Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar

Emily M. Fawcett^1,2, Joseph W. Horsman¹, Dana L. Miller¹

¹Department of Biochemistry, University of Washington, ²Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

1. De bouw van het milieu Chambers

1. Selecteer de kleinste redelijke hoeveelheid ruimte die nodig is voor de omvang van uw project. Kamer moet worden gemaakt van gas (O ₂₎ ondoorlatend materiaal. Pyrex kristallisatie gerechten, Anaeropack dozen, of grote gegoten acryl dozen (Ellard Instrumentation), kunnen worden gebruikt. Wij hebben gevonden dat 9 50 mm platen past in een 100 x 50 Kimex kristallisatie schotel. Glasplaten kan worden gebruikt als deksels Pyrex kristallisatie schotels.
2. Boor een gat in de geselecteerde kamer en past met een plastic mannelijke Luer de slang weerhaak fitting (Cole Parmer). Beslag kan worden beveiligd door pijp montage of met epoxy. Plaats een dergelijke inrichting aan de andere zijde van de houder mogelijk te maken gas in-en uitstromen van de kamer. Zo mogelijk te verhelpen gaten om turbulente menging te verhogen.
3. Zorg voor samengeperst gas tanks met gedefinieerde O ₂ concentraties (in balans met N ₂₎ die standaard zijn gecertificeerd voor O ₂ content of anoxische omstandigheden voor zuiver _N2 (<10 ppm O _2). Gebruik automatische omschakeling regelgevende instanties voor de langere termijn studies om te voorkomen dat het verstoren van de zuurstof in de kamers.
4. Organismale reactie op hypoxie is gebleken temperatuurafhankelijk ^15. Door de kamer in een incubator, kunnen verschillende temperaturen worden gehandhaafd. De temperatuur in een broedmachine kan zijn ongelijk en als zodanig, is het verstandig om gebruik te maken van een temperatuur datalogger om de temperatuur constant te meten in de kamer.

2. Aansluiten van de gas naar de milieu-kamer

1. Voor alle aansluitingen, gebruik maken van een achtste-inch buiten-diameter buis met elkaar verbonden door ofwel snel connectors of klemkoppelingen. Tubing moet dicht en reageert met O _2, zoals fluorethyleen propyleen (FEP) of nylon (Cole Parmer). Voor een schematische voorstelling van de setup voltooid, zie figuur 1.
2. Sluit de comingedrukt gastanks op een flow control apparaat, zoals een massastroom controller (Sierra Instruments) of rotameter (Aalborg). Controleer voordruk van de tank in de range van de debieten inrichting en de slangaansluiting inrichting. Twee-traps regelaars zijn over het algemeen gebruikt, met de tweede fase op de gewenste druk [Zie hoofdstuk drie voor het selecteren van de juiste debiet]
3. Hydrate het gas door borrelen door middel van gedestilleerd water met behulp van een gas wasfles met gefrit cilinder, dan direct in een van de fittingen op de milieu-kamer, waardoor het tweede hulpstuk open voor gas uitlaat (zie figuur 1). Voor de korte termijn studies, gas hydratatie beschermt tegen uitdroging plaat, maar de vochtigheid controle kan nodig zijn voor de lange termijn studies.
4. Dow Corning Vacuum vet kan worden gebruikt om de kamer af te dichten. Plaats gewichten op het deksel van de kamer om een ​​luchtdichte verzegeling. Om een ​​goede afdichting en voldoende stroom te bevestigen, het bezit van een kleine plas water in de palm van yonze gehandschoende hand om de uit montage op de kamer en controleer of bellen.

