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 JoVE Clinical and Translational Medicine

प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

1,2, 2, 2, 1,2

1Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 2Department of Cellular & Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

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Cite this Article: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J. Vis. Exp. (64), e4080, doi:10.3791/4080 (2012).

Abstract: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

ग्लूकोज homeostasis को मुख्य रूप से अंत: स्रावी हार्मोन इंसुलिन और ग्लूकागन द्वारा नियंत्रित किया जाता है, अग्नाशय बीटा और अल्फा कोशिकाओं से स्रावित, क्रमशः. कार्यात्मक बीटा सेल जन संरचनात्मक बीटा सेल के रूप में अच्छी तरह के रूप में बीटा कोशिकाओं की क्षमता के लिए एक पोषक तत्व लोड करने के लिए जवाब जन द्वारा निर्धारित किया जाता है. कार्यात्मक बीटा सेल जन नुकसान मधुमेह 1-3 की दोनों प्रमुख रूपों के लिए केंद्रीय है. जबकि कार्यात्मक गिरावट टाइप 1 मधुमेह एक autoimmune हमले से बीटा सेल जन परिणाम, टाइप 2 मधुमेह में, इस घटती दोनों बीटा कोशिकाओं की अक्षमता इंसुलिन छिपाना उचित और तंत्र की एक काडर से बीटा कोशिकाओं के विनाश से विकसित करता है. इस प्रकार, कार्यात्मक बीटा सेल जन को बहाल करने के प्रयासों के बेहतर उपचार और मधुमेह के लिए संभावित इलाज के लिए सर्वोपरि हैं.

आणविक मार्ग है कि प्रतिकृति को प्रोत्साहित करने के लिए और बीटा कोशिकाओं के समारोह बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान के प्रयास चल रहे हैं.आदर्श रूप में, चिकित्सकीय लक्ष्य दोनों बीटा सेल के विकास और समारोह में सुधार होगा. शायद अधिक महत्वपूर्ण है यद्यपि की पहचान है कि एक रणनीति है कि बीटा सेल विकास को बढ़ावा देने आई. बीटा सेल समारोह (जैसे कुछ ओंकोजीन के साथ) और इसके विपरीत की कीमत पर आता है.

व्यवस्थित दबा या overexpressing अलग चूहा islets में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के द्वारा, एक बढ़ती कार्यात्मक बीटा सेल 4-6 बड़े पैमाने के लिए संभावित चिकित्सात्मक लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं. Adenoviral वैक्टर अलग चूहा 4,7-15 टापू में कुशलतापूर्वक overexpress या पछाड़ना प्रोटीन के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहाँ, हम करने के लिए एक जीन अभिव्यक्ति का उपयोग adenoviral पारगमन में हेरफेर और आइलेट और अलग चूहा टापू (चित्रा 1) में बीटा सेल समारोह प्रतिकृति का आकलन विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि में पहले से इस्तेमाल किया गया है उपन्यास लक्ष्य है कि बीटा सेल प्रतिकृति या 5,6,8,9,16,17 समारोह मिलाना की पहचान.

Protocol: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

1. Adenoviral और चूहा Islets के पारगमन संवर्धन

  1. की अपेक्षित संख्या के लिए मीडिया के 2 मिलीग्राम (RPMI 1640 8 मिमी ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 50 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 50 μg / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त मीडिया) को जोड़कर एक 6 अच्छी तरह से गैर ऊतक संस्कृति लेपित थाली तैयार कुओं. कोई वायरस नियंत्रण के लिए हर एक, एक वायरस नियंत्रण (जैसे, GFP-व्यक्त adenovirus), और प्रायोगिक समूह - उदाहरण के लिए, एक ठेठ प्रयोग तीन कुओं की आवश्यकता हो सकती है.
  2. यह कम से कम 30 मिनट के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखकर 37 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली.
  3. तुरंत 6 अच्छी तरह से गैर ऊतक संस्कृति लेपित थाली के अलग - अलग कुओं में चूहा में आइलेट 18,19 अलगाव, जगह 100-200 islets के बाद. साठ islets में इंसुलिन का स्राव और thymidine निगमन assays के लिए आवश्यक हैं. शेष islets के जीन की अभिव्यक्ति अध्ययन या immunoblotting के लिए प्रोटीन अलगाव के लिए शाही सेना के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

