Konvertering av en ELISA för att en Luminex xMAP analys med hjälp av en Multiplex metod Antibody Screening

Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method. J. Vis. Exp. (65), e4084, doi:10.3791/4084 (2012).

Den immunadsorberande analys (ELISA) har länge varit det viktigaste verktyget för detektering av analyter av intresse i biologiska prover för både biovetenskaplig forskning och klinisk diagnostik. Har dock ELISA begränsningar. Det utförs typiskt i en 96-brunnars mikroplatta, och brunnarna belagda med infångande antikropp, vilket kräver en relativt stor mängd prov för att fånga en antigen av intresse. Den stora ytan av brunnarna och den hydrofoba bindningen av infångande antikropp kan också leda till icke-specifik bindning och ökad bakgrund. Dessutom har de flesta ELISA förlita sig på enzym-förmedlad förstärkning av signalen i syfte att uppnå rimlig känslighet. Sådan förstärkning är inte alltid linjärt och kan därmed skeva resultat.

Under de senaste 15 åren har en ny teknik fram som erbjuder fördelarna med ELISA, men också möjliggör högre genomströmning, ökad flexibilitet, minskad provvolym, och lägre kostnad, med en liknande workflow ^{1, 2.} Luminex xMAP Technology är en mikrosfär (pärla) array plattformen möjliggör både monoplex och analyser multiplex som kan tillämpas på både protein och nukleinsyra program syra ^3-5. Pärlorna har den infångande antikroppen kovalent immobiliserad på en mindre yta, som kräver mindre infångningsantikropp och mindre volymer prov, jämfört med ELISA-, och icke-specifik bindning är signifikant minskad. Mindre provvolymer är viktiga när man arbetar med att begränsa prover, såsom cerebrospinalvätska, ledvätska, etc. ^6. Multiplexering analysen ytterligare minskar kraven provvolym, vilket gör flera resultat från ett enda prov.

De senaste förbättringarna av Luminex är: det nya MAGPIX, ett mindre, billigare, lättare att använda analysator, låg koncentration Magnetic MagPlex Mikrosfärer som eliminerar behovet av dyra filter plattor och finns i en fungerande koncentration bättre lämpad för analys utveckling ochlåg genomströmning tillämpningar, och xMAP antikropp Coupling (ABC) Kit, som innehåller ett protokoll, reagens och förbrukningsvaror som behövs för koppling pärlor till infångningsantikroppen av intresse. (Se Material avsnitt för en detaljerad lista över kit innehåll.)

I detta experiment omvandla vi en pre-optimerad ELISA-analys för TNF-alfa cytokin till xMAP plattformen och jämföra resultatet av de två metoderna ^7-11. TNF-alfa är en biomarkör för mätning av inflammatoriska responser i patienter med autoimmuna sjukdomar.

Vi börjar med att koppla fyra antikroppar kandidat fånga till fyra olika mikrosfär uppsättningar eller regioner. När de blandas ihop dessa fyra uppsättningar möjliggöra samtidig testning av alla fyra kandidater med fyra separata detektionsantikroppar att bestämma den bästa antikroppen paret, spara reagenser, prov och tid. Två xMAP analyser sedan konstrueras med de två mest optimala antikroppspar och deras prestanda ärjämfört med den för den ursprungliga ELISA-analys i avseende på signalstyrka, dynamiskt område och känslighet.

