Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

1. Microtomia per sezioni non macchiate

1. Impostare bagnomaria e microtomo come per microtomia paraffina standard. Utilizzare vetrini con carica positiva e pre-etichetta con il numero di casi, regione pancreas (campione) e il numero di diapositiva. Posto blocco di paraffina nel mandrino microtomo con l'etichetta cassetta sul lato sinistro.
2. Seguire le procedure Microtomia normali, sezione nel blocco finché il tessuto è uniformemente incontrato. Produrre un nastro di sezioni seriali (4 micron di spessore, 3-6 a seconda del numero di macchie iniziali richiesti (vedi Modulo per l'invio Case, appendice 1)). Sezioni distinte nella barra multifunzione, pick up in ogni ordine e posto su vetrini con ordine numerata a matita. Indicare se una sezione è inutilizzato da numerazione sezioni in ordine esatto. Mantenere lo stesso orientamento sul vetrino come si trova nella cassetta con l'etichetta slitta orientata verso sinistra. Secco per una notte a temperatura ambiente quindi procedere con colorazione o distribuzione investigatori.
3. Reseal superficie del blocco di paraffina con uno strato sottile di paraffina per preservare il tessuto e archivio a temperatura ambiente oa -20 ° C.
4. Per microtomia successiva, mantenere la numerazione per le sezioni seriali ad ogni livello come sopra. Ottenere uno scivolo aggiuntivo e macchia da slitta H & E per ogni livello di ~ 100 uM all'interno di ogni blocco.

2. H & E di colorazione

1. Posizionare la prima diapositiva di serie sezionato da ciascun blocco in un rack scorrevole poi nel primo cassetto del Autostainer.
2. Selezionare lo standard H & E del programma macchia e procedere come al solito.
3. Al termine della colorazione, rimuovere i vetrini da Autostainer e il luogo in cappa per coprioggetto.
4. Coprioggetto usando la tecnica standard. Asciugare a fondo e etichetta con un'etichetta stampata (vedere la sezione 12).

3. IHC Set-up

1. Selezionare il programma Dako per le macchie doppi ei numeri di ingresso di diapositive. Preparare buffer TBST e citrato, anticorpi, e Reag altrigenitori in base ai volumi specificati (Tabella 1). Caricare il vassoio dei reagenti e diapositive. Rotazione di pulito e linee di scarico sono programmati secondo le raccomandazioni del fabbricante.
2. Se l'esecuzione di questi test manualmente, preparare volumi stimati. Incubare i vetrini in una camera umidificata per evitare vetrini di essiccazione in qualsiasi fase. Seguire la stessa procedura per ogni reagenti esempio per l'Autostainer.

4. IHC Deparaffinizzazione e recupero Antigen

1. Mettere vetrini in xilene per 5 minuti. Ripetere una volta. Non lasciare che i vetrini si asciughino in qualsiasi momento successivo fino indicati come questo si tradurrà in background colorazione eccessiva e poveri.
2. Trasferire vetrini al 100% di etanolo per 2 minuti. Ripetere una volta.
3. Mettere in vetrini appena preparata 3% H ₂ O ₂ in metanolo per 10 minuti.
4. Immergere i vetrini in etanolo al 90% e quindi inserire nel 90% di etanolo per 3 minuti.
5. Trasferimento scorre versoEtanolo 70% per 1 minuto.
6. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata.
7. Preriscaldare il piroscafo e tampone citrato in vapore per 5 minuti.
8. Aggiungere diapositive a citrato buffer nel vapore e il vapore per 30 minuti.
9. Trasferire immediatamente scivoli ad acqua e tenere premuto fino a quando scorre raffreddare a temperatura ambiente (~ 20 minuti).
10. Trasferire i vetrini con i rack Dako Autostainer secondo macchiare sequenza (Figura 1) ed eseguire il programma di doppia colorazione. Le fasi principali del programma Autostainer sono elencati in modo che piste manuali possono duplicare.

5. Primi Anticorpi primari (Ki-67, CD3, polipeptide pancreatico)

1. Blocca vetrini con la soluzione di Sniper per 15 minuti. Lavare due volte con TBST.
2. Incubare i vetrini in anticorpo primario per 30 minuti. Lavare due volte con TBST.
3. Incubare con Mach2 capra anti-topo (Ki-67) o anti-coniglio (CD3, polipeptide pancreatico) rafano perossidasi (HRP) polimero per 30 minuti. Lavare due volte con TBST.
4. Applicare 3,3-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) per i vetrini per 4 minuti. Lavare due volte con acqua.
5. Vetrini incubati con il polipeptide pancreatico si svolgono sul Dako quando viene saggiato contemporaneamente e TBST utilizzato per tutti i passi successivi, mentre i vetrini vengono incubati con la seconda serie di anticorpi primari. In alternativa, per le prove manuali, passare alla sezione 6.

