Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in

Brianne L. Sturt, Bruce A. Bamber

Department of Biological Sciences, University of Toledo

1. Voorbereiding van Worms for Imaging

Dit segment van het protocol is gebaseerd op gepubliceerde C. elegans kweektechnieken ^1,2, en wordt in figuur 1.

1. Grow wormen op hoge pepton NGM agar platen (10 cm) gezaaid met NA22 E. coli-bacteriën tot bijna uitgehongerd. Als immunokleuringen, zal een bord betrouwbaar produceren genoeg wormen voor 1 persoon vlek, rekening houdend met verliezen langs de weg, en de strenge criteria die worden gebruikt om wormen voor de beeldvorming (zie deel 2) te selecteren.
2. Harvest wormen door het gieten van een paar ml van DDH ₂ 0 op plaat, wervelende kort en gieten vloeistof in een 15 ml conische buis (herhaal indien nodig het grootste deel van de wormen over te dragen aan de buis). Pellet in klinische centrifuge 3 min., 1000x g. Was de pellet 1-3x met DDH ₂ O tot supernatans duidelijk is om de resterende bacteriën te verwijderen. Gebruik polypropyleen transferpipetten naar supernatanten te verwijderen, zoals wormen zich aan glas(Van deze stap verder is het essentieel om de tijd tussen de stappen om de verliezen in ei levensvatbaarheid te vermijden minimaliseren).
3. Na de laatste wasbeurt, Resuspendeer worm pellet in 5 ml alkalische hypochloriet oplossing voor wormen en loslaten eieren lyseren. Rock zacht, en te onderzoeken buizen onder een stereomicroscoop ongeveer een keer per minuut. Als ongeveer 50% van de wormen worden gelyseerd (ze zullen gebogen en gebroken open), te beëindigen lysis door het invullen van de buis aan de bovenkant met ei Buffer, meermaals te keren, en pelleteren gedurende 3 minuten, 1000x g. Lysis mag niet meer dan 5 minuten.
4. Verwijder de bovenstaande vloeistof met transfer pipet, en was pellet 3x met Egg Buffer.
5. Om eieren te scheiden van puin, zweven ze op een kussen van 30% sucrose in DDH ₂ O: na de laatste wasbeurt van stap 1.4, zorgvuldig supernatant en resuspendeer pellet te verwijderen in 5 ml DDH ₂ 0. Voeg 5 ml steriel 60% sucrose in DDH ₂ O, en meng goed. Spin in klinische centrifuge 6 min, 1000x g. Eieren verzamelen in de meniscus (ze zullen have een bewolkte verschijning), terwijl het puin zal pellet.
6. Een plastic transferpipet, opzuigen eieren in een minimaal volume en overbrengen unseeded NGM agarplaten. Alle eieren vast te houden aan kant van de buis kan worden gespoeld voorzichtig naar beneden en overgedragen ook. Een 10 cm ongeplaatste plaat per geanalyseerd stam voldoende is.
7. Incubeer de unseeded platen met de eieren nacht (~ 16 uur) bij 20 ° C. Ontlucht de plaat gedurende de eerste paar uur om het te drogen door het verlaten van het deksel een klein beetje boven een paar uur, maar zorg ervoor dat 's nachts te dekken.
8. Na het uitkomen, overdracht van de L1 larven om een ​​15 ml conische buis in S Basale (voeg een paar ml S basale tot bord, werveling, giet in de buis). Pellet klinische centrifuge (3 min, 1000x g), suspendeer in een minimaal volume Basal S, en de overdracht van 10 cm NGM agarplaten gezaaid NA22 bacteriën. Gebruik hier 2 platen voor elk origineel plaat uit stap 1.1. Incubeer tot wormen te bereiken gewenste leeftijd.
9. Controleer de culturen een of twee keer per dag. Als ze in gevaar zijn of honger, over te dragen aan verse NA22 platen. Voor de wild-type N2 wormen, wordt hongersnood voorafgegaan door de vorming van een lijn of golf van wormen die beweegt over de plaat als dieren migreren en masse van eet-leeg zones. Zodra deze vormen de voeding volledig uitgeput binnen enkele uren.
10. Wormen zijn nu klaar voor immunokleuring of live beeldvorming. Bevestiging en vlekken wormen in suspensie is optimaal, omdat een groot aantal intacte wormen kunnen gemakkelijk worden afgebeeld. Kleuringen op basis van de Finney en Ruvkun protocol ^3-6 te verkiezen zijn boven bevriezen-crack te hanteren vanwege grote aantallen wormen zijn nodig voor de beeldvorming.

