Создание определяемых газообразных сред для изучения влияния гипоксии на

Emily M. Fawcett^1,2, Joseph W. Horsman¹, Dana L. Miller¹

¹Department of Biochemistry, University of Washington, ²Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

1. Строительство экологической палаты

1. Выберите наименьший разумный объем камеры, необходимые для сферы вашего проекта. Палата должна быть изготовлена ​​из газов (O ₂₎ непроницаемый материал. Pyrex кристаллизации блюда, Anaeropack коробки или большие литые акриловые коробки (Ellard Instrumentation), могут быть использованы. Мы обнаружили, что 9 50 мм пластин может поместиться в 100 х 50 KIMEX блюдо кристаллизации. Стеклянные пластины можно использовать в качестве крышки для посуды Pyrex кристаллизации.
2. Просверлите отверстие в выбранной камере и установить с пластиковой мужчина Luer для штуцером для шланга установки (Cole Parmer). Фурнитура может быть обеспечено путем трубопроводной арматуры или эпоксидной смолой. Установить аналогичную установку на противоположной стороне контейнера, чтобы обеспечить поток газа в и из камеры. Если это возможно, смещение отверстия увеличить турбулентного перемешивания.
3. Получить сжатых газовых цистерн с определенной концентрации O ₂ (сбалансирована с N _2), которые сертифицированы стандартом для O ₂ сотрудничествеntent или, при отсутствии кислорода, чистого N ₂ (<10 мг O _2). Использование автоматического переключения на регуляторы для долгосрочных исследований, чтобы избежать нарушения кислорода в палаты.
4. Организменном ответ на гипоксию было показано, что зависит от температуры ^15. Установив камеру в инкубаторе, различных температурах может быть сохранен. Температура в инкубаторе может быть неравномерным и, таким образом, целесообразно использовать регистратор данных температуры постоянно измерять температуру внутри камеры.

2. Подключение газа к экологической палаты

1. Для всех соединений, использовать одну восьмую-дюймовый внешний диаметр труб связана либо оснастки разъемы или компрессионные фитинги. Трубы должны быть непроницаемыми и инертен по отношению к O _2, таких, как фторированные пропилена этилена (FEP) или нейлона (Cole Parmer). Для схема завершения установки, см. рис 1.
2. Подключите комнажата газовых баллонов на устройство управления потоком, такие как контроллер массового расхода (Сьерра-инструменты) или ротаметр (Aalborg). Убедитесь, что давление на входе в резервуар находится в пределах потока устройства и штуцером для шланга арматуры. Двухступенчатые регуляторы, как правило, используется, со вторым этапом значение требуемого давления [См. раздел три для выбора соответствующего расхода]
3. Гидратов газа через кипящей дистиллированной воды с помощью газового баллона промыть фриттованного цилиндра, то прямой в одну из арматуры на окружающую камеру, оставляя вторую установки открыты для выхлопных газов (см. Рисунок 1). Для краткосрочных исследованиях, гидратации газов защищает от пластины dessication, но контроля влажности могут быть необходимы для долгосрочных исследований.
4. Dow Corning Вакуумная смазка может использоваться для герметизации камеры. Место веса на крышке камеры для обеспечения герметичного уплотнения. Чтобы убедиться в герметичности и адекватного потока, провести небольшой бассейн с водой в ладони унаши руки в перчатках, чтобы из установки на камеры и проверьте пузыри.

3. Выбор скорости потока

1. Предполагая, совершенный смешивания, есть 90% газообмена газовой атмосферы каждый раз объем камеры заменяют (закон Фика). Например, в 100 мл камеру с расходом 100 мл / мин, воздушный оригинальный дом в камере будет заменено 90% от желаемого газа через 1 минуту, и будет асимптотически приближаться полный обмен на 90% каждую минуту в последующий период.
2. Высшее расхода и меньше контейнеров достигнет желаемой концентрации кислорода быстрее. Для 100 х 50 KIMEX контейнеров (400 см), скорость потока 120 мл / мин достигнет 99,9% в обмен за 10 минут (3 обменов). Этот расход подходит для большинства условий кислорода. Насколько нам известно, не было систематического исследования того, как скорость изменения концентрации O ₂ влияет на ответ на C. Элеганс.

