Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

1. Montera och kalibrera ultraljudssystemet

1. Ultraljudssystemet börjar med en enda element ultraljudsomvandlare med en diameter tillräckligt bred för att täcka mushjärna och en mittfrekvens inom intervallet 2 MHz. Omvandlaren drivs av en 50-dB-effektförstärkare, vilken är ansluten till en signalgenerator som ger den sekvens ultraljudspuls.
2. Att kalibrera akustiska tryck ultraljud systemet använder en hydrofon att relatera den pålagda spänningen till resulterande ljudtryck. Placera omvandlaren i en vattentank över hydrofonen. Applicera en enkel puls (t.ex. en 10-cykel sinuskurva vid givarens frekvens med pulsrepetitionsfrekvensen 10 Hz) till omvandlaren. Använd en 3-axlig översättning steg för att hitta den maximala känsligheten, som bör vara i centrum av ultraljud strålen mot givarens naturliga fokus (cirka 60 mm för vår 13 mm diameter 2,15 MHz givare).
3. Gör flera mätningar under en ringdee av inspänningar (t.ex. 50-400 mV _pp) för att verifiera linjäritet av systemet. Använd en enkel linjär regression för att uppskatta förhållandet mellan ingående spänning och ljudtryck. I vårt system motsvarade inspänningar på 258 och 167 mV _pp till topp-negativa akustiska tryck på 0,52 och 0,36 MPa.
4. Programmet signalgeneratorn för att producera en sekvens ultraljudspuls bestående av skurar av sinusformade pulser vid omvandlaren frekvens med 50000 cykler per skur och en skurperiod av 64 ms. Bygger på kalibrering mätningarna anger pulsamplituden att generera topp-negativa akustiska tryck på 0,36 MPa vid mitten av givarens naturliga fokus.

2. Förbered Reagens

1. Lös Mangan kloridtetrahydrat (MnCla _{2 • 4} H2O) i sterilt vatten vid en koncentration av 100 mM (300 mOsM) och filtersterilisera.
2. Producera perflutren lipidmikrosfärer med "activating "flaskan i tillverkarens-medföljande agitator i 45 talet. för en dag av experiment kan en enda flaska aktiveras när i början av dagen och användas utan reaktivering för resten av dagen.
3. Omedelbart före mikrosfär administration, skaka flaskan för hand under 1 minut för att återsuspendera mikrosfärerna. När man tar ut mikrobubblor från flaskan, injicera inte rumsluft i flaskan, eftersom det försämrar de återstående mikrobubblorna. Låt flaskan tills den senaste användningen av dagen, och sedan lagra den i ett kylskåp. Upprätthölls på detta sätt, kan en enda ampull flera dagar. Re-aktivera den lagrade flaskan i omröraren, före första användning under efterföljande dagar.

3. Djur Framställning

1. Bedöva djur med isofluran, som levereras av noskon. Noskonen anordningen bör utformas för att fixera djurets huvud exakt och tillförlitligt i samma position varje gång. Vår enhet ¹⁵ håller huvudet i ee "Skull-flat" position (dvs. den dorsala skallen ytan är horisontell) används i Paxinos hjärnan atlas ^16. Titrera bedövningsmedlet för att upprätthålla en andningsfrekvens mellan 85 och 125 andetag per minut. Bibehålla kroppstemperaturen med användning av en värmelampa eller blåsta luften. Skydda ögonen med smörjmedel.
2. Ta bort hår från musen hårbotten med hjälp av en elektrisk trimmer.
3. Placera en kateter svansvenen och en intraperitoneal (IP) kateter. För överlevnad studier se till att använda lämplig steril teknik, IP kateterplacering visades i videon för denna artikel är endast lämpligt för icke-överlevnad experiment.
4. Gör ytterligare förberedelser som behövs för den neuronala stimulans experimentet. För kartläggning av vibrissae stimulering av pipan fältet cortex, använd en dissektionsmikroskop och sax mikrokirurgisk att skära vibrissae så nära som möjligt till hudytan utan att irritera hårsäcken eller omgivande hud.
5. Placera ultraljud gel påhårbotten och sedan sänka en vattenpelare som finns av en tunn plastskiva (t.ex. en 7,6 m papperskorgen liner) på huvudet. Nå igenom med vattnet med en bomullspinne för att driva ut eventuella luftbubblor som får fångas i ultraljudsgel. Positionera ultraljudsomvandlare vid dess naturliga fokalavståndet (58 mm) över mushjärna i kolonnen med vatten och torka omvandlaren med en fingertopp för att avlägsna eventuella luftbubblor.