I. Beredning av reagens

1. Antikropp Urval och förberedelse
   1. Identifiera de antikroppar som skall användas vid experimentet.
      1. Fyra infångningsantikroppar: specifika för humant TNF-alfa, antingen monoklonala eller polyklonala, alla samma värd arter.
      2. Fyra detektionsantikroppar: • specifik för human TNF-alfa, antingen omodifierad, biotinylerad, eller PE-konjugerade.
      3. En bekräftelse antikropp: PE-konjugerad och specifika för värdarten av infångningsantikroppar.
   2. Lös upp alla antikroppar till tillverkaren rekommenderade arbetar koncentrationer.
   3. Välj fyra injektionsflaskor med låg mikrosfär Koncentration MagPlex (sträng) uppsättningar eller regioner, till exempel Luminex artikelnummer MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID och MC10015-ID.
2. Koppling av antikroppar till MagPlex Mikrosfärer, med användning av xMAP antikropp (ABC) Koppling Kit
   ReFER till ABC Kit Bruksanvisning (Del # 89-00002-00-319) för hela kopplingen förfarandet. (Obs: Ljuskänslig mikrosfärer bör skyddas från ljus så är möjligt.)
   1. Bringa reagensen i ABC-kit till rumstemperatur och label fyra rör reaktionsbetingelser med vulsten regionkoder valda för kopplingsreaktionen. Överför innehållet i de fyra flaskor MagPlex pärlor (1 ml vardera eller 2,5 x 10 ⁶ kulor) i de fyra märkta reaktionsrören.
   2. Tvätta varje pärla uppsättningar två gånger i 500 | il av aktiveringsbuffert, såsom beskrivs i ABC-kit manualen.
   3. Aktivera varje pärla uppsättning med 480 | il av aktivering buffert, 10 pl av Sulfo-NHS och 10 | il av EDC-reagens, i enlighet med proceduren i ABC-kit manuell, och inkubera under 20 minuter. (Obs!. EDC reagens måste beredas i 250 pl Aktivering Buffer omedelbart före detta steg)
   4. Upprepa föregående tvättsteget med nu "aktiveras" mikrosfärer totalt Three gånger med 500 | il av aktiveringsbuffert, såsom beskrivs i ABC-kit manualen.
   5. Beredning av fyra separata lösningar, var och en innehåller 7,5 pg (dvs 3 ^ g / miljon mikrosfärer) av infångningsantikroppen i aktiveringsbuffert.
   6. Lägga till dessa fyra lösningarna infångningsantikropp till sina respektive reaktionsrör, vortexa varje rör omedelbart, och inkubera under två timmar på en rotator.
   7. Upprepa föregående tvättsteget med nu "kopplad" mikrosfärer totalt tre gånger med 500 | il av tvättbufferten medföljer ABC-kit.
   8. Efter den slutliga tvättsteget, tillsätt 500 pl tvättbuffert i varje reaktionsrör att tillhandahålla en slutlig stamkoncentration av 5 miljoner antikropp-kopplade pärlor per ml. Vortexa och sonikera reaktionsrören för att dispergera mikrosfärer.
      OBS: Delvis dränka den slutna mikrosfären flaskan i ett ultraljud renare fylld med avjoniserat vatten ger en effektiv ultraljudsbehandling för alla tvättsteg. (Se Material tabell för equipment detaljer.)
   9. Förvara kopplade pärlorna vid 2-8 ° C och skyddas från ljus tills det behövs.
3. Räkning av Kopplade mikrosfärer
   1. Räkna antalet mikrosfärer som utvanns efter kopplingsreaktionen med användning av en cellräknare eller hemacytometer. Se räkna instrumentets bruksanvisningen för lämpliga instruktioner för detta. Återhämtningen från kopplingsreaktionen är typiskt över 90%.
4. Koppling Bekräftelse
   1. Bekräfta kopplingsreaktionen var framgångsrik genom framställning testlösningar av de kopplade pärlor lagren för varje uppsättning, varvid den slutliga koncentrationen på 100 pärlor / pl i analysbuffert (PBS med 1% BSA). Framställ utspädningar av fykoerytrin-märkt (PE-)-anti-species IgG bekräftelse antikropp vid 4 | ig / ml i analysbuffert.
   2. Alikvot 50 | il av varje testlösning i fyra brunnar i en rundbottnad, 96-brunnsplatta, för totalt 16 brunnar. Tillsätt sedan 50 μL analysbuffert till åtta av brunnarna, för att mäta bakgrund och 50 pl av utspätt bekräftelse antikropp i de åtta återstående brunnarna.
   3. Blanda reaktionerna försiktigt genom att pipettera upp och ned flera gånger med en flerkanalig pipett. Täck plattan och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur på en plattskakanordning.
   4. Placera plattan på en magnetisk platta separator under 1-2 minuter för att dra pärlorna ut ur lösningen. Ta sedan bort vätskan genom kraftfullt vända plattan, medan separatorn, över en avfallsbehållare.
   5. Tvätta varje brunn två gånger genom tillsats av 100 | il analysbuffert och avlägsnande av supernatanten från plattan på ett liknande sätt med användning av magnetisk platta separatorn.
   6. Återsuspendera pärlorna i 100 | il analysbuffert genom att försiktigt pipettera upp och ned fem gånger med en flerkanalig pipetten.
   7. Analysera på ett Luminex xMAP instrumentet, såsom MAGPIX instrumentet. Intensiteten hos den fluorescerande signalen från denna reaktion är directly är proportionell mot mängden av protein på ytan av pärlorna, vilket ger en snabb bedömning av den relativa mängden av protein som är kopplad till pärlorna.
5. Koppling Biotin med omodifierad antikroppar för detektion
   1. Vid användning av omodifierade detektionsantikroppar, biotinylera dessa antikroppar med Thermo Fisher EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin reagens (Kat. Nr PI-21.335) och förfarandet beskrivet i förpackningen. Gång biotinylerad, kan de detektionsantikroppar senare märkas med streptavidin fykoerytrin (SA-PE) vid analysen (steg III.6.) Så att de kan detekteras med xMAP analysator.

