La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell'ipossia sulla

Emily M. Fawcett^1,2, Joseph W. Horsman¹, Dana L. Miller¹

¹Department of Biochemistry, University of Washington, ²Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

1. Costruzione di camere ambientali

1. Selezionare il più piccolo volume ragionevole di camera richiesta per l'ambito del progetto. Sezione deve essere fatta di gas (O ₂₎ materiale impermeabile. Piatti cristallizzazione Pyrex, scatole Anaeropack o grandi cast-acrilici scatole (Ellard Instrumentation), possono essere utilizzati. Abbiamo scoperto che 9 50 piastre mm possono andare bene in un piatto x 100 50 cristallizzazione Kimex. Lastre di vetro possono essere usati come coperchi per piatti di cristallizzazione Pyrex.
2. Praticare un foro nella camera selezionata e montare con un maschio di plastica al raccordo Luer Portagomma (Cole Parmer). Raccordi possono essere garantiti da raccordo o con resina epossidica. Installare un raccordo simile sul lato opposto del contenitore per consentire al gas di fluire dentro e fuori della camera. Se possibile, compensare i fori per aumentare la miscelazione turbolenta.
3. Ottenere serbatoi di gas compressi con definiti O ₂ concentrazioni (bilanciato con N ₂₎ che sono certificati standard per O ₂ content o, per condizioni anossiche, puro N ₂ (<10 ppm O _2). Utilizzare commutazione automatica regolatori per studi a lungo termine per evitare di compromettere i livelli di ossigeno nelle camere.
4. Risposta organica all'ipossia ha dimostrato di essere dipendente dalla temperatura ^15. Inserendo la camera in un incubatore, temperature differenti può essere mantenuta. Le temperature all'interno di un incubatore può essere irregolare e come tale, è prudente fare uso di un registratore di dati di temperatura per misurare costantemente la temperatura all'interno della camera.

2. Collegamento del gas per la camera ambientale

1. Per tutte le connessioni, utilizzare un ottavo-pollici esterno-diametro del tubo collegato con dei connettori a scatto o raccordi a compressione. Tubi deve essere impermeabile e non reattivo con O _2, come etilene propilene fluorurato (FEP) o nylon (Cole Parmer). Per uno schema della configurazione completata, vedi Figura 1.
2. Collegare il comserbatoi premuto in un dispositivo di controllo del flusso, ad esempio un controllore di flusso di massa (Sierra Instruments) o rotametro (Aalborg). Assicurarsi che la pressione a monte del serbatoio è entro la portata del dispositivo di flusso ed i raccordi a gomito. Due stadi regolatori sono generalmente utilizzati, con la seconda fase impostato la pressione desiderata [Vedere la sezione tre per la selezione del tasso adeguato flusso]
3. Idrato il gas da gorgogliare attraverso acqua distillata utilizzando una bottiglia di lavaggio con gas cilindro poroso, poi diretta in uno dei raccordi sulla camera ambientale, lasciando il secondo raccordo aperto per gas di scarico (vedi figura 1). Per studi a breve termine, l'idratazione gas protegge essiccazione piatto, ma il monitoraggio dell'umidità può essere necessario per studi a lungo termine.
4. Dow Corning grasso vuoto può essere usato per sigillare la camera. Pesi di luogo sul coperchio della camera di garantire una tenuta ermetica. Per confermare una perfetta tenuta ed un adeguato flusso, tenere una piccola pozza d'acqua nel palmo della yla mano guantata al raccordo sulla camera e verificare la presenza di bolle.

3. Selezione Portata

1. Supponendo perfetta miscelazione, non vi è scambio di gas 90% dell'atmosfera gassosa ogni volta che si sostituisce il volume della camera (legge di Fick). Ad esempio, in una camera 100 cc con una portata di 100 cc / min, l'aria casa originale nella camera sarà sostituito con il 90% del gas desiderato dopo 1 minuto, e si avvicinano asintoticamente cambio completo del 90% ogni minuto successivamente.
2. Portate superiori e piccoli contenitori raggiungeranno la concentrazione di ossigeno desiderata più rapidamente. Per 100 x 50 Kimex contenitori (400 cc), una portata di 120 cc / min raggiungerà il 99,9% in 10 minuti scambio (scambi 3). Tale portata è adatto per la maggior parte delle condizioni di ossigeno. A nostra conoscenza non vi è stato uno studio sistematico di come il tasso di variazione della concentrazione di O ₂ influenza la risposta in C. elegans.