4. Blod-hjärnbarriären Vernissage med mikrobubblor och ultraljud (BOMUS)

1. Ge en intraperitoneal injektion av mangan lösningen vid en dos av 0,5 mmol / kg IP. Förslut intraperitoneala katetern så att mangan inte rinner ut, och vänta 10 minuter för att tillåta den att distribuera (figur 1).
2. Att öppna blod-hjärnbarriären, administrera 30 | il av perflutren lipidmikrosfärer (aktiverad DEFINITY) genom svansvenen katetern, och samtidigt, initiera sekvensen ultraljudspuls. CFortsätta att insonification under 3 minuter.

5. Neuronal Stimulering

1. Låt ca 40 minuter för hjärnan nivåer av Mn ^{2 +} för att stabilisera innan neuronal stimulering. På detta sätt ⁺ diffusion över BBB den dramatiska förbättringen baslinjen grund Mn ² kan särskiljas från den subtila differentiell förstärkning på grund av stimulering. Sedan börjar stimulering med ditt paradigm val (figur 1).
2. För vibrissae stimulering, stänga av isofluran och ta bort noskonen. Flytta en mjuk konstnärens pensel manuellt i en cirkulär rörelse (1-5 Hz) genom vibrissae array på ett avstånd av ca 2-5 mm från huden. Fortsätt stimulans under 90 min. Mangan har en lugnande effekt som tillåter obegränsad stimulering av djuret. Om djuret blir oroligt, administrera 5% isofluran via noskon i ca 15 sekunder.

6. Magnetic Resonance Imaging

1. Efter stimulering, återuppta anestesi via noskon. Fortsätt att hålla kroppstemperaturen och titrera isofluran nivå till en andningsfrekvens på 85 till 125 andetag per minut.
2. Placera musen i en MR-avbildning spole och överföra till MRT systemet. Skaffa högupplösta 3D T _1-viktade MR-bilder. Till exempel, använda ett 3D förstörd gradient påpekas ekot (SPGR)-sekvens med de följande parametrarna: repetitionstid av 25 ms, ekot på 2 ms, flip-vinkel på 30 grader; bandbredden 15,63 kHz, på grund av 20 x 20 x 12 mm, matris av 128 x 128 x 60.

7. Bildanalys

1. Bildanalys är specifik för den stimulans som används paradigm. För vibrissae stimuleringen experimentet (figur 2), importera bilder från flera djur i en lämplig analys av miljö. Om vissa djur stimulerades till höger, medan andra stimulerades till vänster, flip lite så att alla bilder faktiskt "vänster stimuleras." Sedan att jämföra den stimulerade sidan av varje hjärna till sin kontralateral ostimulerade sidan, skapa en duplicerad och speglas vänster-ostimulerade bilden set skapas. Registrera alla bilder till ett gemensamt utrymme och sedan jämna dem med en 3 × 3 × 3 pixel Gaussisk kärna.
2. Exportera data till en matematisk analys miljö, såsom Matlab. Alternativt dölja irrelevant anatomi i datamängder. Intensitet-normalisera bilderna genom iterativ metod för Venot et al. ^17,18.
3. Använd en parade, enkel-tailed t-test för att jämföra varje voxel av de stimulerade sidorna av varje hjärna till motsvarande kontralaterala voxel på ostimulerade sidorna av varje hjärna.
4. Visa resulterande p-värdet kartan för att identifiera områden med differentiell aktivitet (Figur 3).

8. Representativa resultat

Den metod som presenteras här har två fond amental steg: (1) BBB öppning med mikrobubblor och ultraljud (BOMUS) och (2) Aktiveringsinducerat Mangan-MRT (AIM MRT). Eftersom det senare steget beror på den tidigare är det viktigt att kontrollera ett framgångsrikt genomförande BOMUS.