II. Analys inställning

1. Framställa en första blandning av alla fyra bead uppsättningar genom att sätta 10 jil av vardera 0,96 ml av PBS med 1% BSA (analysbuffert. Se Material tabell) för att bestämma vilken som är mest effektiv med xMAP Assay.
2. Bered lösningarna detektionsantikropp med diluting vardera 1 | ig / ml i analysbuffert.
3. Förbered R & D Systems TNF-α protein standard vid 2000 pg / ml i analysbuffert.
4. Späd den streptavidin-rPhycoerythrin (SA-PE) (förutsatt @ 1 mg / ml) till 8 | ig / ml i analysbuffert.

III. Antikroppsscreening

1. Tillsätt 50 pl av den antikropp-kopplade mikrosfär blandningen till vardera av 16 brunnar av en Costar rundbottnad 96-brunnsplatta för screening-analysen.
2. Tillsätt 50 pl analysbuffert till 8 av de 16 brunnarna, för att mäta bakgrund.
3. Tillsätt 50 pl R & D Systems TNF-α standard (@ 2.000 pg / ml) till de andra 8 brunnar, för att mäta svar.
4. Inkubera under en timme vid rumstemperatur, skyddad från ljus, under skakning på en analysplatta skakanordning.
5. Tillsätt 50 pl av vardera av de fyra detektionsantikroppar till fyra brunnar (två bakgrund och två respons) och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur, skyddade från ljus, under skakning på en analysplatta shaker.
6. Tillsätt 50 pl av den SA-PE-reagens till alla brunnarna och inkubera 15 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus, under skakning på en analysplatta skakanordning.
7. Placera plattan på en magnetisk platta separator i en minut och ta sedan bort vätskan genom kraftfullt vända plattan.
8. Tillsätt 100 pl analysbuffert till var och en av de 16 brunnar, placera plattan på den magnetiska plattan separator i en minut och ta sedan bort vätskan genom kraftfullt vända plattan samtidigt på separatorn.
9. Tillsätt 100 pl analysbuffert till var och en av de 16 brunnar och läs plattan med Luminex MAGPIX instrumentet, med hänvisning till bruksanvisningen för korrekt funktion.
10. Välj en antikropp par som uppfyller önskad signalstyrka.