1. Worms esposti a condizioni di ipossia comunemente sfuggire alla superficie delle piastre di agar. Per evitare ciò, posizionare un anello di acido palmitico (10 mg / ml in etanolo) attorno al bordo delle lastre. L'acido palmitico uscirà soluzione evapora etanolo, formando una barriera fisica. Barriere acido palmitico non influiscono tasso di deposizione delle uova, fecondità o la durata della vita in C. elegans ^16,17. Burrowing non si verifica più frequentemente in condizioni di ipossia, le misure preventive in modo supplementari non sono generalmente richiesti.
2. 1. Genera popolazioni sincronizzati da sbiancamento adulti gravide in una piccola goccia di soluzione di candeggina non teste di serie alcalina nematodi crescita dei media (NGM) piastre ^18. A differenza dei tradizionali grandi lotti protocolli ipoclorito sbiancanti, raccogliere 1-100 animali in una goccia di soluzione di candeggina sulla superficie di una piastra NGM, quindi consentire la soluzione di candeggina per assorbire nella piastra
   2. Evitare di esporre embrioni sbiancato di ipossia, in quanto ciò può ridurre la vitalità ^13. Per raccogliere embrioni giovani (2-4 cellule), gli adulti gravide può essere tagliato in un piccolo volume di acqua con una lama di rasoio e gli embrioni si trasferisce a piastre pipettare bocca per una successiva esposizione all'ipossia.
3. Sigillare le piastre nella camera ambientale. Gli animali di controllo devono essere tenuti in normossia (casa aria) alla stessa temperatura come vermi trattati. Non c'è alcuna differenza osservabile tra i campioni rimasti in casa aria e quelli mantenuti in una camera identica a casa l'aria che scorre su di loro. Avviare il flusso di gas e mantenere l'esposizione per il tempo desiderato. Per garantire l'uniformità in rampa, assicuratevi disostituire l'acqua nella bottiglia del gas di lavaggio prima dell'esposizione.
4. Per la sopravvivenza degli embrioni test, permettono di sviluppare i vermi per 48 ore dopo il ritorno in aria ambiente, a quel punto dovrebbero essere quarta fase delle larve / giorno uno adulti. Punteggio per la sopravvivenza, censura i vermi che non possono essere contabilizzate.
5. Per visualizzare animali esposti ad ipossia, spostare i vermi ad una goccia di M9 su un 22 mm ² coprioggetto, e capovolgere su un blocco di agarosio al 2% in M9 ^18. Se necessario, levamisolo (25 mM) o di sodio azide (10 mM) può essere utilizzato come anestetico. Azide di sodio e levamisolo può confondere alcune osservazioni a causa della tossicità e dovrebbe essere usato con giudizio ^19.

5. Harvest rapida di ipossia esposti a Worms (Esempio: Preparazione dei campioni per HIF-1 Analisi occidentale)

Molti ipossia effetti indotti sono rapidamente invertito al rientro in aria ambiente, compresa la ripresa della produzione di uova ^12, la fosforilazione di epitopi mitotichein embriogenesi ¹³ e degradazione della proteina HIF-1 ^9,20. Isolamento rapido degli animali esposti a ipossia è necessario per ottenere effetti riproducibili in queste condizioni. Con questa configurazione, gli animali possono essere raccolti e congelati in azoto liquido in meno di due minuti. Mentre guanto camere ipossia box consentono la manipolazione dei campioni in condizioni anossiche, il loro costo e praticità per condizioni diverse da anossia limitare la loro utilità.

1. Grow Bristol vermi N2 su 4 10 cm ad alta crescita (HG) piastre fino la maggioranza dei vermi adulti sono gravide ^18. Lavare vermi ad un tubo 15 ml contenente una soluzione alcalina candeggina 1:5 e incubare con rotazione fino vermi inizia a dissolversi, non più di 5 minuti ^9. Lavare i vermi tre volte con M9, riducendo la velocità a 1500 xg tra ogni lavaggio senza frenatura.
2. Embrioni piastra sbiancato su 8 150 piastre NGM mm e permettono di sviluppare per le larve L4 (~ 48 ore per Bristol N2 a 22 ° C).Spostare le piastre di camere per prove ambientali e di esporre a ipossia (1.000 ppm, 5000 ppm) e anossiche (N2) le condizioni per 4 ore. I tempi di esposizione variano a seconda del modello sperimentale. Mentre l'esposizione all'ipossia ha un effetto immediato sul tasso di deposizione delle uova, due embrioni di cellule muoiono dopo 16-18 ore di esposizione ^12. Con questa configurazione camera di ipossia, il limite inferiore di esposizione è vincolata dal tasso di cambio atmosfera necessaria per raggiungere l'equilibrio.
3. Etichettare una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e un tubo di 15 ml per ogni campione sperimentale. Worms esposti a ipossia è più probabile che aderisca alle pareti del tubo durante la raccolta. Per evitare questo, posto 100 pl di solfato di sodio 1% dodecil (SDS) in ogni provetta 15 mL conico. Se SDS inibisce applicazioni a valle, albumina di siero bovino (BSA) può essere utilizzato per evitare che si attacchi. L'uso routinario di SDS o BSA non sembra avere una differenza apparente. Aggiungere 50 pl di colorante 2x proteina di carico (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanolo etraccia di blu di bromofenolo in 30% glicerolo (w / v)) per il tubo per microcentrifuga 1,5 ml. Avere un Dewar di azoto liquido pronto.
4. Ora i passi dopo aver rimosso i vermi da ipossia e record. Togliere il coperchio della camera ipossica, prendere un piatto del campione, e richiudere la camera. Usare acqua distillata per lavare i vermi su un filtro di nylon e poi versare nel tubo di 15 ml. Spin i vermi verso il basso in una centrifuga desktop a 1500 xg per 15-20 secondi con freno.
5. Utilizzare un vuoto per rimuovere la maggior parte del surnatante dal tubo, lasciando intatto il verme pellet.
6. Usando una pipetta, spostare il verme pellet in 50 microlitri al tubo microcentrifuga 1,5 ml. Sigillare il tubo e immergere in azoto liquido.
7. Ripetere fino a quando tutti i campioni sono stati isolati. Seguire queste procedure per la casa di campioni di controllo dell'aria per coerenza. I campioni possono essere conservati a -20 ° C.