1. Черви подвержены условиях гипоксии обычно вырваться на поверхность агара. Чтобы избежать этого, поместите кольцо пальмитиновой кислоты (10 мг / мл в этаноле) по краям пластин. Пальмитиновая кислота выйдет из решения, как этанол испаряется, образуя физический барьер. Пальмитиновая кислота барьеры не влияют на скорость откладки яиц, плодовитости и продолжительности жизни C. Элеганс ^16,17. Зарывшись в землю, не чаще возникают в условиях гипоксии, так что дополнительные профилактические меры, как правило, не требуется.
2. 1. Создание синхронизированных популяций отбеливания беременных взрослых в небольшую каплю щелочного раствора отбеливателя на unseeded нематода рост средств массовой информации (НГО) пластины ^18. В отличие от стандартных большие партии гипохлорита отбеливания протоколы, выбрать 1-100 животных в капле раствор отбеливателя на поверхности пластины НГО, а затем позволить раствор отбеливателя для поглощения в пластине
   2. Не подвергайте беленой эмбрионов к гипоксии, так как это может уменьшить жизнеспособность ^13. Для сбора молодых эмбрионов (2-4 ячеек), беременных взрослых может быть нарезанной в небольшом объеме воды с лезвием и эмбрионов переехал в пластины в рот пипеткой для последующего воздействия гипоксии.
3. Уплотнение пластин в экологической палаты. Контрольные животные должны содержаться в нормоксии (дом воздуха) при той же температуре, как лечение глистов. Существует не наблюдается различий между образцами оставил в доме воздух и те, которые поддерживаются в одинаковом камера с домом воздуха, проходящего через них. Начать газа и поддерживать экспозиции нужное время. Для обеспечения единообразия в рампу, убедитесь, чтозаменить воду в бутылку газ мыть перед экспозицией.
4. Для анализа выживаемости эмбрионов, позволят червям развиваться в течение 48 часов после возвращения в помещение воздух, после чего они должны быть личинок четвертого возраста / дня взрослых. Оценка за выживание, любая цензура червей, которые не могут быть учтены.
5. Для визуализации животных, подвергшихся воздействию гипоксии, двигаться червей каплю M9 на 22 мм ² покровного и обратить на площадке в 2% агарозном в M9 ^18. При необходимости, левамизол (25 мм) или азид натрия (10 мМ) можно использовать в качестве анестезии. Азид натрия и левамизол могут запутать некоторых замечаний в связи с токсичностью и должны быть разумно использованы ^19.

5. Быстрое Урожай гипоксия, подвергшихся воздействию черви (Пример: Подготовка проб для HIF-1 Западно-анализ)

Многие гипоксии-индуцированные эффекты быстро обратный по возвращении в помещение воздуха, включая возобновление производства яиц ^12, фосфорилирование митотического эпитоповв эмбриогенезе ¹³ и деградации HIF-1 белок ^9,20. Быстрая изоляция животных, подвергшихся воздействию гипоксии, необходимые для получения воспроизводимых эффектов в этих условиях. С помощью этой установки, животные могут быть собраны и замораживали в жидком азоте в течение менее двух минут. В то время как перчатка камерах коробка гипоксии позволяют манипуляции образцов в бескислородных условиях, их стоимость и практичность в условиях, отличных от гипоксии ограничивает их полезность.

1. Рост Бристоль N2 червей 4 10 см роста (HG) пластин до большинства червей беременных взрослых ^18. Вымойте червей на 15 мл коническую трубку с 1:05 щелочным раствором отбеливателя и инкубировать при вращении до черви начинают растворяться, не более 5 минут ^9. Вымойте червей в три раза с М9, летел вниз со скоростью 1500 мкг между каждой стирки, не торможение.
2. Пластина беленой эмбриона на 8 150 мм пластин НГО и позволяют развиваться личинки L4 (~ 48 часов Бристоль N2 при 22 ° C).Перемещение плит климатические камеры и подвергать воздействию гипоксии (1000 млн., 5000 т) и бескислородных (N2) условиях в течение 4 часов. Экспозиция раз будет меняться в зависимости от эксперимента. В то время как воздействие гипоксии, оказывает непосредственное влияние на скорость откладки яиц, два эмбриона клетки умирают после 16-18 часов после заражения ^12. При этом гипоксия установки камеры, нижний предел воздействия ограничивается скоростью обмена атмосферу, необходимые для достижения равновесия.
3. Этикетка один 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и один 15 мл коническую трубку для каждого экспериментального образца. Черви воздействию гипоксии, скорее всего, придерживаться стороны трубки во время сбора урожая. Чтобы избежать этого, место 100 мкл 1% сульфата натрия додецилсульфат (SDS) в каждой 15 мл коническую трубку. Если SDS препятствует течению приложений, бычий сывороточный альбумин (BSA) может быть использован для предотвращения прилипания. Регулярное использование SDS или BSA, кажется, не имеют очевидной разницы. Добавить 50 мкл 2x белка загрузки красителя (4% SDS, 10% 2-меркаптоэтанола ислед бромфенол синего в 30% глицерина (вес / объем)) в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. У Дьюара с жидким азотом готовы.
4. Время действия после удаления червей от гипоксии и записи. Снимите крышку с гипоксической камере, возьмите один образец пластины, и запечатать камеру. Использование дистиллированной воды, чтобы вымыть червей на нейлоновый фильтр, а затем вылейте в 15 мл коническую трубку. Вращайте червей вниз в настольном центрифуге при 1500 мкг в течение 15-20 секунд с тормозом.
5. Использование вакуума для удаления большей части супернатанта из трубки, в результате чего червь гранулы нетронутыми.
6. Используя пипетку, переместите червь гранул в 50 мкл до 1,5 трубки микроцентрифужную мл. Уплотнение труб и погружают в жидкий азот.
7. Повторяйте, пока не все образцы были выделены. Выполните следующие процедуры для дома воздух контрольных образцов на соответствие. Образцы могут храниться при температуре -20 ° C.