IV. xMAP Funktionell analys

1. Efter val av den bästa infångande antikroppen, utspädd 100 | il av denna antikropp-kopplad vulst lager (från steg IB8) till 10 ml med analysbuffert.
2. Tillsätt 50 pl avDe utspädda pärlorna till 78 brunnar i två Costar rundbottnade 96-brunnsplattor. (78 brunnar x 2 plattor = 156 brunnar) Varje platta kommer att användas för att bedöma prestandan hos en annan detektionsantikropp.
3. Förbered en 12-punkters standardkurva, med början på 8000 pg / ml och slutar vid 4 pg / ml, med R & D Systems TNF-α-standarden. Tillsätt sex 50 | il replikat av varje spädning till var och en av plattorna, plus sex brunnar med 50 ^ il analysbuffert vardera, såsom en bakgrund, för totalt 78 brunnar per platta.
4. Inkubera plattorna under en timme vid rumstemperatur, skyddad från ljus, under skakning på en analysplatta skakanordning.
5. Tillsätt 50 pl av den första detekteringssignalen antikropp mot alla 78 brunnarna i den första plattan. Upprepa för den andra detektionsantikropp på den andra plattan.
6. Inkubera plattorna under 30 minuter, vid rumstemperatur, skyddad från ljus under skakning på en analysplatta skakanordning.
7. Tillsätt 50 pl av den SA-PE-reagens till alla brunnarna i varje platta.
8. Inkuberade två plattorna under 15 minuter, vid rumstemperatur, skyddad från ljus under skakning på en analysplatta skakanordning.
9. Placera plattorna på magnetiska platta separatorer för en minut sedan bort vätskan genom kraftfullt vända plattan samtidigt på separatorn.
10. Tillsätt 100 pl analysbuffert till var och en av de 78 brunnar på plattorna, placera plattorna magnetplattan separatorer för en minut sedan bort vätskan genom kraftfullt vända plattan.
11. Tillsätt 100 pl analysbuffert till var och en av de 78 brunnar på plattorna och analysera på MAGPIX instrumentet, med hänvisning till bruksanvisningen för korrekt funktion.

V. ELISA-analys

1. Följ instruktionerna som medföljer R & D Systems Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA-kit (R & D art.nummer DY210), mäta svaret genereras av standard försedd med R & D kit. Upprepa ELISA-analysen tre gånger, varvid R & D Systems infångning och detektion ANTibodies med antikropparna från de andra leverantörer. För enkelhets skull par antikropparna från leverantören (t ex Millipore infångningsantikropp med Millipore detektionsantikropp, Abcam infångande antikropp med Abcam detektionsantikropp, etc).
2. Utvärdera varje par oberoende av varandra, såsom krävs av ELISA-format, med vardera av de tre TNF-a proteinstandarder.

VI. Representativa resultat

Detta protokoll visar hur en typisk ELISA kan omvandlas till den xMAP plattformen under utnyttjande av multiplex förmåga teknik för att snabbt optimera analysen. ELISA användes i detta exempel var human tumömekrosfaktor-alfa (TNF-α) DuoSet ELISA-kit från R & D Systems (R & D Del # DY210).

Förutom den antikropp-par finns i kitet har tre andra antikroppspar från olika källor (se Material tabellen) utvärderas samtidigt med användning av xMAP plattformen. FoUr av antikropparna betecknades som infångande antikroppar och kopplades till MagPlex låg koncentration mikrosfärer. De andra fyra antikropparna betecknades som detektionsantikroppar, av vilka tre köptes som biotin-kopplad och den fjärde biotinylerades såsom beskrivits i protokollet.

Antikropparna för denna studie valdes utifrån tillgänglighet och leverantör. Men i praktiken inställningen bör antikroppar väljas utifrån den enskilde användarens önskemål och tidigare resultat erfarenhet av denna antikropp. Även om detta försök inte testa lämpligheten av en antikropp som infångande antikropp mot detektionsantikropp, kan detta protokoll enkelt modifieras för detta ändamål.

