The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)
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Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409, doi:10.3791/409 (2007).
Isolierung von Zellen aus der Primärquelle ist ein notwendiger Schritt in viele weitere komplexe Protokolle. Miltenyi bietet Kits, um Zellen aus verschiedenen Organismen einschließlich des Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Ratten-und, wie wir hier beschreiben, Mäuse zu isolieren. Magnetic Bead-basierten Zellseparation können entweder für eine positive Selektion (oder Zell-Depletion) sowie negative Selektion. Hier zeigen wir, negative Selektion von unberührter oder na ve CD4 + T-Helferzellen. Mit diesem Standard-Protokoll haben wir in der Regel zu reinigen Zellen, die ≥ 96% reine CD4 + / CD3 + sind. Dieses Protokoll ist in Verbindung mit dem Protokoll Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen in Heft 7 des Jupiter veröffentlicht, für die Reinigung von T-Zellen und anderen Zelltypen zu adoptiv für bildgebende Zwecke übertragen werden. Obwohl wir nicht zeigen, FACS-Analyse in diesem Protokoll video, ist es dringend empfohlen, die gesamte Reinheit der isolierten Zellen mit den entsprechenden Antikörpern via FACS überprüfen. Darüber hinaus zeigen wir die nicht-sterile Methode der T-Zell-Isolierung. Wenn sterile Zellen für Ihre Endbenutzer-Anwendung benötigt werden, sollten Sie alle bewiesen Verfahren in der Gewebekultur Haube unter Standard-sterilen Bedingungen zu tun. Wir danken Ihnen für das Ansehen und viel Glück mit Ihrem eigenen Experimenten!
Bitte lesen und befolgen das Protokoll in der Miltenyi-Kit oder online unter einbezogen http://www.miltenyibiotec.com/ .
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Isolierung von Zellen aus der Primärquelle ist ein notwendiger Schritt in viele weitere komplexe Protokolle. Miltenyi bietet Kits, um Zellen aus verschiedenen Organismen einschließlich des Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Ratten-und, wie wir hier beschreiben, Mäuse zu isolieren. Magnetic Bead-basierten Zellseparation können entweder für eine positive Selektion (oder Zell-Depletion) sowie negative Selektion. Hier zeigen wir, negative Selektion von unberührter oder na ve CD4 + T-Helferzellen. Mit diesem Standard-Protokoll haben wir in der Regel zu reinigen Zellen, die ≥ 96% reine CD4 + / CD3 + sind. Obwohl wir nicht zeigen, FACS-Analyse in diesem Protokoll video, ist es dringend empfohlen, die gesamte Reinheit der isolierten Zellen mit den entsprechenden Antikörpern via FACS überprüfen. Darüber hinaus zeigen wir die nicht-sterile Methode der T-Zell-Isolierung. Wenn sterile Zellen für Ihre Endbenutzer-Anwendung benötigt werden, sollten Sie alle bewiesen Verfahren in der Gewebekultur Haube unter Standard-sterilen Bedingungen zu tun.
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Wir wollen Rebecca Paquett für die Herstellung von MACS-Puffer zu danken.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
1. Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D. & Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 998-1003 (2004).
2. Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A. & Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol 179, 2261-9 (2007).
Comment: Typo in water lysis portion of the protocol. Font for microliters translated as mL instead of uL. Use 900 uL of ddH20 and 100 uL of 10x PBS.
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ReplyPosted by: Melanie M.August 13, 2008, 12:54 AM