3. Selecteren van Flow Rate

1. Uitgaande perfecte menging is er 90% gas uitwisseling van het gasvormige atmosfeer telkens het volume van de kamer wordt vervangen (Fick zijn). Bijvoorbeeld, in 100 cc kamer met een debiet van 100 cc / min, de oorspronkelijke huis lucht in de kamer worden vervangen door 90% van het gewenste gas na 1 minuut en volledige uitwisseling asymptotisch benaderen 90% per minuut daarna.
2. Hogere debieten en kleinere containers bereikt uw gewenste zuurstofconcentratie sneller. 100 x 50 Kimex containers (400 cc), een debiet van 120 cc / min bereikt 99,9% uitwisseling in 10 minuten (3 uitwisseling). Dit debiet is geschikt voor de meeste zuurstof omstandigheden. Voor zover wij weten is er geen sprake van een systematisch onderzoek naar de manier waarop de mate van verandering van O _{2-concentratie} van invloed op de respons in C. elegans.

1. Worms blootgesteld aan hypoxische omstandigheden vaak ontsnappen aan de oppervlakte van agar platen. Om dit te voorkomen plaats een ring palmitinezuur (10 mg / ml in ethanol) om de rand van de platen. De palmitinezuur zullen uit de oplossing ethanol verdampt, waardoor een fysieke barrière. Palmitinezuur barrières hebben geen invloed op snelheid van leg, vruchtbaarheid en levensduur in C. elegans ^16,17. Gravende niet vaker voor te komen in hypoxische omstandigheden, zo extra preventieve maatregelen in het algemeen niet nodig.
2. 1. Genereer gesynchroniseerd populaties door het bleken zwangere volwassenen in een klein druppeltje bleekwater alkalische oplossing op ongeplaatste nematode groei van media (NGM) platen ^18. In tegenstelling tot standaard grote batch hypochlorietbleken protocollen pak 1-100 dieren in een druppel bleekwateroplossing op het oppervlak van een NGM plaat, dan kan de oplossing bleek te absorberen in de plaat
   2. Vermijd blootstelling van gebleekt embryo's aan hypoxie, want dit kan levensvatbaarheid ¹³ te verminderen. Om jonge embryo's (2-4 cellen) te verzamelen, kunnen zwangere volwassenen worden gehakt in een klein volume water met een scheermesje en embryo's verplaatst naar platen via de mond pipet voor latere blootstelling aan hypoxie.
3. Seal-platen in de klimaatkamer. Controle dieren worden gehouden in normoxia (huis lucht) op dezelfde temperatuur als behandeld wormen. Er is geen waarneembaar verschil tussen monsters meer in huis lucht die onderhouden dezelfde kamer met huis lucht die over zijn. Start gasstroom en onderhouden van blootstelling voor de gewenste tijd. Om uniformiteit in de helling te garanderen, moet uvervangen water in het gas wasfles voor de belichting.
4. Om test overleving van embryo's, zodat de wormen gedurende 48 uur te ontwikkelen na de terugkeer naar de kamer van de lucht, op welk punt zij de vierde stadium larven / dag een volwassenen. Score om te overleven, censureren alle wormen die niet kunnen worden verantwoord.
5. Om dieren blootgesteld aan hypoxie te visualiseren, te verplaatsen wormen tot een daling van de M9 op een 22 mm ² dekglaasje en omkeren op een pad van 2% agarose in M9 ^18. Indien nodig levamisool (25 mM) en natriumazide (10 mM) kan worden gebruikt als verdoving. Natriumazide en levamisol kunnen beïnvloeden enkele opmerkingen in verband met toxiciteit en moet oordeelkundig worden gebruikt ^19.

5. Snelle Oogst van hypoxie-blootgestelde Worms (Voorbeeld: Voorbereiding van monsters voor HIF-1 West-analyse)

Veel hypoxie-geïnduceerde effecten zijn snel omgekeerd bij terugkeer naar de kamer van de lucht, met inbegrip van de hervatting van de productie van eieren ^12, fosforylering van mitotische epitopenin embryogenese ¹³ en afbraak van het HIF-1 eiwit ^9,20. Rapid isolatie van dieren blootgesteld aan hypoxie moet reproduceerbaar te bekomen bij deze voorwaarden. Met deze opzet kunnen dieren worden geoogst en ingevroren in vloeibare stikstof in minder dan twee minuten. Terwijl handschoenenkastje hypoxie kamers geven voor manipulatie van de monsters in zuurstofloze omstandigheden, de kosten en uitvoerbaarheid van andere omstandigheden dan anoxie beperken hun nut.