Störning av den blod-hjärnbarriären efter administrering av en T _1-bakfett kontrastmedel (t.ex. mangan eller en gadolinium-baserad medel) resulterar i en signal ökning i hjärnparenkymet på T _1-viktade bilder i jämförelse med hjärnor, där BOMUS utfördes inte (fig 4). Fördelningen av denna mangan förbättring inte är helt jämn, även om det är ganska konsekvent mellan djur. Fördelningen återspeglar inte bara inhomogenitet i BBB öppning, utan även är den inneboende icke-enhetlig fördelning av Mn i hjärnan ^19. De rumsliga och tidsmässiga dynamiken i BBB öppningen har ytterligare beskrivits tidigare ^12.

Figur 1. Protokoll Tidslinje för funktionell neuroimaging med BOMUS och AIM MRI (Anpassad från Howles et al. ^13).

Figur 2. Analys system för att identifiera områden of olika intensitet mellan de stimulerade och ostimulerade sidor av varje hjärna. För att jämföra den stimulerade sidan av varje hjärna till sin kontralateral ostimulerade sidan en duplicerad och speglas vänster-ostimulerade bilden set skapas. Dessa bilder registreras, filtrerades och normaliserade. Slutligen, vid test jämför de vänstra stimulerade och vänster-ostimulerade bilder. Ett t-test är "ihopkopplad" så att den stimulerade sidan av varje hjärna endast jämfört med den ostimulerade sidan av samma hjärnan. Ett t-test är "en-svansat" så att en sida av p-värde kartan visar signifikant högre signal på den stimulerade sidan av hjärnan, medan den andra sidan av det p-värde kartan visar signifikant högre signal på ostimulerade sidan av hjärnan (Från Howles et al. ^13).

Figur 3. Resultat av poolade analysen av 7 djur vid två olika axiella positioner. T Han första kolumnen visar medelvärdet av alla inriktade registrerade bilder, så att ett effektivt alla möss hade sin vänstra vibrissae stimuleras. Dessa bilder överlagras med en färgkarta som indikerar den genomsnittliga procentuella ökningen i signal vid varje voxel i förhållande till den kontralaterala hemisfären, såsom indikeras av färglisten. Färgade områdena på den högra sidan av bilden visar var halvsfären kontralateralt till stimulering hade högre signal. Färgade områdena på den vänstra sidan av bilden visar var halvsfären ipsilateralt om stimuleringen hade högre signal. Den andra kolumnen visar samma bilder överdragits med p-värde karta som visar den statistiska signifikansen av ökningen i signal. Den tredje kolumnen visar samma p-värde map överlagras på motsvarande siffror från Paxinos stereotaxiska atlas ¹⁶ med pipan fälten i sensoriska cortex skuggas (Från Howles et al. ^13).

/ 4055/4055fig4.jpg "/>
Figur 4. Rumslig fördelning av ^{Mn2 +-i} hjärnan. Bilder togs 170 min efter 0,5 mmol / kg IP MnCb ₂ från BOMUS behandlades-(n = 5) och kontroll (n = 4) möss. Efter normalisering, betyder och standardavvikelse kartor beräknades (vänster panel). Förstärkningen var större i de BOMUS-behandlade möss. Fastän denna förbättring inte var likformig över hjärnan, var det ganska enhetlig, utom nära kanterna på hjärnan och ventriklarna. Använda områden av intresse (ROI) dras runt olika strukturer, var medelvärdet SNR (+ 1 SD) beräknas över varje grupp (höger panel). BOMUS-behandlade djur visade större SNR, utan också större varians mellan strukturer och mellan djur (Anpassad från Howles et al. ^13).

Figur 5. Att undersöka vävnadsprov effekterna av BOMUS var hjärnor från BOMUS-behandlade mössen fast, sectioned vid 500 - ^ m mellanrum, och färgades med hematoxylin och eosin. Det genomsnittliga antalet röda extravasation av blodceller som ses i varje sektion av hjärnan visas för akustiska tryck av 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), och 5,0 MPa (n = 1). Felstaplarna visar standardfelet. Den andra panelen visar ett exempel på allvarlig röd blodkropp extravasation från hjärnan utsattes för 5,0 MPa (Från Howles et al. ^12).