[नोट: इस बिंदु से आगे, हैंडलिंग, उपयोग और biohazardous सामग्री के निपटान के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करें.]

  1. धीरे ज़ुल्फ़ अच्छी तरह से केंद्र में टापू लाने की थाली.
  2. पकवान का केंद्र में islets पर सीधे adenovirus विंदुक. संक्रमण के 100-500 multiplicities के (MOI, लक्ष्य कोशिकाओं के वायरल पट्टिका के गठन इकाइयों के अनुपात) का प्रयोग करें.
  3. 5 मिनट के लिए islets के आराम करने दो..
  4. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में प्लेट रखें.
  5. 24 घंटे के बाद, धीरे कुओं के केन्द्रों को islets के लाने के लिए और एक अच्छी तरह से ताजा मीडिया युक्त नए P200 micropipette का उपयोग islets के हस्तांतरण के लिए थाली ज़ुल्फ़. यदि टापू थाली करने के लिए संलग्न हो जाते हैं, वे धीरे विंदुक टिप के साथ उखाड़ फेंकना जा सकता है.

[नोट: पर्याप्त पारगमन efficien की पुष्टिcy, एक नियंत्रण वायरस व्यक्त GFP का उपयोग लाभकारी है, के रूप में टापू तो adenovirus के आइलेट कोर में प्रवेश सत्यापित confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से imaged किया जा सकता है.]

  1. संस्कृति एक अतिरिक्त 24-72 घंटे के लिए islets के अनुकूलन पायलट अध्ययन से प्रयोग के वांछित समय पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, proliferative प्रतिक्रिया के शामिल होने को लेकर 24-72 घंटे या हित के जीन की पछाड़ना से 48 या 72 घंटे की आवश्यकता हो सकती है समय की आवश्यकता हो सकती है. ताजा मीडिया प्रत्येक दिन के लिए टापू स्थानांतरण.
  2. प्रयोग, 1 युक्त मीडिया में टापू संस्कृति के अंतिम 24 घंटे के लिए μCi [मिथाइल - 3 एच] -thymidine/ml मीडिया (आम तौर पर 1 μl मीडिया / thymidine मिलीलीटर).

[नोट: इस बिंदु से आगे, हैंडलिंग, उपयोग, और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करें.]

2. इंसुलिन स्राव परख

  1. तैयार करनास्राव परख (सब) बफर में 10X स्टॉक (1.14 एम, NaCl 47 मिमी KCl, 12 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 11.6 मिमी 4 MgSO) समाधान और CaCl 2 100X स्टॉक समाधान (0.25 एम 2 CaCl) के. इन स्टॉक समाधान समय से आगे तैयार किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत.
  2. हौसले से काम में सब (10X सब, 1 एम HEPES 100X 2 CaCl की 0.5 मिलीलीटर, 35% BSA, 0.11 छ 3 NaHCO की 0.28 मिलीग्राम के 1 मिलीग्राम, और बाँझ पानी के लिए 50 मिलीलीटर की 5 एमएल) की 50 मिलीलीटर तैयार 50 मिलीलीटर ट्यूब शंक्वाकार और 37 के लिए गर्म डिग्री सेल्सियस एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में रखकर.
  3. विंदुक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में काम सब के 10 मिलीग्राम और 2.5 एम एंड डी ग्लूकोज की 66.8 μl जोड़ने के लिए उच्च (16.7 मिमी) ग्लूकोज सब तैयार है.
  4. कम (2.8 मिमी) ग्लूकोज सब तैयार काम कर सब के शेष 40 मिलीलीटर के लिए 2.5 एम एंड डी ग्लूकोज की 44.8 μl जोड़ें.
  5. लेबल तीन 1.7 मिलीग्राम 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से microcentrifuge ट्यूब और फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) के 1 मिलीग्राम जोड़ें.
    6. [ध्यान दें: के रूप में टापू रेडियोधर्मी हैं, हैंडलिंग, उपयोग, और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करें कृपया.]