6. Представитель Результаты

Организменном последствия гипоксии можно увидетьпутем изучения жизнеспособности во взрослую жизнь С. Элеганс (рис. 2). Эмбрионы заложены дикого типа Бристоль (N2) и HIF-1 (ia04) удаление всех мутантов выживают в доме воздухе концентрации O ₂ (210 000 частей на миллион O _2). N ₂ черви способны адаптироваться и выжить во взрослую жизнь в 5000 частей на миллион O _2, в то время как HIF-1 эмбрионы нежизнеспособны. Это показывает, что HIF-1 имеет важное значение для адаптации к изменению уровня кислорода, доступного в среде ^10. Ни N2 ни HIF-1 животные могут выжить экспозиции до 1000 частей на миллион O _2.

Визуализация червя непосредственно в условиях гипоксии возможна с использованием рассечения масштаб и ясно контейнер (рис. 3). Непосредственно размещение гипоксии камеры на вскрытии рамки, нет необходимости удалять червей от гипоксии наблюдать организменном реакций. В комплект может быть оснащен флуоресценции illumation (как на рисунке 3

Рисунок 1. Пример Гипоксия камеры. Направление потока газа обозначено стрелками. Газ хранится в сжатом газе танки с определенной концентрации O ₂ (1) и двухступенчатый регулятор прилагается (2). Газ поступает в нижнюю часть трубки потока (3), выход на верхний правильный расход. Газ поступает затем в колбу пузырь (4), увлажняющие газа (обеспечения правильного подключения пузырь колбу, наблюдая за пузырями). Гидратированный газа, то переходит в камере гипоксии при впадении клапана (5), подвергая образцы к гипоксии. Газ, наконец, отверстия в помещение через выхлопные отверстия в камере.

Рисунок 2. Жизнеспособность эмбрионов подвергается до 1000 частей на миллион O _2, 5000 частей на миллион O 2). Эмбрионы подвергались каждый кислорода условиях эмбрионы в течение 24 часов в непрерывном потоке кислорода камеры. Черви были перемещены в гипоксическим условиям, позволили разработать для взрослых в течение 48 часов, а затем забил за жизнеспособность во взрослую жизнь. п> 50, N = 5.

Рисунок 3. Визуализация C. Элеганс в условиях гипоксии с микроскопом. Черви подвергаются гипоксии использование методов, описанных. Прозрачная экологической палаты (построен с блюдом пирекса кристаллизации и стеклянной пластины) находится непосредственно на стадии вскрытия области. Два мнения показал, один в том числе весь поток газа созданы, другие только с камерой на предметный столик микроскопа.

Этот метод представляет собой стратегию построения гипоксическая среда, которая позволяет для сред с точной концентрацией кислорода, который ведется в лаборатории. Эти камеры обеспечивают простой метод для раскрытия организмов к конкретным низкой концентрации O ₂ и мониторинга молекулярные и физиологические результаты. Экологические камеры описана собрана в лаборатории, а не промышленно и могут быть изменены таким образом, чтобы соответствовать потребностям эксперимента.