2. Confocale Imaging

1. Monteer wormen op dia's voor confocale beeldvorming. Pas de dichtheid van wormen tot een paar honderd per microliter. Een pad 2% agarose in S-basale omgeven door een dunne ring vaseline om verdamping tijdens de beeldvorming (toegevoerd via een 3 ml injectiespuit voorzien van een cut-off 25 gauge naald). Pipetteer eenenkele microliter van de worm vering op een dekglas (gebruik verdoving, imaging levende wormen), en laat de agarose pad op het dekglas, het verspreiden van de wormen gelijkmatig over het pad.
2. Selecteer wormen voor de beeldvorming. Kies wormen waar synapsen van belang gericht zijn naar de objectieflens met radiale verplaatsing van niet meer dan ± 45 ° (met 0 ° betekent gericht rechtstreeks naar het doel). Snel uit te voeren deze beoordeling (een paar seconden) om te voorkomen fotobleken. De omvang van de oorspronkelijke culturen is geoptimaliseerd om te zorgen voor voldoende wormen zullen deze geometrische criteria voldoen.
3. Vul het confocale beelden van het monster. Relatief vlakke monsters kan worden omvat binnen ongeveer 14 0,4 ​​pm dikke secties de beste resultaten. Hoge snelheid, lage resolutie beelden (512 x 512 pixels) zijn voldoende voor een snelle accurate het verzamelen van gegevens. Vermijd het verzadigen van de detector met hoge signaalsterkte, omdat dit zal leiden tot onderschatting van de fluorescentiesignalen.

3. Automatische Identificatie en analyse van individuele Synaptic Clusters

1. Open multi-TIF-uitgang van de bestanden van de confocale microscoop met behulp van Volocity 4.0 (of hoger) software (PerkinElmer).
2. Crop weg gedeelten van het beeld die geen van de structuur van belang (Afbeelding -> Uitgebreide Focus -> Selecteer gebied van belang met behulp van 'Freehand ROI' tool -> Acties -> Crop to Selection; figuur 2A). Let op, Extended Focus produceert een z-plane projectie op het scherm om uw analyse te helpen, maar heeft geen invloed op de onderliggende gegevens, hetzelfde geldt voor de helderheid en het contrast aanpassen, indien nodig).
3. Meet de lengte van het gebied geanalyseerd met behulp van het gereedschap Lijn. De lengte van de lijn wordt berekend en aan de data tabel (Figuur 2B).
4. Identificeer objecten met behulp van de 'objecten van Intensity' filter (Afmetingen modus). Geef een drempel, zodat synaptische clusters zijngemarkeerd en niet-synaptische achtergrond niet (Figuur 2C). Opname van een onafhankelijke synaptische marker gelabeld met een andere kleur kan ondubbelzinnig helpen bij het identificeren synapsen. Typische synapsen variëren van enkele tot een paar honderd voxels. Stel de drempel een keer met een controle monster, en gebruik het voor alle volgende monsters. Thresholding elk monster apart is onaanvaardbaar omdat het introduceert de mogelijkheid van experimentator bias. Objecten worden geselecteerd en automatisch in tabelvorm (Figuur 2D).
5. Schik en exporteren van de gegevens. Verwijder voorwerpen van 2 of minder voxels, aangezien deze gewoonlijk achtergrond spikkels. Deze kunnen worden verwijderd door verdere filtering of tijdens latere analyse. Om hun verwijdering stroomafwaarts, re-sorteren het bestand te vergemakkelijken door 'object size', zodat ze zullen alle groepen samen. Exporteer de gegevens in CSV-formaat, die kan worden geopend door Microsoft Excel of andere spreadsheet programma's. Elk beeld produceert een output file.
6. Als Volocity zachtsoftware niet beschikbaar is, alternatieve methoden voor Z-plane projecties van confocale gegevens te analyseren kan worden gebruikt (bijvoorbeeld ref. ^7, of handmatige analyse met behulp van ImageJ), maar 3-dimensionale informatie verloren gaat (zie Overleg).