Luminex xMAP analyserna utfördes som en multiplex att utvärdera alla fyra infångningsantikroppar som en blandning, genom att kombinera fyra uppsättningar av TNF-α-antikropp kopplad MagPlex mikrosfärer. De infångande antikropparna utvärderades med var och en av de fyrabiotinylerade detektionsantikroppar individuellt, så att interaktionen av en detektionsantikropp med var och en av de fyra infångningsantikroppar kunde bestämmas samtidigt. Fyra sådana analyser, som utförs parallellt, bestämdes växelverkan av alla fyra detektionsantikroppar med alla fyra infångningsantikroppar. Figur 1 visar de jämförande data från dessa screeningsanalyser.

Resultaten visade att antikroppen paret från R & D Systems DuoSet utförs bäst med en resulterande svar vid 6183 Median fluorescensintensitet (MFI) enheter. Det observerades också att detekteringsnivådata antikropparna från Millipore (86% i R & D antikroppspar respons) och Abcam (67%) gav en rimlig känslighet i xMAP analysen, när de kombineras med R & D Systems infångningsantikropp. De infångande antikroppar från Abcam, Millipore och Novus producerade en mindre önskvärd svar i xMAP analysen.

Det är viktigt att notera, att den purställning för denna studie är inte nödvändigtvis att belysa skillnader mellan vissa antikroppar eller leverantörer, utan endast för att illustrera att det finns observerbara skillnader i prestanda när de används under liknande förhållanden, och att xMAP plattformen kan erbjuda ett effektivt sätt att bedöma dessa skillnader.

R & D Systems DuoSet protokoll användes för att jämföra de fyra antikroppspar i en ELISA-format. R & D Systems protokoll användas med alla antikroppspar eftersom det är reflekterande av typiska ELISA-protokoll utbredda idag och det är analogt med protokoll som används med xMAP teknik. De ELISA-test visade att antikroppen par från R & D Systems igen gav de bästa resultaten (figur 2). Antikroppen par från Abcam gav ingen respons och paren antikropp från Millipore och Novus producerade blygsamma svar.

För att bedöma varje variation i antikroppsreaktivitet med standarden, alla fyra antikropy par testades med tre olika rekombinanta TNF-a proteinstandarder från tre olika leverantörer (se Material tabell). Data i figur 2 visar att de rekombinanta TNF-a proteinstandarder från de tre leverantörer gav ekvivalenta resultat.

TNF-α proteinet från R & D Systems användes för att generera standardkurvor med ELISA (tabell 1) och de xMAP analyser (tabell 2 och 3). Medan ELISA-analysen gjordes med R & D Systems antikropp par utnyttjat xMAP analyserna R & D Systems infångande antikropp och antingen detekteringsantikroppen från R & D Systems eller Millipore. TNF-α protein från R & D Systems späddes för att producera en rad koncentrationer från 8000 till 4 pg / ml. Endast antikroppen par från R & D Systems produceras det förväntade utfallet i xMAP analysen med ett svar> 20.000 MFI, som visas i tabell 2 ochFigur 3. När detektionsantikropp från Millipore användes med xMAP Analys på plats i R & D Systems detektionsantikropp (tabell 3), varvid svaret (6000 MFI) var ca 30% av den respons som erhålls med detektionsantikropp från R & D Systems; såsom visas i Figur 3.

Av värdena i tabell 1 representerar den standardkurva av ELISA, som hade en tillverkarens rekommenderade TNF-α intervallet 16 till 1000 pg / ml. Detta intervall är mycket begränsat på grund av OD vid 1000 pg / ml fanns något större än 2 OD-enheter och spektrofotometern är oförmögen att mäta ovan 3 OD. På grund av gränsen med spektrofotometer, var det inte möjligt att öka utbudet av ELISA-analysen ytterligare. Dessutom visar värdena i Tabell 1 indikerar att R & D Systems DuoSet ELISA är inte i stånd att detektera TNF-α vid koncentrationer mycket mindre än 16 pg / ml. Å andra sidan är det xMAP analys som kan mätaIng TNF-α vid en koncentration på mindre än 7,8 pg / ml med infångningsantikroppen från R & D Systems i kombination med detektionsantikropp antingen från R & D Systems eller Millipore.

