In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo's

Eierbehandeling

1. Eieren mogen worden bewaard bij 13 ° C tot een week voorafgaand aan de incubatie zonder een significant verlies van de levensvatbaarheid (een klein wijnkoeler is ideaal voor dit doel).
2. Voorafgaand aan de incubatie, laat de eieren op kamertemperatuur, plaats dan warm in een bevochtigde kip incubator ingesteld op 37,8 ° C (100 ° F).
3. We meestal electroporate embryo's ongeveer 48 uur na het begin van de incubatie, wanneer het embryo heeft Hamburger en Hamilton het podium 10 bereikt.
4. De tijd van incubatie kan variëren afhankelijk van de gewenste Hamburger en Hamilton het podium. Temperatuur is kritisch en afwijking van een optimale incubatie temperatuur zal veranderen incubatietijd en de afname van embryo levensvatbaar is.
5. Tijdens de incubatie, moeten de eieren worden gehouden op hun kant, zodat het embryo zal goed gepositioneerd voor elektroporatie. Het embryo zal drijven op de top van de dooier en het is nuttig om de top van het ei markeren met een potlood voor window, zodat je weet waar je moet knippen.

Voorbereiding

1. Warm Leibovitz L-15 media tot 37 ° C. Trek glas haarvaten in de naalden. Plaats elektroden en micromanipulator en sluit elektroden op de pulsgenerator.

Window

1. Behulp van een injectiespuit met grote naald, prik de schil aan het smalle uiteinde van het ei.
2. Wijst de naald voorzichtig naar beneden tot een verstoring van de dooier te voorkomen, verwijder dan ongeveer 5 ml albumine.
3. Dicht het gat met een klein stukje van de tape.
4. Bedek de bovenkant van het ei met een ander stuk van de band (ongeveer 4x4 cm).
5. Met behulp van gebogen schaar, en zorg ervoor dat u het embryo te verstoren, een gat net groot genoeg om een ​​raam in te werken bieden.

Optioneel: visualiseer de neurale buis, inkt oplossing te injecteren met een 26 gauge naald onder de embryo (steek naald onder de embryo van buiten het bloed ring). Oost-Indische inkt moet worden verdund 1:05 met Hanks of vergelijkbare steriele gebufferde oplossing.

Injectie en elektroporatie

1. Breek de capillaire tip om de gewenste diameter met een pincet
2. Met behulp van de mond pipet, laad het capillair met plasmide / Fast groene kleurstof.
3. Positie van het embryo met het hoofd naar u toe en steek de naald in de neurale buis op een ondiepe hoek.
4. Injecteer het plasmide oplossing in het lumen van de neurale buis tot kleurstof vult de hele ruimte.

Opmerking: Let erop dat u tip groter dan neurale buis met een diameter hebben. In het algemeen zal je kunnen vertellen of de optimale tip grootte is bereikt door hoe gemakkelijk of moeilijk het is om vloeistof te trekken in het capillair. Als er extreme weerstand, de opening is waarschijnlijk te klein en de tip moet weer hoger zijn opgebroken. Als er weinig of geen weerstand, de opening is te groot en een nieuwe naald worden gebruikt.

1. Plaats een tot twee druppels steriele L-15 media op het embryo.
2. Onmiddellijk plaats de elektroden aan weerszijden van het embryo, parallel aan de neurale buis, en pols 5 keer op 10-24 volt voor 50 mseconds tussenpozen van 1 seconde. U ziet belletjes de buurt van de elektroden of het werkt naar behoren.
3. Verwijder voorzichtig elektroden, 5 druppels L-15 terug te brengen op de top van de embryo's en verzegel het ei met tape. Zorg ervoor dat het ei goed wordt afgesloten, omdat het drogen is een belangrijke bijdrage aan embryo verlies na elektroporatie.
4. Plaats de eieren terug in de couveuse, venster naar boven, en incubeer tot ze de gewenste H & H podium.

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor neurale buis elektroporatie van HH10 kippenembryo's. Naast het tonen van de techniek, is richtlijnen voor de opslag en behandeling van eieren ook voorzien. Deze techniek heeft een breed scala van toepassingen voor genetische analyse, en het gemak en de lage kosten van experimenten maakt ze haalbaar is voor vele labs.