Figur 6. Kvantitativ beteendetestning användes för att bedöma aktiviteten, upphetsning, och mottaglighet före anestesi, och 3 och 24 timmar efter återhämtning från anestesi. Det poängsystem, som beskrivits tidigare ^12, baserades på den väletablerade kvantitativ mus beteende bedömning utvecklased av Irwin 1968 ^22. Den genomsnittliga beteende (± SEM) resultatet kontroll (n = 3) och BOMUS (0,36 MPa) behandlades (n = 8) djur visas. Relativt den före anestesi baslinjen, alla djur visar en minskning i beteende viktad 3 timmar efter anestesi, men de i stor utsträckning återhämta av nästa dag. Vid varje tidpunkt, var ingen skillnad sågs mellan de två grupperna, vilket indikerar att BOMUS inte mätbart påverkade djurens beteende (Från Howles et al. ^12).

Här var en metod fram för icke-invasivt öppna BBB hela musen hjärnan med ultraljud och mikrobubblor (BOMUS). Med BBB öppna, ⁺ Mn ² administrerades och aktivering-inducerad mangan-MRT (AIM MRI) användes för att bilden neuronal svar på kort tid stimulering i lätt sederade möss.

Adekvat BBB öppning uppnåddes med en topp-negativ ljudtryck på 0,36 MPa. Notera är detta tryck vid hårbotten yta i centrum av ultraljudstrålen. Mätningar av den enda element omvandlarens strålprofilen indikerar att det akustiska trycket i strålen kanten är endast ca 0,12 MPa. Därefter reducerar dämpningen genom skallen trycket når hjärnan med uppskattningsvis 25% (reducering baserat på Choi et al. ²³ och justerades med avseende på frekvens). Detta tyder på att BBB störningar inträffade på topp-negativa akustiska tryck på 0,09 MPa (vid centrum för vår strålens) Till 0,03 MPa (vid kanten). Dessa tryck är lägre än de nivåer (typiskt 0,4 till 0,5 MPa) redovisas på annat håll ^24. Detta reducerade tryck tröskelvärde kan bero på den högre dosen av lipid mikrobubblor som användes i detta arbete (cirka 1,2 ml / kg) jämfört med andra. Medan dosen av begagnade mikrobubblor var högre än den rekommenderade diagnostiska dosen till människa (10 pl / kg) var negativa effekterna observerades inte.

Som anges här är BOMUS tekniken icke-invasiv och reversibel, men har den potential att orsaka skador. I tidigare arbete ¹² möss som behandlats med BOMUS utvärderades med avseende på histologisk skada (Fig. 5) och beteendeförändringar (figur 6). Peak-negativa akustiska tryck på 0,36 MPa var förenade med några observerade negativa effekter (Figur 6). Emellertid var 0,52-MPa BOMUS förknippad med ett litet antal intracerebrala röda extravasation blodkroppar i en undergrupp av djuren (

På samma sätt som BOMUS teknik är potentiellt skadlig har mangan också välkänd toxicitet ^{25. Mn2 +} är känd för att ha toxiska effekter på den neuromuskulära förbindelsen ²⁶ och nervsystemet ^27. Denna toxicitet är sannolikt ansvarig för somnolens av mössen efter administrering, men mekanismen för denna effekt är okänd. För ungefär de första 60 minuterna av stimulering förblir musen lite sömnig men ändå lyhörd för smärtsamma stimuli som en tå nypa. Detta medger att musen att tolerera stimuleringen utan behov av fysiska begränsningar. Enligt vår erfarenhet är detta somnolens tillräcklig för cirka 60 minuter varefter djuret kan bli rastlös. Ytterligare kemisk fasthållningsanordningen kan vara enchieved behov med ca 15 sekunder av 5% isofluran via noskonen. I denna demonstration, underlättade somnolens stimulering av vibrissae, men kan det också ha minskat den neuronala svaret i pipan cortex.