    1. 20 प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में टापू रखें. हर comparably आकार टापू के लिए प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में जोड़ने का प्रयास करते हैं. उदाहरण के लिए, प्रत्येक ट्यूब 5 छोटे - 10, मध्यम, और 5 बड़े आकार के टापू (चित्रा 1 देखें) हो सकता है.

    [नोट: Islets के या तो एक विदारक त्रिविमदर्शी या एक मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग कल्पना किया जा सकता है.]

    1. के बाद टापू ट्यूब के तल पर गुरुत्वाकर्षण (~ 2 मिनट) द्वारा तय हो चुका है, एक micropipette साथ पीबीएस महाप्राण (व्यंजन) और त्यागने.

    [नोट: गंभीरता से बसने के लिए एक विकल्प के रूप में, ट्यूब 1 मिनट के लिए 300 XG में Centrifuged किया जा सकता है.]

    1. पूर्व ऊष्मायन, glu की कम 400 μl जोड़ेंमौज से बैठना सब, टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2), और 60 मिनट के लिए पूर्व सेते हैं में जगह ट्यूबों (के साथ खुला अपनी टोपियां). पूर्व ऊष्मायन कम ग्लूकोज सब त्यागें और महाप्राण (व्यंजन).
    2. बेसल इंसुलिन के स्राव के लिए, कम ग्लूकोज सब की 400 μl जोड़ने के लिए, टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में ट्यूब (के साथ खुला अपनी टोपियां) जगह है, और 60 मिनट के लिए सेते हैं. कम ग्लूकोज ले लीजिए सब और इंसुलिन radioimmunoassay के लिए बचा.
    3. प्रेरित इंसुलिन स्राव के लिए, उच्च ग्लूकोज सब के 400 μl जोड़ने के लिए, टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में ट्यूब (के साथ खुला अपनी टोपियां) जगह है, और 60 मिनट के लिए सेते हैं. लीजिए उच्च ग्लूकोज सब के और इंसुलिन radioimmunoassay लिए बचाने के.

    3. Thymidine निगमन परख

    1. 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें, के बाद गंभीरता से ट्यूब के नीचे टापू पर बसे है, एक micropipette साथ में पीबीएस महाप्राण (व्यंजन), त्यागें, और यह दोहरानाएक बार कदम.
    2. 500 μl बर्फ ठंड trichloroacetic एसिड (TCA, 10% w / वी) जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
    3. 16 000 XG में 3 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूबों
    4. TCA महाप्राण (व्यंजन), 0.3 एन NaOH के 80 μl जोड़ने के लिए, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. इस समय के दौरान, सख्ती भंवर 5-10 एस के लिए नमूने हर 10 मिनट.
    5. 7 मिलीलीटर तरल जगमगाहट गिनती ट्यूब Econo सुरक्षित गिनती कॉकटेल के 4 मिलीलीटर जोड़ें.
    6. जोड़ें जगमगाहट ट्यूब की गिनती के लिए नमूना के 50 μl, ट्यूब टोपी, संक्षिप्त हिला और एक तरल जगमगाहट काउंटर में गिनती.
    7. प्रोटीन निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख और नमूने के 10 μl का उपयोग एकाग्रता को मापने.