4. Representatieve resultaten

De gepresenteerde kwantificering methode moet in staat zijn om onderscheid te maken tussen cluster populaties van verschillende helderheid en verschillende volumes. Representatieve beelden en overeenkomstige kwantitatieve gegevens weergegeven in figuur 3 tonen voorbeelden van differentiatie op basis van deze parameters. Als algemene regel de resultaten moeten voldoen aan wat er is duidelijk voor het oog. In het geval van UNC-49 GABA-receptor immunokleuring de ventrale zenuw snoer van C. elegans, alle dieren meestal bleek zeer vergelijkbaar in grootte en volwassenheid, en de totale synaptische fluorescentie waarden voor een groep van vijf wormen (genormaliseerd voor de lengte van de zenuw snoer geanalyseerd) toonde Standard Error waarden van ongeveer 10% van de gemiddelde ^4. Genetische mutatie en andere experimentele behandelingen (bijvoorbeeld blootstelling aan het geneesmiddel) kunnen veranderen, niet alleen het volume en de intensiteit van waarden en frequentieverdelingen van synaptische clusters, maar mogelijk de ontwikkeling tijdsverloop en synchronie van de wormen, wat leidt tot een hogere variabiliteit. Echter, de kwantitatieve resultaten moet altijd een afspiegeling wat er kan worden gewaardeerd visueel en zo niet, inspectie van de beelden en de objecten geïdentificeerd door Volocity moet uitwijzen waar de fout is opgetreden en stel corrigerende maatregelen zoals het opnieuw drempelwaarden of verwijdering van artefactual objecten.

Figuur 1. Voorbereiding van de synchrone C. elegans culturen. synchrone culturen worden verkregen van deze procedure, omdat C. elegans ontwikkeling arrestaties en de L1 larvale stadium in de afwezigheid van voedsel, en wordt hervat wanneer voedsel wordt geïntroduceerd.

