En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

Manejo de huevo

1. Los huevos pueden mantenerse a 13 ° C durante hasta una semana antes de la incubación sin pérdida significativa de la viabilidad (un enfriador de vino pequeño es ideal para este propósito).
2. Antes de la incubación, los huevos permiten calentar a la temperatura ambiente, luego coloque el pollo en una incubadora humidificada conjunto a 37,8 ° C (100 ° F).
3. Por lo general, electroporar embriones de aproximadamente 48 horas desde el inicio de la incubación, cuando el embrión ha llegado a Hamburger y Hamilton etapa 10.
4. Tiempo de incubación puede variar de acuerdo a hamburguesa deseada y la etapa Hamilton. La temperatura es crítica y la desviación de la temperatura de incubación óptimo va a alterar el tiempo de incubación y la disminución de la viabilidad del embrión.
5. Durante la incubación, los huevos deben mantenerse en sus lados para que el embrión debe estar correctamente posicionado para la electroporación. El embrión flotar en la superficie de la yema y es útil para marcar la parte superior del huevo con un lápiz antes de ventanas para que usted sepa dónde cortar.

Preparación

1. Caliente Leibovitz L-15 medios de comunicación a 37 ° C. Tire de capilares de vidrio en las agujas. Electrodos posición y micromanipulador y conectar los electrodos al generador de pulsos.

Ventanas

1. Utilizando una jeringa con aguja de gran calibre, perforar la cáscara en el extremo más pequeño del huevo.
2. Apuntando la aguja hacia abajo con cuidado para evitar la interrupción de la yema de huevo, remover unos 5 ml de albúmina.
3. Selle el orificio con un pequeño trozo de cinta.
4. Cubra la parte superior del huevo con otro pedazo de cinta adhesiva (de 4x4 cm).
5. Con tijeras curvas, y teniendo cuidado de no perturbar el embrión, un agujero lo suficientemente grande como para proporcionar una ventana en la que trabajo.

Opcional: Para visualizar el tubo neural, inyectar la solución de tinta con aguja de calibre 26 debajo del embrión (insertar la aguja en el embrión desde el exterior del anillo de la sangre). Tinta china se deben diluir 1:5 con Hanks o comparable solución estéril de buffer.

Inyección y electroporación

1. Romper la punta capilar de diámetro deseado con unas pinzas
2. Use la pipeta de boca de carga del capilar con un tinte verde plásmido rápido /.
3. La posición del embrión con la cabeza hacia usted e inserte la aguja en el tubo neural en un ángulo bajo.
4. Se inyecta la solución del plásmido en el lumen del tubo neural hasta el medio de contraste llena todo el espacio.

Nota: Tenga cuidado de no tener la punta más grande que el diámetro del tubo neural. En general, usted será capaz de saber si el tamaño de la punta óptima se ha conseguido por lo fácil o difícil que es para sacar el líquido en el capilar. Si hay una resistencia extrema, la apertura es probablemente demasiado pequeño y la punta debe ser roto de nuevo más arriba. Si hay poca o ninguna resistencia, la apertura es demasiado grande y una aguja nueva debe ser utilizado.

1. Coloque una a dos gotas de agua estéril 15 L-medios de comunicación sobre el embrión.
2. Inmediatamente colocar los electrodos a ambos lados del embrión, paralela a la del tubo neural, y los tiempos de pulso de 5 a 10 a 24 voltios durante 50 milisegundos a intervalos de 1 segundo. Verá burbujas cerca de los electrodos si ha funcionado correctamente.
3. Retire con cuidado los electrodos, colocar 5 gotas de L-15 en la parte superior de los embriones y sellar el huevo con cinta adhesiva. Asegúrese de que el huevo esté bien cerrado, como el secado es un importante contribuyente a la pérdida de embriones después de la electroporación.
4. Coloque los huevos de nuevo en la incubadora, la ventana lateral, y se incuban hasta que se alcance deseado H & H etapa.

Este protocolo proporciona una guía paso a paso a la electroporación del tubo neural de embriones de pollo HH10. Además de mostrar la técnica, las directrices para el almacenamiento y manipulación de los huevos también se proporciona. Esta técnica tiene una amplia gama de aplicaciones para el análisis genético y la facilidad y bajo costo de los experimentos los hace factible para muchos laboratorios.