Det dynamiska området och känsligheten hos båda metoderna illustreras bättre när plottas i en log-log-skala (Figur 4). En tydlig skillnad mellan lutningen hos de ELISA responser och svaren från de xMAP analyser kan man se att ytterligare indikerar en mer begränsande kapacitet för detektering av TNF-α med ELISA, vid både högre och lägre koncentrationer.

Gränserna för detektering (LOD) för de två funktionella TNF-a xMAP analyser approximeras genom att identifiera den lägsta TNF-α koncentration med en observerad respons nivå (MFI) som är större än bakgrunden, plus tre gånger dess standardavvikelse (SD). För att uppnå statistisk signifikans, replikerar sex användes för att bestämma SD för både xMAP och ELISA-metoder. These uppskattningar av LOD är optimistiska och syftar till att ge en "best-case" scenario, med insikten att det i normala driftsförhållanden bara två eller tre replikat kommer att användas. I tabell 2 kan man konstatera att, vid användning av R & D Systems par, den lägsta TNF-α koncentrationen vid 3,91 pg / ml gav ett svar av 66 MFI, som är större än svaret av bakgrunden + 3SD som uppfyller dessa kriterier . När Millipore detektionsantikropp användes med R & D Systems Capture antikropp (tabell 3) var detektionsgränsen mindre än 7,81 pg / ml. I detta fall producerade 2: a lägsta TNF-α koncentrationen ett acceptabelt svar av den 17 MFI, större än svaret av den lägsta TNF-α koncentrationen plus tre gånger standardavvikelsen. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) På samma sätt var detektionsgränsen för R & D Systems DuoSet ELISA uppskattades vara mellan 63 pg / ml och 31 pg / ml (tabell 1).

Figur 1. Den median fluorescensintensitet (MFI) i R & D Systems standard (@ 2.000 pg / ml) för varje möjlig kombination av de fyra infångningsantikroppar (kopplat till fyra olika mikrosfär regioner) och de fyra antikropparna upptäckt. Klicka här för att visa en större figur .

Figur 2. Den optiska densiteten (OD) av tre olika rekombinanta standarder (@ 1.000 pg / ml) för fyra avskiljning och upptäckt antikroppar kombinationer par. Fånga och upptäckt antikroppar godtyckligt parade med säljaren, för enkelhetens skull. Klicka här för att visa en större bild .

Tabell 1 Den optiska densiteten (OD) av 2-faldig utspädningsserie anges av R & D Systems DuoSet förpackningsbilaga, för användning som en standardkurva;. Inklusive standardavvikelse (SD) och den beräknade gränsen för detektering (LOD), mellan 31,3 pg / ml och 63 pg / ml.

Tabell 2 Medianen fluorescensintensitet (MFI) av en standardlösning spädningsserie mätt xMAP teknik, med hjälp av antikroppen paret medföljer R & D Systems DuoSet,. Med standardavvikelse (SD) och den uppskattade detektionsgränsen (LOD), mindre än 3,91 pg / ml.

Tabell 3 Medianen fluorescensintensitet (MFI) av en standardlösning spädningsserie mätt xMAP teknik, med hjälp av R & D Systems infångningsantikroppen och EMD Millipore detektionsantikropp,. Med standardavvikelse (SD) och den uppskattade detektionsgränsen (LOD), mindre än 7,81 pg / ml.

Figur 3. Standardkurvorna för de två xMAP analyser och R & D Systems DuoSet ELISA. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. En jämförelse av de xMAP standardkurvorna och ELISA standardkurva i ett log-log skala. Klicka här för att visa en större bild .