Одно неоспоримое преимущество этого метода заключается в непрерывном дизайн потока. Это позволяет избежать трудностей, обычно возникающих при сохранении низкой концентрации O ₂ в камерах, когда внешний O ₂ концентрация значительно выше (210 000 частей на миллион O ₂ в воздухе помещения). В качестве альтернативы можно остановить поток метод, в котором гипоксическая среда поддерживается в герметичной камере. Даже небольшая утечка, которая может быть трудно обнаружить, предварительновыход содержания гипоксических условиях с использованием остановить поток методами. Метод непрерывного потока постоянного обмена воздуха в камере с определенной концентрацией кислорода в баке сжатого воздуха и поддерживает избыточное давление, что предотвращает утечку нарушая условиях гипоксии.

Получение точных, предварительно смешанной концентрации кислорода от поставщика газа решает еще одну трудную задачу с гипоксией. Это довольно трудно измерить очень низкие концентрации O _2. Большинство O ₂ датчиков, ограниченной диффузией и довольно дорого. Поскольку O ₂ диффундирует медленно, измерения малых концентраций O ₂ может быть медленным или неточной ^21. С другой стороны, это достаточно легко генерировать газовых смесей путем измерения веса газов. Смеси мы регулярно покупать сертифицированные стандартные быть в пределах 2% O ₂ Содержание желаемого сочетания.

Этот метод может быть использован, чтобы вызвать наблюдаемые чypoxia изменений, вызванных как на организменном и молекулярном уровне. Хотя этот метод описывается выживание анализов и быстрой изоляции целого червя для молекулярных опытов, есть множество ниже показаний, которые могут быть использованы. Например, эта конструкция позволяет направлении визуализации червей в условиях гипоксии для изучения реального поведения времени и изменения в конструкции репортер. Чтобы представить себе червей рассечения области, собрать камеру использование прозрачных урн с малым объемом и минимальной высоты. Вся камера может быть размещена на вскрытии масштабам и легко маневренные для оптимальной визуализации (см. Рисунок 3). Было бы также можно наблюдать образцы в большем увеличении перфузии с помощью камеры с инвертированным микроскопом. Это требует некоторой адаптации камеры к его интерфейс с трубкой, который обычно используется для газа, и определить соответствующую скорость потока. Представитель результаты показали лишь поверхностно экспериментальных возможможности, как гипоксия было показано, что влияет на клеточные системы от синтеза ДНК в деградации белка ^22,23.

Практический характер этого метода не ограничивается C. Элеганс. тех пор, пока соответствующие размеров камер, этот метод легко адаптироваться практически к любой модели системы. Для адаптации к жидкой среде или культуре клеток, диффузию кислорода констант в растворе, дегазации из пластика и время, чтобы уравновесить в культуре должно быть принято во внимание, и она может быть наиболее целесообразно использовать O ₂ пластины проницаемой культуры ^24,25.

Это можно изменить камер, представленных в этом протоколе для использования с другими газами. Например, камеры могут быть адаптированы к обеспечивать бескислородной среде просто, опуская O ₂ в сжатые газовых цистерн используется для создания гипоксии камеры (с баланса заполняется азотом). Это позволило наблюдение C. Элеганс в суспзакончился анимации (данные не представлены) ^10,13,26. Незначительные изменения должны быть сделаны на основе свойств газовой смеси используются. В состав трубки используются для газопровода в и из камеры, возможно, придется менять. Некоторые пластмассы являются проницаемыми для CO _2, в то время как другие, не совместимые с агрессивными газами такие есть сероводород (H ₂ S) ^16,26. Список совместимых пластмасс можно найти на Коула-Parmer сайте.

Для токсичных газов газа на выходе из камеры должна быть снабжена вентиляционными отверстиями в сертифицированных вытяжной шкаф и соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как датчики, должны быть использованы. Кроме того, EH & S офицеры должны проводить консультации перед началом любой эксперимент с использованием потенциально опасных газов. Коррозионные газы могут также требуют особого внимания. Например, H ₂ S может разъедать многие пластмассы, используемые в стандартных материалов труб, а также латунных фитингов частицы, вызывающие коррозию. Мы вообще убедиться, что все мокрыеТед пластика Kalrez или эквивалент в инструменты, используемые с H ₂ S. Некоторые газы могут взаимодействовать с примесей в водопроводной воде, так DIH ₂ 0 следует использовать в пузырьке колбу. Особые соображения, касающиеся посуда также может потребоваться, например, H ₂ S необходимым оборудованием с смачиваемых уплотнительных колец.

Оба организменном и молекулярные изменения наблюдаются использованием экспериментов, которые могут быть завершены в течение дня. Эта способность быстро вводить образцы к гипоксии представляет собой ценный инструмент в областях, от старения и рака развитие.