Förutom att helt enkelt administrera ^{Mn2 +} kan BOMUS teknik användas för att globalt administrera andra diagnostiska eller terapeutiska medel. I tidigare arbete har BOMUS använts för att administrera Gd-DTPA, en MRI kontrastmedel, till hjärnan. ¹² Trots många frågor kvarstår om vilken typ av BBB permeabilitet uppnås med BOMUS. För det första är det inte klart vilken storlek agenter kan passera BBB efter BOMUS. Både Mn ^{2 +} och Gd-DTPA (500 Da) är ganska små molekyler. För det andra är det inte klart hur mycket av permeabiliteten hos BBB varierar över hjärnan. Det tredje är det inte klart om BBB öppningen är en relativt binär effekt, eller om vissa öppna parametrar kan påverka storleken eller hastigheten av materialgenomträngning. Även Gd-DTPA distribueras relativt jämnt genom hjärnan i ovannämnda studie, kan det ha varit för litet och för diffunderbara att avslöja eventuella skillnader i permeabilitet.

Trots dessa osäkerheter om BOMUS är metoden effektiv för att snabbt administrera Mn ^{2 +} för att AIM-MRI. AIM-MRI har använts i möss för att kartlägga neuronal svar på lång sikt (1-2 dagar) stimulering hos möss ^28-30, men med denna nya metod, kortfristiga stimulering experiment är nu möjliga. Tidigare, snabb tillförsel av Mn ^{2 +} var endast möjligt med osmotiskt BBB störningar med hjälp av en intracarotid infusion av hyperton mannitol. Detta tillvägagångssätt var bara praktiskt hos råttor och större djurmodeller, men även hos råttor, var dessa studier begränsas av invasiv och unilaterality av tekniken. Eftersom BOMUS kan utföras icke-invasivt, bör vakna stimulans och longitudinella studier nu vara möjlig. Vidare becaanvända ^{Mn2 +} kan administreras till båda hjärnhalvorna, ett bredare spektrum av stimulering paradigmer är möjliga. I ovanstående demonstrationen den bilaterala administrationen Mn ^{2 +} tillät ostimulerade hemisfären för att fungera som en intern kontroll, så att neuronal svar på icke-specifik bakgrund stimulering kan separeras från svaret på den ensidiga vibrissae stimulering.

Förutom att kontrollera för icke-specifik bakgrund stimulering, även ostimulerade halvklotet användes för att kontrollera homogenitet och konsistens mangan förvaltningen. Som framgår av andra mangan-förstärkt MRT experiment ^19, fördelningen uppgifter (Figur 4) visar att BOMUS tekniken inte ger en homogen förbättring av hjärnan. Således utan tillräckliga kontroller (kontroll djur eller en ostimulerad halvklotet), regioner med högre utgångsvärde förstärkning är svåra att skilja från regioner vars eleverad signal beror på nervaktivitet.

Även om utgångsläget Mn ^{2 +} förstärkning inte är homogen, är mönstret ganska konsekvent mellan individer. Likväl kan mindre variationer i denna baslinje förbättring skymma AIM-MRI signal. I denna demonstration, upp vi detta potentiella problem som genomsnittet av de AIM-MRI signal över flera djur. Alternativt kan skillnader i utgångsläget förstärkning redovisas genom att skaffa pre-stimulering bilder.

Metoden som presenteras här kräver omfattande statistisk bildanalys, vilket i sin tur kräver high fidelity bilden registrering. Naturligtvis är en sådan registrering endast meningsfull om källdata förvärvas med en resolution (i alla tre dimensioner) som är tillräckligt finare än strukturerna av intresse. I denna demonstration var 3D-bilder förvärvades med nästan isotropiska voxlar cirka 160 mikrometer i varje dimension, vilket gjorde utmärktanatomiska registrering. Trots detta kan bildregistrering begränsa den rumsliga upplösningen i denna metod, en liten felregistrering kan genomsnittlig ut mycket små områden förbättringen. Lillhjärnan och olfaktorisk lökarna kan vara särskilt svårt att registrera sig, eftersom de har ett fint lager förbättring och är ofta ute i anpassningen till hjärnan.

Här har vi presenterat en metod för kartläggning av neuronal svar på kortvariga stimulanser i vakna möss. Även om de inte enkelt, är metoden relativt praktisk och tillgängliga. Denna detaljerade diskussion om de begränsningar och nyanser bör förhoppningsvis göra det möjligt för läsaren att tillämpa tekniken på sina egna experimentella frågor.