1. Grow Bristol N2 wormen op 4 10 cm hoge groei (HG) platen tot een meerderheid van de wormen zijn zwangere volwassenen van ^18. Was wormen 15 ml conische buis met een 1:5 alkalische bleekwateroplossing en geïncubeerd met de rotatie tot wormen beginnen op te lossen niet meer dan 5 minuten ^9. Was de wormen drie keer met de M9, af te draaien bij 1500 xg tussen elke wasbeurt zonder remmen.
2. Plaat gebleekt embryo op 8 150 mm NGM platen en laat ontwikkelen L4 larven (~ 48 uur Bristol N2 bij 22 ° C).Beweeg platen klimaatkamers en blootstellen aan hypoxische (1000 ppm, 5000 ppm) en anoxische (N2) voorwaarden gedurende 4 uur. De belichtingstijden variëren afhankelijk van de opzet van het experiment. Hoewel blootstelling aan hypoxie heeft een direct effect op de snelheid van de eileg, twee cellen embryo's sterven na 16-18 uur van de blootstelling aan ^12. Met deze hypoxie kamer configuratie, zijn de ondergrens van de blootstelling beperkt door de snelheid van de atmosfeer uitwisseling nodig is om evenwicht te bereiken.
3. Label een 1,5 mL microfugebuis en een 15 ml conische buis voor elke experimentele monster. Worms blootgesteld aan hypoxie hebben meer kans om aan de zijkanten van de buis plakken tijdens het oogsten. Om dit te voorkomen plaats 100 pi 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) in elk 15 ml conische buis. Als SDS remt afgeleide toepassingen, runderserum albumine (BSA) gebruikt kan worden om plakken te voorkomen. Routinematig gebruik van SDS of BSA lijkt niet om een ​​duidelijk verschil te hebben. Voeg 50 pi 2x eiwit lading kleurstof (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol ensporen broomfenolblauw in 30% glycerol (w / v)) aan de 1,5 mL microfugebuis. Heb een Dewar van vloeibare stikstof klaar.
4. De tijd van de stappen na het verwijderen van de wormen van hypoxie en record. Verwijder het deksel aan de hypoxische kamer, neem een ​​monster plaat, en sluit de kamer. Gebruik gedestilleerd water om de wormen te wassen op een nylon filter en vervolgens in de 15 ml conische buis gieten. Draai de wormen in een desktop-centrifuge bij 1500 xg gedurende 15-20 seconden met rem.
5. Gebruik vacuüm meeste supernatant uit de buis, waarbij de worm pellet onaangeroerd.
6. Met behulp van een pipet, verplaatst u de worm pellet in 50 ul van de 1,5 ml microfugebuis. Sluit de buis en ondergedompeld in vloeibare stikstof.
7. Herhaal dit tot alle monsters zijn geïsoleerd. Volg deze procedures voor het huis de lucht controlemonsters voor de consistentie. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.

6. Representatieve resultaten

Organismale van hypoxie te ziendoor onderzoek van de mogelijkheden met betrekking tot de volwassenheid van C. elegans (figuur 2). Embryo's gelegd door wild-type Bristol (N2) en HIF-1 (ia04) deletiemutanten zijn allemaal te overleven in het huis van de lucht O _{2-concentratie} (210.000 ppm O _2). N ₂ wormen zijn in staat aan te passen en tot volwassenheid te overleven in 5.000 ppm O _2, terwijl de HIF-1 embryo's niet levensvatbaar zijn. Hieruit blijkt dat HIF-1 is essentieel voor aanpassing aan de veranderende hoeveelheid zuurstof in de omgeving ^10. Noch N2 of HIF-1 dieren overleven blootstelling aan 1000 ppm O _2.

