Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic

Brianne L. Sturt, Bruce A. Bamber

Department of Biological Sciences, University of Toledo

1. Préparation de Worms pour l'imagerie

Ce segment du protocole est basé sur publia C. techniques de culture elegans ^1,2, et est présenté dans la figure 1.

1. Cultiver des vers sur des plaques de gélose peptone haute NGM (10 cm) ensemencées avec NA22 E. La bactérie E. jusqu'à près de mourir de faim. Si immunocoloration, une plaque sera fiable de produire assez de vers pour 1 personne tache, compte tenu des pertes le long du chemin, et les critères stricts utilisés pour sélectionner des vers pour l'imagerie (voir partie 2).
2. Vers la récolte en versant quelques millilitres de ddH ₂ 0 sur la plaque, en agitant brièvement, et verser le liquide dans un tube de 15 ml conique (répéter si nécessaire de transférer la plupart des vers dans le tube). Pellet en centrifugeuse clinique pendant 3 min, g 1000x. Laver à granulés 1-3x avec ddH ₂ O jusqu'à ce surnageant est clair pour éliminer les bactéries résiduelles. N'utiliser que des pipettes de transfert en polypropylène pour supprimer surnageants, que les vers s'en tenir à verre(À partir de ce étape, il est essentiel pour minimiser le temps entre les étapes pour éviter les pertes dans la viabilité des œufs).
3. Après le dernier lavage, le ver de remettre en suspension le culot dans 5 ml solution d'hypochlorite de alcaline pour lyser les vers et les œufs de libération. Bercer doucement, et d'examiner les tubes sous un microscope à dissection environ une fois par minute. Lorsque environ 50% des vers sont lysées (ils apparaissent tordues et brisées ouvert), mettre fin à la lyse par le remplissage du tube vers le haut avec le tampon d'oeufs, retournant plusieurs fois, et la granulation pendant 3 min, g 1000x. Temps de lyse ne doit pas dépasser 5 minutes.
4. Enlever le surnageant avec une pipette de transfert, et se laver à granulés 3x avec le tampon d'oeufs.
5. Pour séparer les œufs de débris, les faire flotter sur un coussin de saccharose à 30% dans le trou DDH ₂ O: après le lavage final de l'étape 1.4, retirez avec précaution le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml ddH ₂ 0. Ajouter 5 ml de saccharose à 60% stérile dans le trou DDH ₂ O, et bien mélanger. Spin dans la centrifugeuse clinique 6 min, g 1000x. Oeufs permettra de recueillir au niveau du ménisque (ils have un aspect trouble), tandis que les débris de granules.
6. En utilisant une pipette de transfert en plastique, aspirer les oeufs dans un volume minimal et transfert à des boîtes de gélose non ensemencés NGM. Les oeufs qui adhèrent à côté du tube peut être rincé doucement et transférés ainsi. Une plaque de 10 cm ensemencés par la souche analysée est suffisante.
7. Incuber les plaques non ensemencés avec les oeufs nuit (~ 16 h) à 20 ° C. Purger la plaque pour les premières heures de la sécher en laissant le couvercle légèrement hors de quelques heures, mais être sûr de couvrir toute la nuit.
8. Après l'éclosion, les larves L1 transférer le à un tube de 15 ml conique basale S (ajouter à la plaque basale quelques ml S, tourbillon, versez dans le tube). Pellet en centrifugeuse clinique (3 min, 1000x g), remettre en suspension dans un volume minimal de baso-S, et le transfert de plaques de 10 cm NGM gélose ensemencée avec NA22 bactéries. Utilisez 2 plaques ici pour chaque plaque d'origine de l'étape 1.1. Incuber jusque vers atteignent l'âge de votre choix.
9. Surveiller les cultures une ou deux fois par jour. Si ils sont en danger of faim, de transférer à de nouvelles plaques NA22. Pour les vers de type sauvage N2, la famine est précédée par la formation d'une ligne ou une vague de vers qui se déplace à travers la plaque, comme les animaux migrent en masse loin de la nourriture appauvries zones. Une fois cette forme, la nourriture sera complètement épuisé en quelques heures.
10. Worms sont maintenant prêts pour immunomarquage ou imagerie en temps réel. Fixation et coloration des vers en suspension est optimale car un grand nombre de vers intacts peuvent être visualisés facilement. Procédures de coloration sur la base du protocole de Finney et Ruvkun ^3-6 sont préférable de congeler du crack procédures car un grand nombre de vers sont nécessaires pour l'imagerie.