1. Vreemde regio's van het beeld worden bijgesneden om bestandsgrootte te verminderen en de specificiteit te verhogen. Linker paneel toont beeld te beginnen, middenpaneel geselecteerd regio laat zien, rechter paneel toont afbeelding na snijden. Rood signaal is UNC-49 GABA-receptor immunofluorescentie, groen signaal is synaptobrevin-GFP (een presynaptische marker), uitgedrukt in presynaptische GABA neuronen ^4. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
2. Er wordt een lijn getrokken van de lengte van de zenuw koord segment te analyseren, en de lengte wordt automatisch opgeslagen in de tabel met resultaten. Deze informatie is nodig om synaptische gegevens als gevolg van de lengte van analyseerbare zenuw koord, die verscheidene malen kan variëren als wormen gefragmenteerd raken tijdens de vlekken te normaliseren.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.
3. Een drempel wordt toegepast op individuele synaptische clusters te identificeren. Linker paneel toont beeld voor drempelwaarden, voorbeelden van verschillende drempelwaarden niveaus worden in afzonderlijke panelen (groen signaal weggelaten). Elke geïdentificeerde object wordt afgebeeld op het beeld als een gekleurde regio. Let op de correspondentie tussen de visueel duidelijk synaptische clusters in het meest linkse paneel en de gekleurde gebieden op de meest rechtse paneel. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
4. Elke geïdentificeerde object wordt afzonderlijk vermeld in de tabel met resultaten. Individuele objecten kunnen worden geselecteerd en worden gemarkeerd op de afbeelding voor een inspectie, indien gewenst. Merk op dat tabel bevat informatie voor de rode ('rhodamine') en groene ('EGFP ") kanalen, het groene kanaal informatie is potentieel misleidend, omdat voorwerpen warengeïdentificeerd op basis strikt op rode fluorescentie. Deze analyse kan ook worden uitgevoerd op een enkele afbeeldingen in kleur. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Representatieve resultaten. Vertegenwoordiger microfoto van wild-type C. elegans gekleurd voor UNC-49 GABA-receptoren voor (A) en na (B) behandeling met muscimol, een GABA-receptor agonist die receptoren veroorzaakt gedownreguleerd worden na lange blootstelling. Panelen tonen bijgesneden beelden voor (links) en na (rechts) drempelwaarden en het verwijderen van kleine achtergrond vlekjes. (C) Standplaatsen van kwantitatieve synaptische parameters voor de modellen in de (A) en (B): totale fluorescentie genormaliseerd naar zenuw kabel lengte (links) en cumulatieve kans histogrammen van individuele synapsen fluorescentie inhoud (midden) en synaps volume (right), waaruit blijkt statistisch significante vermindering van de synaptische inhoud en omvang veroorzaakt door agonist blootstelling (n = 60 synapsen voor onbehandelde, n = 115 synapsen voor muscimol behandelde, p <0,001, Kolmogorov-Smirnov-test http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html ).

De hier gepresenteerde methode is ontwikkeld om kwantitatieve multi-parameter gegevens op te halen voor grote populaties van synapsen in C. elegans, terwijl het maximaliseren van consistentie binnen behandelingsgroepen. Drie functies dragen bij aan deze doelstellingen. Eerst wordt immunokleuring uitgevoerd op synchrone worm populaties om ervoor te zorgen dat alle dieren zijn even oud. Deze stap is essentieel, omdat ontwikkeling regulatie van expressie kunnen verduisteren effecten van de experimentele behandeling (bijvoorbeeld UNC-49 GABA-receptor immunofluorescentie varieert enkele malen tijdens de ontwikkeling (K. Davis et al.., In voorbereiding)). Bovendien kunnen permeabilisatie en fixatie zijn zeer variabel, waardoor kwantitatieve vergelijkingen moeilijk. Met behulp van gesynchroniseerde culturen minimaliseert deze inherente variabiliteit, het verbeteren van de betrouwbaarheid van de techniek. Andere manieren om deze variabiliteit te kunnen beantwoorden zijn onder meer het gebruik van een tweede antilichaam aan een niet verbonden doel dat kan worden onafhankelijk van elkaar gevisualiseerd als een internecontroleren voor permeabilisatie, of imaging GFP-gelabelde eiwitten in levende wormen, die de noodzaak van permeabilisatie helemaal vermeden wordt. Maar deze laatste benadering introduceert nieuwe problemen, omdat de endogene eiwit niet meer wordt direct gemeten, zodat potentiële artefacten als gevolg van inconsistenties in transgenexpressie / copy number, structurele verandering als gevolg van de fusie van GFP, of niet-fysiologische transgenexpressie niveaus moeten beschouwd. Geen enkele methode is perfect, ideaal, bevestigende gegevens kunnen worden verkregen met behulp van meerdere benaderingen. In dit protocol is de grootte van de zuursels geoptimaliseerd leiden tot voldoende vaste en gekleurd wormen voor confocale analyse. Grote aantallen wormen zijn nodig omdat de geometrische criteria worden gehanteerd om wormen voor de beeldvorming te selecteren zijn streng, dat is de tweede functie van het protocol bij de variabiliteit te beperken. Dezelfde anatomische structuur moet worden afgebeeld in elk dier (of de meest biologisch relevante site, of eenwillekeurig gekozen locatie bij grote weefseldistributie van het eiwit van interesse) en dat structuur moet gericht naar de objectieflens met slechts geringe afwijking van beide zijden. Dit criterium verbetert de consistentie door het elimineren van variatie in de hoeveelheid tussenliggende weefsel dat kan verstrooien excitatie en emissie licht, die van invloed signaalsterkte. Het is belangrijk dat dit de enige criterium voor wormen selecteren als het gemakkelijk vertekening de resultaten gebaseerd op verwachting een bepaalde uitkomst. Inderdaad experimenten worden het best uitgevoerd blind waar mogelijk. De derde functie die bijdraagt ​​aan de kracht van deze techniek is de geautomatiseerde identificatie en kwantitatieve karakterisering van synaptische clusters in drie dimensies met behulp van Volocity. Deze analyse is eenvoudig en snel, kunnen identificeren en het classificeren honderden tot duizenden individuele synapsen voor elke experimentele voorwaarden. Wat nog belangrijker is, Volocity bevat gegevens van alle vliegtuigen van multi-vlak Confocal data stapels plaats gegevens te verwijderen op de 2-dimensionale z-uitsteeksels in eerdere protocollen genereren. Stroomafwaarts van deze analyse kan experimentele groepen te vergelijken in termen van totale synaptische fluorescentie per dier, de ruimtelijke verdeling van synapsen, en de frequentie verdeling van volumes, de totale fluorescentie, en maximale fluorescentie voor individuele synapsen. Deze parameters kunnen onthullen belangrijke overgangen te geven synaptische ontwikkeling van evenementen, de rol van ontwikkelings-en regulerende eiwitten, en synaptische plasticiteit.