6. Secondo Anticorpi Primari (insulina, glucagone)

1. Incubare i vetrini in Deeb per 20 minuti. Lavare due volte con TBST.
2. Blocco con 10% siero di capra normale in bloccante avidina 20% in TBST (insulina) o Sniper (glucagone) in TBST per 20 minuti. Lavare due volte con TBST.
3. Incubare con insulina o glucagone anticorpo primario per 15 minuti. Lavare due volte con TBST.
4. Insulina: vetrini Incubare in biotinilato di capra anti-cavia a 1:300 diluizione per 30 minuti. Lavare due volte con TBST. Incubare con standard di vector ABC-AP reagente per 30 minuti. Lavare due volte con TBST.
5. Glucagone: vetrini Incubare in tampone durante per 30 minuti seguiti da capra anti-topo fosfatasi alcalina (AP) polimero per 30 minuti. Lavare due volte con TBST.
6. Mentre vetrini vengono incubati in coniugati, riscaldare il buffer LPR a temperatura ambiente. Aggiungere 1 goccia di liquido rosso permanente (LPR) per 3 mL di tampone immediate prima dell'uso e del luogo in rack reagente Dako. Incubare i vetrini in LPC per 4 minuti. Lavare due volte con acqua.
7. Incubare i vetrini in ematossilina per 1 minuto. Sciacquare due volte con acqua.
8. Incubare i vetrini in TBS pH 7,6 per 1 minuto. Sciacquare due volte con acqua.
9. Scaricare diapositive da DAKO Autostainer.
10. Immediatamente disidratare vetrini colorati per il polipeptide pancreatico. Per tutte le diapositive doppie colorate, asciutto per almeno 1 ora, quindi disidratano.

7. Disidratazione

1. Posto scorre in 80% etanolo per 1 minuto.
2. Immergere i vetrini in etanolo al 95%. Tenere i vetrini in etanolo al 95% per 30 secondi.
3. Trasferire i vetrini al 100% di etanolo e tenere premuto 1 minuto. Ripeti.
4. Immergere i vetrini in xilene.
5. Tenere vetrini in xilene per 1 minuto. Ripeti.
6. Immediatamente montare su vetrini coprioggetti usando cytoseal.

8. Diapositiva Labeling

1. Immettere le informazioni di identificazione caso compreso il numero di organi e di blocco, macchia, e la data e la stampa. Numero della sezione di serie è facoltativa per le macchie prima diapositiva di ciascun blocco. I livelli successivi sono indicati con numerazione.
2. Posizionare le etichette sulle diapositive.

9. Scansione diapositive

1. Mettere vetrini colorati nel vassoio scanner e la scansione in base alla strumentazione.
2. Organizzare le diapositive per tipo di donatore e dei tessuti (testa del pancreas, corpo, coda, milza).
3. Vetrini colorati archivio a temperatura ambiente e le diapositive rimanenti non colorati a -20 ° C fino all'uso.

10. RAPPRESERisultati ntative

Queste procedure di colorazione sono stati sviluppati per la Rete JDRF per i donatori di organi del pancreas con diabete (nPOD) per fornire la caratterizzazione di base di paraffina e freschi blocchi congelati. Ogni donatore ha una caratterizzazione di base eseguita composto di colorazione a 2 isolati da ogni regione del pancreas (testa, corpo e coda) e la milza (Figura 1, vedi anche modulo di invio caso, appendice 1). La colorazione H & E è condotta utilizzando un Autostainer programmato come per una struttura clinico-clinica con soluzioni di qualità utilizzati in tutto. Come blocchi donatori supplementari sezionate, ognuna ha una diapositiva preso per H & E per mostrare la morfologia dei tessuti. Quando i blocchi sono sezionate volta, come per la distribuzione agli investigatori, i livelli più profondi avrà anche diapositive riprese il rappresentante H & slides E per documentare la morfologia del tessuto l'intero blocco così come numerazione sezioni seriali ad ogni livello. Vetrini colorati sono etichettati condell'individuazione dei casi, regione pancreas, numero di blocco, macchia e la data (Figura 2) e nel sistema di scansione on-line patologia gestione delle informazioni. Immagini rappresentative di un donatore di controllo sono mostrati nella Figura 3 sia a basso ingrandimento e alta per mostrare i risultati attesi seguendo questa procedura. Il tinto diapositiva con il polipeptide pancreatico (D, H) è stato analizzato in un giorno diverso con il test eseguito manualmente e mostra ridotta intensità di colorazione del contrasto ematossilina. Le differenze di intensità di colorazione anticorpi primari o di contrasto tra saggi deve essere evitato soprattutto se utilizzando l'analisi dell'immagine scorre altrimenti con richiedono correzione del colore individuale per ottenere le aree stessa cella o conteggi.