    4. डेटा विश्लेषण

    1. इंसुलिन निर्माता प्रोटोकॉल के बाद radioimmunoassay प्रदर्शन करते हैं.
    2. प्रोटीन सान्द्र के साथ इंसुलिन स्राव और thymidine निगमन डेटा सामान्यकरेंentration.

    5. प्रतिनिधि परिणाम

    आइलेट और चूहा islets में बीटा सेल समारोह प्रतिकृति का आकलन करने के लिए प्रयोग का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस उदाहरण काल्पनिक जीन # 6 "विवेकशीलतापूर्वक बीटा सेल समारोह में फेरबदल के बिना आइलेट प्रतिकृति को बढ़ावा देने की है कि adenoviral overexpression से पता चलता है. शीर्ष पैनल में, thymidine निगमन परख से परिणाम दिखाना है कि "# 6 जीन" की अभिव्यक्ति में वृद्धि डीएनए संश्लेषण बढ़ जाती है, के रूप में thymidine का समावेश द्वारा मापा. क्योंकि चूहा आइलेट में कोशिकाओं के सबसे बीटा कोशिकाओं रहे हैं, यह संभावना है thymidine निगमन में इस वृद्धि बीटा सेल प्रतिकृति में वृद्धि इंगित करता है. हालांकि, पुष्टि प्रयोगों दृढ़ता से इस की स्थापना के लिए किया जाना चाहिए. वह नीचे के पैनल में, इंसुलिन के स्राव परख से परिणाम "# 6 जीन" प्राथमिक बीटा सेल कार्यों में से एक को बदल नहीं किया था, यानी, मैं कि overexpression प्रदर्शितकम और उच्च ग्लूकोज में nsulin स्राव. आइलेट और adenoviruses साथ इलाज के बाद islets के अलगाव के स्वास्थ्य की गुणवत्ता कम है और उच्च शर्करा की मात्रा में इंसुलिन का स्राव में वृद्धि गुना ने संकेत दिया है. यदि जीन # 6 "बिगड़ा बीटा सेल समारोह की अभिव्यक्ति में वृद्धि, इस संभावना उच्च, stimulatory ग्लूकोज सांद्रता (16.7 मिमी) में है secreted इंसुलिन में कमी के रूप में परिलक्षित होगा. ग्लूकोज अलग सांद्रता के लिए एक खुराक - प्रतिक्रिया वक्र भी किया जा सकता है.

    चित्रा 1
    चित्रा 1 प्रोटोकॉल का अवलोकन करने के लिए जीन अभिव्यक्ति में adenoviral की मध्यस्थता परिवर्तन के बाद अलग चूहा islets में आइलेट प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन. हौसले से अलग चूहा islets के 24 घंटे के लिए adenoviruses उजागर कर रहे हैं और फिर 96 घंटे के लिए सुसंस्कृत. Thymidine निगमन अंतिम 24 घंटे में मूल्यांकन किया है, इंसुलिन का स्राव पर माप के द्वारा पीछा कियाकम और उच्च ग्लूकोज.

    चित्रा 2
    चित्रा 2 नियंत्रण adenovirus और एक adenovirus एक काल्पनिक "# जीन 6" के रूप में लेबल जीन overexpressing का उपयोग करके प्रयोग से परिणाम. शीर्ष पैनल thymidine निगमन और नीचे पैनल इंसुलिन स्राव से पता चलता है.

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Discussion: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