Visualiseren worm direct hypoxie is mogelijk met het gebruik van een ontleding strekking duidelijk container (figuur 3). Door direct plaatsen van de hypoxie kamer op de snijkamer toepassingsgebied is er geen noodzaak om de wormen uit hypoxie tot organismale reacties te observeren. De omvang kunnen worden voorzien fluorescentie illumation (zoals in figuur 3

Figuur 1. Voorbeeld Hypoxie kamer. Richting van de gasstroom wordt aangegeven door pijlen. Gas wordt opgeslagen in tanks samengeperst gas met vaste O ₂ concentraties (1) en een twee trap is bevestigd (2). Gas komt de bodem van de meetbuis (3), die uit de top van de juiste debiet. Gas stroomt in de ballon vat (4), hydraterende het gas (correcte aansluiting van bel door te kijken kolf belletjes). Gehydrateerd gas stroomt vervolgens in de kamer hypoxie in de instroom klep (5), waardoor de monsters hypoxie. Het gas uiteindelijk openingen in de ruimte door middel van een uitlaat gat geboord in de kamer.

Figuur 2. Levensvatbaarheid van embryo's worden blootgesteld aan 1.000 ppm O _2, 5000 ppm O 2). Embryo's werden blootgesteld aan zuurstofgehalte als embryo gedurende 24 uur continue stroom zuurstof kamers. Worms werden verplaatst naar normoxische voorwaarden, toegestaan ​​om naar de volwassenheid te ontwikkelen voor 48 uur, en scoorde voor de levensvatbaarheid naar volwassenheid. n> 50 N = 5.

Figuur 3. Visualisatie van C. elegans in hypoxie met microscopie. Worms worden blootgesteld aan hypoxie met behulp van de geschetste methoden. De transparante milieu-kamer (gebouwd met een pyrex kristallisatie schotel en glazen plaat) wordt direct geplaatst op het podium van een dissectie scope. Twee visies worden getoond, waarvan een inclusief de gehele gasstroom opgezet, de andere met alleen de kamer op de microscoop podium.

Deze methode een strategie voor het construeren een hypoxische omgeving waarin voor omgevingen nauwkeurige zuurstofconcentraties worden gehandhaafd in het laboratorium. Deze kamers een eenvoudige werkwijze voor het belichten organismen specifieke lage concentraties O ₂ en controle van de moleculaire en fysiologische uitgangen. De beschreven klimaatkamer wordt samengesteld door het laboratorium plaats van commercieel gekocht en kan dus worden aangepast aan de behoeften van het experiment te passen.

Een duidelijk voordeel van deze methode is het doorstroom ontwerp. Dit elimineert de moeilijkheden die zich normaliter op met het handhaven van lage concentraties van O ₂ in kamers als de externe O _{2-concentratie} is veel hoger (210.000 ppm O ₂ in de kamer lucht). Het alternatief is gestopt-flow methode, waarbij een hypoxische omgeving wordt gehandhaafd in een afgesloten ruimte. Zelfs kleine lekken, die moeilijk op te sporen, preontlucht de onderhoud van hypoxische omstandigheden met behulp gestopt-flow methoden. De continue flow methode voortdurend uitwisseling van de lucht in de kamer met de gedefinieerde zuurstofconcentratie in de perslucht tank en zorgt voor een positieve druk die lekken voorkomt het verstoren van de hypoxische condities.

Het verkrijgen van exacte, pre-mixed zuurstofconcentraties bij hun gasleverancier lost een ander moeilijk probleem met hypoxie. Het is heel moeilijk te meten extreem lage concentraties O _2. De meeste O ₂ sensoren zijn verspreiding beperkt en vrij duur. Omdat de O ₂ diffundeert langzaam, kan het meten van lage O _{2-concentratie} traag of onjuist is ^21. Daarentegen is het zeer eenvoudig gasmengsels genereren door het gewicht van gassen. De mengsels we regelmatig te kopen zijn gecertificeerd standaard binnen 2% O _2-gehalte van de gewenste mix.