Omvandlingen av en ELISA-analys till Luminex xMAP plattform kan vara så enkelt som att ersätta streptavidin pepparrotsperoxidas (SA-HRP) i en typisk ELISA kit med streptavidin fykoerytrin (SA-PE), och optimera för prestanda. För dem som vill skapa en xMAP immunanalys från grunden, kan detta ske med ett enkelt protokoll som även möjliggör snabb, multiplex utvärdering av antikroppar par. Reagenserna för xMAP analysen var lätt framställas med användning av xMAP Antikropp Koppling kit för att koppla de utsedda infångningsantikroppar att MagPlex låg koncentration mikrosfärer. Användningen av låga koncentrationen mikrosfärer minskar kostnaderna för analysen utveckling samtidigt ger samma analys prestanda högre koncentration mikrosfärer. Den tid som krävs för att framställa kopplad MagPlex mikrosfärer är cirka 3 timmar, vilket är mycket snabbare än den 22 - 24 timmar som krävs för att belägga brunnen i en ELISA-platta, följt av behandlingav de belagda brunnarna. Utförandet av xMAP analysen är också överlägsen den ELISA med avseende på detektionsgränsen (<4 pg / ml vs> 31 pg / ml) och dynamiskt område (<4 pg / ml till> 8000 pg / ml vs 16 pg / ml till 1000 pg / ml). Plattan läsare har en begränsad OD intervall som är antingen 3 eller 4 OD, begränsar den övre gränsen för det dynamiska området för en analys.

Utan tvekan kommer inte alla antikroppar arbeta i en ELISA-format och att inte alla antikroppar som fungerar bra i ett ELISA är lätt att överföra till den xMAP analysformat. Eftersom xMAP analyser kan multiplexeras (dvs, köras samtidigt), är det möjligt att utvärdera ett flertal avskiljning och upptäckt kombinationer antikroppar samtidigt för att identifiera det bästa paret att använda för en analys. Denna process sparar mycket tid och reagenser jämfört med ELISA-utvecklingen förfarandet, som är begränsad till utvärderingen av ett par i taget. Om två eller flera antikroppar par utföra likvärdigt, andra parametrar i analysen kananses att bestämma lämpligheten av paret (t.ex., tillgänglighet, kostnad, etc).

Förutom förbättrad analys prestanda och flexibilitet med xMAP analysen finns det också betydande kostnadsbesparingar. Den rekommenderade mängden antikropp som krävs för att belägga en enda brunn i en ELISA-platta är 400 ng, medan den mängd som krävs för pärlorna som används i en brunn av en xMAP analys är approximativt 7,5 ng. Sålunda kan mängden antikroppar som krävs för en ELISA-brunn kommer att ge mer än 50 testresultaten, om den används i en xMAP analys. För tillämpningar med dyrbara prover har xMAP också en betydande fördel. Provmängden som rekommenderas för ELISA är 100 | il medan den volym som krävs för xMAP analysen kan vara hälften av eller mindre.

Sammanfattningsvis är omvandling av en ELISA-analys till Luminex xMAP plattformen okomplicerad, effektiva och kostnadsbesparande, samtidigt som det producerar en analys med överlägsen dynamik och känslighet.

Detta arbete utfördes vid Luminex Corporation med utrustning tillverkas vid Luminex Corporation.

R & D Systems & EMD Millipore är strategiska partners till Luminex Corporation; tillstånd att utveckla och kommersialisera multiplex xMAP baserade analyser.

Detta arbete har finansierats av Luminex Corporation.

1. Fulton, J.R., McDade, R.L., Smith, P.L., Kienker, L.J., & Kettman, J.R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
2. Carson, R.T. & Vignali, A.A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
3. Peck D., Crawford E.D., Ross K.N., Stegmaier K., Golub T.R., & Lamb J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, R61 (2006).
4. VanDerMeid, K.R., Su, S.P., Krenzer, K.L., Ward, K.W., & Zhang, J.Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
5. Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., & Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
6. de Jager, W., Prakken, B.J., Bijlsma, J., W.J. Kuis, W., & Rijkers, G.T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
7. Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I.D., Lonita, A.C., & Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
8. de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B.J., Kuis, W., & Rijkers, G.T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
9. DuPont, N.C., Wang, K.H., Wadhwa, P.D.,Culhane, J.F., & Nelson, E.L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
10. Richens, J.L., Urbanowicz, R.A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., & Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
11. Rizzi, G., Zhang, Y.J., Latek, R., Weiner, R., & Rhyne, P.W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2,1561-1572 (2010).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.