить в темный ящик до использования. После того, бисульфит решение было добавлено в тОн трубы, трубы должны быть покрыты пленкой или темным покрыты сумку, когда инкубации при температуре 50 ° C. Мы используем пустые мешки из фольги GE Healthcare, которая первоначально содержала горячий старт ПЦР бисера.

Наконец, как и большинство ПЦР, мы рекомендуем подготовке каждого тура в установленные сроки. Чрезмерные задержки, особенно после смешивания при 70 ° С, приведет к сокращению успеха усиления.

В настоящее время, одно ограничение протокола является то, что вероятность успеха бисульфит превращается амплификации ДНК из отдельных яйцеклеток варьируется от 40% до 65% в зависимости от фрагмента гена усиливается. В то время как дополнительные неисправностей может увеличить этот процент, есть компромисс между лечения бисульфит преобразования слишком длинные или жесткие и не имеющие достаточного коэффициент конверсии (> 85-90%). Вторым ограничением является то, что в настоящее время бисульфит мутагенеза не может отличить репрессивных 5-метилцитозин и деметилирования промежуточный 5-гиdroxymethylcytosine ^13.

Некоторые изменения могут потребоваться на основе гена или область интересов. Время бисульфит преобразования может потребоваться оптимизация для преобразования высокого процента с наименьшим повреждением ДНК. Мы предлагаем диапазон от 2,5 до 4 часов (половина шагом час) для бисульфит лечения. Дальнейшая оптимизация может включать в себя ПЦР-праймеров для преобразованных последовательностей интерес (например http://www.urogene.org/methprimer/ ), а также оптимизации программ на основе ПЦР-фрагмент длиной и CG контента (см. Patterson и соавт. для дополнительные бисульфит мутагенеза опции оптимизации ^7). Окончательное изменение в том, что гель добыча ^2-й раунд ПЦР продукта может потребоваться, если имеется много праймер-димеров или неспецифических ампликонов, что будет включать в вектор при клонировании.

Ранее нами было показано, что этаПротокол вступает в силу для отдельных ооцитов MII ^12. Мы также проверили его эффективность на растущих ооцитах на целый ряд различных диаметров ооцитов, с тем же ставкам, успешно усиления преобразуются ДНК. Важно отметить, что по сравнению с другими бисульфит мутагенеза процедур, которые не являются эффективными для метилирования исследования отдельной клетки, этот протокол позволяет анализа метилирования ДНК отдельных ооцитов и ранних эмбрионов. Это очень важно для репродуктивную систему и развитие исследований биологии, в частности, что касается манипуляций половых клеток и ранних эмбрионов. Будущие приложения могут включать в себя анализ моделей метилирования ДНК в отдельных клетках любого происхождения, в том числе в естественных производных и культуре клеток. Кроме того, мы разработали индивидуальный анализ бластоцисты, который восстанавливает ДНК и РНК из одного эмбриона, что позволяет для выражения и метилирования данные должны быть получены. Применения в будущем будет включать в себя изменения синглАнализ электронной яйцеклетки для восстановления РНК для выражения анализа, а также ДНК метилирование анализов. Другая оптимизация будет выполнять дуплекс тестов по той же яйцеклетки, подобные Эль-Хаджа и др. ^14, которые позволили бы метилирования обнаружения на соматически метилированный, ооцитов, эмбрионов unmethyated ген, позволяя тем самым обнаружение кучевые загрязнения клетки.

Анализ метилирования ДНК может колебаться от генома к локус-специфичным. Генома методы, такие как метилированные иммунопреципитации ДНК (MeDIP) в сочетании с микрочипов или последовательности обычно требуют обильного количества материалов. Локус-специфические методы, которые включают совместный анализ бисульфит ограничение (COBRA) с помощью метилирования-специфических ферментов ограничение или комплект MethylDetector (Active Motif), меньше оптимальной для одного анализа бластоцисты, в результате недостаточного восстановления ДНК, ПЦР предвзятость и отсутствие воспроизводимость. Альтернативный подход к одной яйцеклетки и электроннойАРЛИ анализа метилирования эмбриона использовать EZ-метилирования ДНК комплект (Zymo исследований) с ограниченным бисульфит разведение пиросеквенирования техника ^14, хотя сообщили, что успех темпов бисульфит превращается амплификации ДНК была ниже, чем метод, описанный здесь.

Бисульфит мутагенеза является золотым стандартом для анализа метилирования ДНК, и ясно, что анализ одной клетки, является важным шагом вперед. Агарозном вложение позволяет меньше размер выборки для анализа с бисульфит лечения, а агарозном защищает от деградации ДНК и защищает ДНК от потери во время многочисленных шагов протокола. Тем не менее, по сравнению с бластоцисты, одна яйцеклетка имеет приблизительно 3-6 мкг геномной ДНК. Наши изменение протокола, который встраивает одной яйцеклетки в агарозном содержащие лизис буфера, предотвращает начало ДНК потери на начальном этапе лизиса и умеренные жестокое обращение бисульфит. Таким образом, преимущество одного анализа ооцитов, что он позволяетобнаружение непреднамеренного загрязнения клетки кучевые, а также разоблачения редких событий и устранению любых предубеждений ПЦР в объединенных пробах. В целом, это модифицированный протокол обеспечивает качество данных о метилирования отдельных ооцитов и ранних эмбрионов.