6. Risultati rappresentativi

Organismal effetti dell'ipossia può essere vistoesaminando la vitalità fino all'età adulta di C. elegans (Figura 2). Gli embrioni di cui da wild-type Bristol (N2) e HIF-1 (IA04) mutanti di delezione sono tutti a sopravvivere in casa aria concentrazioni di O ₂ (210.000 ppm O _2). N ₂ worm sono in grado di adattarsi e sopravvivere fino all'età adulta in 5000 ppm O _2, mentre HIF-1 embrioni non sono vitali. Ciò dimostra che HIF-1 è essenziale per adattarsi al cambiamento dei livelli di ossigeno disponibile nell'ambiente ^10. Né N2 né HIF-1 gli animali possono sopravvivere l'esposizione a 1000 ppm O _2.

Visualizzazione verme direttamente in ipossia è possibile con l'uso di un ambito dissezione e contenitore trasparente (Figura 3). Con direttamente ponendo la camera ipossia sulla portata dissezione, non vi è alcuna necessità di rimuovere i vermi da ipossia osservare reazioni organismi. La portata può essere dotato illumation fluorescenza (come in figura 3

Figura 1. Esempio di ipossia camera. Direzione del flusso di gas è indicata dalle frecce. Il gas è stoccato in serbatoi di gas compresso con definite concentrazioni di O ₂ (1) e un regolatore di due fasi è collegato (2). Gas entra nella parte inferiore del tubo di flusso (3), esce dalla parte superiore alla portata corretta. Gas quindi fluisce nel pallone bolla (4), idratante il gas (garantire il corretto collegamento del pallone bolla osservando bolle). Idrato gas passa poi nella camera di ipossia alla valvola di afflusso (5), esponendo i campioni a ipossia. Il gas infine aperture nella camera attraverso un foro di scarico praticato nella camera.

Figura 2. La vitalità degli embrioni esposti a 1000 ppm O _2, 5000 ppm O 2). Embrioni sono stati esposti a condizioni ciascuno di ossigeno come embrioni per 24 ore in camere di flusso continuo di ossigeno. Worms sono stati spostati verso condizioni di normossia, ha permesso di sviluppare verso l'età adulta per 48 ore, e poi ha segnato per la vitalità fino all'età adulta. n> 50, N = 5.

Figura 3. Visualizzazione di C. elegans in ipossia con il microscopio. Worms sono esposti all'ipossia utilizzando i metodi descritti. La camera di trasparenza ambientale (realizzato con un piatto di cristallizzazione e lastra di vetro pyrex) è posizionato direttamente sul palcoscenico di un ambito dissezione. Due punti di vista sono mostrati, uno tra il flusso di gas intero set up, l'altra con solo la camera sul palco microscopio.

Questo metodo presenta una strategia per la costruzione di un ambiente ipossico che consente di ambienti con precise concentrazioni di ossigeno per essere mantenute in laboratorio. Queste camere di fornire un metodo semplice per esporre organismi a specifiche concentrazioni basse di O ₂ e di controllo delle uscite molecolari e fisiologiche. La camera ambientale descritta è assemblato da laboratorio invece acquistabile e può quindi essere modificata per adattarsi alle esigenze dell'esperimento.

Un vantaggio di questo metodo è il disegno flusso continuo. Questo elimina le difficoltà incontrate normalmente mantenere concentrazioni basse di O ₂ in camere quando l'esterno concentrazione di O ₂ è molto più alta (210.000 ppm O ₂ in aria ambiente). L'alternativa è un metodo di stopped-flow, in cui viene mantenuto un ambiente ipossico in una camera sigillata. Perdite anche piccole, che possono essere difficili da rilevare, presfogare il mantenimento di condizioni di ipossia con stopped-flow metodi. Il metodo flusso continuo continuamente scambi l'aria nella camera con la concentrazione di ossigeno definito nel serbatoio d'aria compressa e mantiene una pressione positiva che impedisce perdite di compromettere le condizioni di ipossia.