Kwantificering van fluorescentie signalen met behulp van Volocity heeft toepassingen in de neurobiologie verder dan de analyse van gepermeabiliseerde vaste C. elegans monsters, dat is handig voor de berekening van het fluorescerende signaal gelokaliseerd in een hoog contrast puncta. Daarom is geschikt voor analyse van vaste weefsels of cellen van een organisme. Echter, fixatie en permeabilisatie leidt tot een visualisatie van het totaal synaptische eiwit bevolkings, ongeacht of ze het oppervlak tot expressie, terwijl voor de receptoren in ieder geval, alleen de oppervlakte uitgedrukt fractie draagt ​​bij aan synaptische sterkte. Volocity gebaseerde analyse kan ook aan het oppervlak tot expressie populaties, mits niet permeabilizing fixatie kunnen dienen te kwantificeren. Volocity analyse ook nuttig eiwitdynamica bestuderen in levende cellen. Veel eiwitdomeinen shuttle tussen vesiculaire en extracellulaire omgevingen met verschillende pH in neuronale signalering gebeurtenissen (bijvoorbeeld de carboxyterminus van synaptobrevin tijdens de synaptische blaasjes vrijkomen ^8-10, of de amino-terminale domeinen van neurotransmitter receptoren tijdens de handel naar het celoppervlak ^11). Fusing pH-gevoelige ecliptica GFP tags aan deze regio's kan produceren in vivo verslaggevers van deze overgangen die kwantitatief bestudeerd worden met behulp van een Volocity aanpak. Ook GFP-tagging van neuropeptiden genen resulteert in een GFP-gelabelde dense-core blaasjes die de-vlek alsdeze blaasjes zekering met de plasmamembraan ^12; Volocity analyse kan nuttig zijn in deze context een test voor specifieke neuropeptide release in vivo. Het voordeel van Volocity analyse in al deze instellingen is de mogelijkheid om snel te identificeren en te kwantificeren grote aantallen synapsen, waardoor subtiele verschillen in hun individuele eigenschappen of uitkeringen aan de bevolking worden aangetoond met statistische nauwkeurigheid.