Deze methode kan worden gebruikt om waarneembare h opwekkenypoxia-geïnduceerde veranderingen zowel op het organismale en moleculair niveau. Hoewel deze methode schetst overleven testen en snelle hele worm isolatie voor moleculaire experimenten, zijn er talloze downstream uitlezingen die kunnen worden gebruikt. Zo, laat dit ontwerp voor de richting visualisatie van wormen in hypoxie voor studie van de real-time gedrag en veranderingen in reporter constructen. Om wormen met een dissectie omvang zichtbaar te maken, monteert u de kamer met behulp van transparante dozen met klein volume en een minimale hoogte. De gehele ruimte kan worden geplaatst op de snijkamer omvang en gemakkelijk wendbaar optimale visualisatie (zie figuur 3). Het zou ook mogelijk monsters nemen bij een grotere vergroting met perfusie kamers met een omgekeerde microscoop. Dit vereist enige aanpassing van de kamers om het te laten werken met slangen die normaal gesproken wordt gebruikt voor de gasstroom, en bepaal een geschikte debiet. De getoonde representatieve resultaten alleen maar krassen op het oppervlak van de experimentele possibilijkheden, zoals hypoxie is aangetoond dat cellulaire systemen invloed van DNA synthese eiwitafbraak ^22,23.

De praktische aard van deze methode is niet beperkt tot C. elegans. Zolang geval grote kamers worden gebruikt, is deze methode gemakkelijk kunnen vrijwel elke modelsysteem. Voor aanpassing aan vloeibare of celkweek, zuurstof diffusieconstanten in oplossing ontgassing van kunststof en tijd evenwicht in cultuur moet worden gehouden en kan het meest geschikt is O ₂ permeabele kweekplaten ^24,25.

Het is mogelijk aan te passen de kamers in dit protocol voor gebruik met andere gassen. Zo kan kamers worden aangepast aan een zuurstofloos milieu voorzien alleen door weglating van de O ₂ in het gecomprimeerde gas tanks een hypoxie kamer (het saldo wordt gevuld met stikstof) te maken. Dit heeft het mogelijk gemaakt voor observatie van C. elegans in suspeindigde animatie (gegevens niet getoond) ^10,13,26. Geringe wijzigingen worden aangebracht op de eigenschappen van het gebruikte gasmengsel. De samenstelling van de slang die de pijp gas in en uit de kamer kan worden gevarieerd. Sommige kunststoffen zijn doorlaatbaar voor CO _2, terwijl anderen zijn niet compatibel met corrosieve gassen zoals is waterstofsulfide (H ₂ S) ^16,26. Een lijst met compatibele plastics zijn te vinden op de Cole-Parmer website.

Voor toxische gassen het gas uitlaat van de kamer moet worden ontlucht in een gecertificeerde zuurkast en de juiste persoonlijke bescherming, zoals detectoren, moet worden toegepast. Bovendien moet EH & S-officieren worden geraadpleegd voor het begin van een experiment met behulp van mogelijk gevaarlijke gassen. Bijtende stoffen kunnen ook bijzondere aandacht. Zo kan _H2S corrosie veel kunststoffen in standaard buis materiaal als koper passende corrosie. Wij over het algemeen ervoor te zorgen dat alle natteTed plastic is Kalrez of het equivalent in instrumenten die gebruikt worden met H ₂ S. Bepaalde gassen kunnen interageren met verontreinigingen in leidingwater, zodat dih ₂ 0 worden gebruikt in de ballon kolf. Speciale overwegingen met betrekking tot glaswerk kan ook nodig zijn, bijvoorbeeld, H ₂ S noodzakelijk apparatuur met natte O-ringen.

Zowel organismale en moleculaire veranderingen in acht worden genomen gebruik te maken van experimenten die kunnen worden ingevuld in een dag. Dit vermogen om snel monsters te introduceren aan hypoxie is een waardevol instrument in de velden van veroudering en kanker tot ontwikkeling.