Ottenere esatte, premiscelati concentrazioni di ossigeno dal fornitore di gas risolve un altro problema difficile con ipossia. E 'abbastanza difficile da misurare concentrazioni estremamente basse di O _2. La maggior parte dei O ₂ sensori sono limitata diffusione e piuttosto costoso. Poiché O ₂ diffonde lentamente, misura basse concentrazioni di O ₂ può essere lento o imprecise ^21. Al contrario, è abbastanza facile generare miscele di gas misurando il peso di gas. Le miscele si acquistano regolarmente sono certificati standard per essere entro il 2% tenore di O ₂ del mix desiderato.

Questo metodo può essere utilizzato per stimolare osservabile hypoxia modificazioni indotte sia a livello organismico e molecolare. Mentre questo metodo descrive saggi di sopravvivenza e rapido isolamento verme intero per esperimenti molecolari, ci sono una miriade letture a valle che potrebbero essere utilizzati. Ad esempio, questo progetto permette di visualizzare la direzione di vermi in ipossia per lo studio del comportamento in tempo reale e le modifiche ai costrutti reporter. Per visualizzare i vermi con un ambito di dissezione, montare la camera con scatole trasparenti, con piccolo volume e l'altezza minima. L'intera camera può essere posizionato sulla portata dissezione ed è facilmente manovrabile per la visualizzazione ottimale (vedi Figura 3). Sarebbe anche possibile osservare i campioni con un ingrandimento maggiore usando camere di perfusione con un microscopio invertito. Ciò richiede qualche adattamento delle camere per interfacciare con tubo che viene normalmente utilizzata per il flusso di gas, e determinare un tasso di flusso adeguato. I risultati rappresentativi mostrati solo graffiare la superficie sperimentale possibiLITA 'ipossia, come è stato dimostrato che riguarda i sistemi cellulari di sintesi del DNA alla degradazione delle proteine ^​​22,23.

La natura pratico di questo metodo non è limitato a C. elegans. Finché appropriate dimensioni camere vengono utilizzati, questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi sistema modello. Per l'adattamento ai mezzi liquidi o colture cellulari, costanti di diffusione di ossigeno in soluzione, degassamento dalla plastica e tempo per equilibrare in cultura deve essere presa in considerazione, e può essere più appropriato da utilizzare O ₂ piastre di coltura permeabili ^24,25.

È possibile modificare le camere presentate in questo protocollo per l'uso con altri gas. Per esempio, celle possono essere atto a fornire un ambiente anossico semplicemente omettendo l'O ₂ nei contenitori di gas compresso utilizzato per creare una camera di ipossia (con il saldo essendo riempito con azoto). Questo ha consentito per l'osservazione di C. elegans in suspanimazione chiuso (dati non mostrati) ^10,13,26. Lievi modifiche devono essere effettuate in base alle proprietà della miscela di gas utilizzato. La composizione del tubo utilizzato per tubo gas dentro e fuori della camera può essere variato. Alcune plastiche sono permeabili alla CO _2, mentre altri non sono compatibili con i gas corrosivi such solfuro di idrogeno (H ₂ S) ^16,26. Un elenco di materie plastiche compatibili possono essere trovate sul sito Cole-Parmer.

Per i gas tossici e l'uscita del gas dalla camera deve essere scaricata in una cappa certificata fumi e un'adeguata protezione personale, come rivelatori, deve essere impiegato. Inoltre, gli ufficiali di EH & S dovrebbe essere consultato prima di iniziare qualsiasi esperimento utilizzando gas potenzialmente pericolose. Gas corrosivi possono anche richiedere un'attenzione particolare. Ad esempio, H ₂ S può corrodere molte delle materie plastiche utilizzate in materiale tubo standard così come raccordo in ottone corrodere. In genere fare in modo che ogni bagnataTed plastica è Kalrez o equivalente in strumenti utilizzati con H ₂ S. Alcuni gas possono interagire con impurità in acqua di rubinetto, in modo DIH ₂ 0 deve essere utilizzato nel pallone bolla. Considerazioni speciali in materia di vetro possono anche essere richiesti, ad esempio, H ₂ S necessita di apparecchiature con bagnata O-ring.

Cambiamenti sia organismal e molecolari sono stati osservati utilizzando esperimenti che possono essere completati in un giorno. Questa capacità di introdurre rapidamente campioni ipossia fornisce un valido strumento per i campi da invecchiamento e cancro allo sviluppo.