रास्ते की स्थापना है कि प्रतिकृति को प्रोत्साहित करने के लिए और बीटा कोशिकाओं के समारोह बढ़ाने के लिए modulated किया जा सकता है मधुमेह के दोनों प्रमुख रूपों के लिए प्रासंगिक हैं. क्योंकि कार्यात्मक बीटा सेल जन अस्तित्व और इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं के समारोह पर निर्भर है, इन निर्धारकों आकलन के एक साथ अपने फायदे हैं. इस प्रोटोकॉल की पहचान है कि क्या या एक प्रोटीन की overexpression दमन कार्यात्मक बीटा सेल मास में इन विट्रो में परिवर्तन, जो तब vivo में प्रभावकारिता के लिए परीक्षण किया जा सकता है की ओर जाता है के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि आइलेट सहित कई प्रकार की कोशिकाओं, से मिलकर सूक्ष्म अंग है, लेकिन अल्फा, बीटा, डेल्टा, एप्सिलॉन, और पीपी कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है. आइलेट प्रतिकृति में एक परिवर्तन पूरी तरह से बीटा सेल प्रतिकृति में परिवर्तन करने के लिए अनुवाद नहीं क्योंकि चूहा आइलेट कोशिकाओं के 80-90% बीटा कोशिकाओं हो सकता है. संभावना है कि छोटा सा टाप में मनाया परिवर्तनप्रतिकृति गैर बीटा सेल प्रतिकृति मौजूद है के कारण है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लिए एक तार्किक और पुष्टि अगले कदम thymidine immunofluorescence या FACS 5,6 विश्लेषण करने के लिए मिलकर एनालॉग के उपयोग के साथ बीटा सेल प्रतिकृति की जांच सकता है. यह पुष्टि विश्लेषण भी गैर विशिष्ट प्रसार की स्वतंत्र टापू में thymidine निगमन की संभावित चिंता को कम कर सकते हैं.

एक अन्य संभावित वापसी adenoviruses की ट्रांसडकशन क्षमता में निहित है. 60-70% की एक पारगमन दक्षता को प्राप्त करने के लिए उचित है, लेकिन प्रभाव का एक महत्वपूर्ण निर्धारक adenoviral पारगमन समय है. यह अलग islets के रूप में जल्द से जल्द पारगमन क्षमता को अधिकतम करने के लिए adenoviruses में संस्कृति के लिए आवश्यक है. आइलेट अलगाव के बाद कुछ ही घंटों के भीतर आइलेट अनुबंध करने के लिए शुरू होता है, जिससे adenovirus के क्षमता आइलेट की कोर में गहरी पैठ सीमित है. एक पत्रकार के निर्माण के इस तरह के रूप में उपयोगएक adenovirus व्यक्त GFP, confocal माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित को पारगमन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है.

इस प्रोटोकॉल के प्राथमिक लाभ हैं: 1) islets की एक ही पूल पर कार्यात्मक बीटा सेल जन के कई निर्धारकों का परीक्षण करने की दक्षता और 2) प्रोटोकॉल (एक ठेठ चूहा आइलेट अलगाव 400 टापू पैदावार करने के लिए आवश्यक islets की छोटी संख्या) . ये फायदे इस प्रोटोकॉल एक मध्यम गति में कई जीनों के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.

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Disclosures: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

एनआईएच (PTF करने के लिए) से इस काम DK078732 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 media Gibco 11879
Penicillin/streptomycin Gibco 15140
6-well plate BD-Falcon 35-1146 Non-TC treated
[methyl-3H]-thymidine Perkin Elmer NET027Z001MC 1 mCi/ml
Micro-centrifuge tubes Denville C2170 1.7 ml
NaCl Sigma 59888
KCl Acros 42409
KH2PO4 Acros 20592
MgSO4 Acros 41348
CaCl2 Acros 34961
HEPES Sigma H0887 1 M solution
35% BSA Sigma A7979
NaHCO3 Acros 42427
d-glucose Sigma G8769
TCA Fisher Scientific SA9410-1 10% w/v
NaOH Acros 12426
Scintillation counting tube Sarstedt 58.536 7 ml, PP
Scintillation counting tube cap Sarstedt 65.816
Econo-Safe counting cocktail RPI 111175
Insulin RIA Siemens TKIN2
BCA Assay Kit Thermo Scientific 23250
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5415R
Scintillation counting tube rack Sarstedt 93.1431.001
Liquid scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb 2910TR

References: प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets

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