Ogni laboratorio deve aspettarsi di ottimizzare le concentrazioni anticorpali da lotto a lotto variazione e altri reagenti e le condizioni possono influenzare l'intensità di colorazione e specificità. Con l'acquisizione di nuove REAsignori, le procedure di colorazione vengono convalidati con noti campioni di controllo positivi e negativi per raggiungere lo stesso grado di intensità macchia con reagenti precedenti. Gli anticorpi ottimizzati nel nucleo nPOD patologia sono riportati nella Tabella 2 come fonte di riferimento e sono stati utilizzati per multilabeling saggi di immunofluorescenza per microscopia confocale.

Figura 1. Griglia di colorazione Dako. Questo schema raffigura una analisi di routine da un donatore di pancreas nPOD eseguita su un Autostainer Dako. I donatori nPOD sono codificati con un numero a 4 cifre di identificazione. Due vassoi di diapositive vengono visualizzati con diapositive organizzate dalla macchia. Configurazioni di scorrimento alternativi sono previsti a seconda del numero di diapositive donatori. I controlli positivi comprendono l'inclusione di un donatore nota positiva per le due macchie doppie e milza dei donatori per la Ki-67 e CD3. I controlli negativi sono di due tipi e comprendono due slides da un blocco donatore pancreas incubati con immunoglobuline (Ig) dalle specie ospite degli anticorpi primari e due scivoli dalla milza dei donatori per l'insulina e il glucagone.

Figura 2. Rappresentante doppio slide colorate. Una diapositiva finito tipica è mostrata con i parametri di etichettatura di diapositive e di collocamento dei tessuti prima della scansione digitale viene eseguita.

Figura 3. Rappresentante H & E e le macchie IHC nelle sezioni pancreatiche. Sezioni da parte del pancreas di un donatore adulto organo femminile (6096-04 Panhead) erano macchiati e scansioni digitali eseguite come descritto nel protocollo. Le immagini sono state ottenute utilizzando il programma ImageScope visualizzazione della intera sezione (AD) e da un isolotto (EH). Le intensità delle isole attesi macchia di insulina, glucagone e polipeptide pancreatico sonoosservati per sezioni BD come sezione D che delimita il blocco testa pancreas contiene una piccola porzione della regione uncinato o lobo ventrale pancreatico come tutte le isole pancreatiche contengono principalmente polipeptide cellule positive. Si noti che il contrasto in ematossilina pannello D è troppo leggero, mentre l'intensità di contrasto in ematossilina B e C sono ottimali. Pannelli EH mostrano un isolotto dal lobo dorsale con la distribuzione prevista dei beta-cellule e α-cellule. A cellule pancreatiche pochi polipeptidiche si trovano nella parte inferiore sinistra della isolotto (H). A, E-H &E; B, F-Ki67 + Insulina, C, G-CD3 + glucagone, D, H-polipeptide pancreatico. AD, 0.2x, EH-12.8x.

Standardizzazione delle procedure IHC è fondamentale per l'analisi delle immagini, in particolare quando si utilizzano computer basati su algoritmi in un gran numero di diapositive nel corso del tempo. La procedura di colorazione IHC descritto nella presente relazione permetterà un'analisi lotto di campioni di un donatore data, utilizzando uno Autostainer all'interno di una giornata di 8 ore di lavoro e vengono modificati da una relazione precedente ^5. Immagini delle diapositive digitalizzate intere di ogni diapositiva macchiata messi a disposizione nPOD affiliate investigatori attraverso il sistema web-based on-line patologia. Gli investigatori possono rivedere demografici donatori, dati di laboratorio e altri pertinenti la storia clinica con gli scivoli e sono in grado di scegliere i blocchi più adatto per i loro studi (vedi http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php per maggiori informazioni) . Tale sistema on-line patologia funge da "virtuale biobanca". Un ulteriore miglioramento di questo sistema sarà implementato wheetichette dei vetrini sentando incorporare un codice a barre per monitorare sezioni seriali e livelli per ciascun blocco con un obiettivo finale di ricostruzione 3-D del pancreas.

Le due procedure doppia colorazione sono stati scelti principalmente per determinare β-cellule insulari composizione (insulina), di concerto con la replicazione cellulare (Ki-67) data l'importanza della comprensione dei meccanismi per adulti β-rigenerazione cellulare nel diabete tipo 1 ^5,6. Come il secondo saggio doppia IHC viene eseguita su sezioni seriali al primo, ogni isolotto si caratterizza sia per β-cellula (insulina) e α-cellule composizione (glucagone). Inoltre, la presenza di T-linfociti CD3) è determinato in accordo con α-colorazione della cellula per due motivi principali. La base di cellule T mediata autoimmunità in progressione del diabete di tipo 1 è stato chiaramente apprezzato ancora la natura degli agenti scatenanti (virali, batteriche, cellule infiammatorie) o la composizione della cronica infiltrato con Resulimportante β-disfunzione delle cellule e la morte sono ancora da definire (recensione in ^7,8). In secondo luogo, i donatori con diabete di tipo 1 hanno un deficit ben caratterizzato di cellule beta in modo che la combinazione del CD3 e le macchie di glucagone garantisce l'identificazione di isolotti, anche quando β-cellule perdita è grave ^9.