2. Imagerie confocale

1. Monter vers sur des lames pour l'imagerie confocale. Réglage de la densité de vers à quelques centaines par microlitre. Ajouter un tampon de 2% d'agarose à S-basale entourée par un anneau mince de vaseline pour empêcher l'évaporation au cours d'imagerie (appliqué par l'intermédiaire d'une seringue de 3 ml équipé d'un seuil de 25 aiguille de calibre). Aide d'une pipettemicrolitres de la suspension quelques ver sur une lamelle (utiliser l'anesthésie si des vers vivants d'imagerie), et d'abaisser le tampon d'agarose sur la lamelle, la propagation des vers uniformément sur le pavé.
2. Sélectionnez les vers destinés à l'imagerie. Choisir vers lequel les synapses d'intérêt sont orientés vers la lentille d'objectif, avec un déplacement radial de pas plus de ± 45 ° (où 0 ° signifie orientée directement vers l'objectif). Effectuez cette évaluation rapide (quelques secondes) pour éviter le photoblanchiment. L'échelle des cultures initiales est optimisé pour assurer des vers suffisantes seront satisfaire à ces critères géométriques.
3. Remplissez l'imagerie confocale de l'échantillon. Échantillons relativement plats qui peuvent être envisagées dans environ 14 0,4 ​​um d'épaisseur sections produire les meilleurs résultats. Haute vitesse, des images à faible résolution (512 x 512 pixels) sont suffisants pour la collecte de données rapide précise. Éviter de saturer le détecteur avec les forces de signal excessives, car cela entraînerait une sous-estimation de la fluorescencesignaux.

3. D'identification automatique et de l'analyse des clusters individuels Synaptic

1. Ouvrir les fichiers de sortie multi-TIF de la microscopie confocale en utilisant Volocity 4.0 (ou supérieur) logiciel (PerkinElmer).
2. Rogner les zones de l'image qui ne contient pas la structure d'intérêt (Image -> Focus étendue -> Découper la sélection> Choisir zone d'intérêt en utilisant «à main levée ROI outil - -> Actions; la figure 2A). Remarque, Focus étendue produit une projection z-plan sur l'écran de l'ordinateur à l'aide de votre analyse, mais n'affecte pas les données sous-jacentes; la même chose est vraie pour les réglages de luminosité et de contraste, le cas échéant).
3. Mesurer la longueur de la zone analysée à l'aide de l'outil Ligne. La longueur de la ligne seront calculés et ajoutés à la table de données (figure 2B).
4. Identifier les objets en utilisant les 'objets par l'intensité »de filtre (mode Mesures). Spécifiez un seuil tel que les grappes sont synaptiquesmis en évidence et non-synaptique de fond n'est pas (figure 2C). Inclusion d'un marqueur indépendant synaptique marqué avec une autre couleur peut aider à identifier sans ambiguïté les synapses. Synapses typiques vont de quelques-uns à quelques centaines de voxels. Régler le seuil de fois en utilisant un échantillon de contrôle, et l'utiliser pour tous les échantillons subséquents. Seuillage chaque échantillon est séparément inacceptable, car elle introduit la possibilité de biais expérimentateur. Les objets sont sélectionnés et totalisées automatiquement (figure 2D).
5. Organiser et exporter les données. Éliminer les objets de 2 ou moins voxels, puisque ceux-ci sont généralement des taches de fond. Ceux-ci peuvent être éliminés par filtrage d'autres, ou lors de l'analyse ultérieure. Afin de faciliter leurs aval de déménagement, re-trier le fichier de données par la 'taille' objet donc ils veulent tout regrouper. Exportez les données au format CSV, qui peut être ouvert par Microsoft Excel ou autres tableurs. Chaque image produit un fichier de sortie.
6. Si douce VolocityWare n'est pas disponible, d'autres méthodes pour analyser les Z-plan des projections de données confocale peut être utilisé (par exemple réf. ^7, ou l'analyse manuelle à l'aide ImageJ), même si en 3 dimensions l'information est perdue (voir Discussion).

4. Les résultats représentatifs

La méthode de quantification présenté doit être en mesure de faire la distinction entre les populations du cluster de luminosité différente et des volumes différents. Des images représentatives et correspondants les données quantitatives présentées dans la figure 3 montrent des exemples de différenciation sur la base de ces paramètres. En règle générale, les résultats doivent être conformes à ce qui est évident à l'œil. Dans le cas de l'UNC-49 récepteur GABA immunocoloration la corde nerveuse ventrale de C. elegans, tous les animaux en général est apparu très similaire en taille et en maturité, et le total des valeurs de fluorescence pour synaptiques un groupe de cinq vers (normalisé à la longueur de la moelle épinière analysés) a montré l'erreur type des valeurs d'environ 10% de la moyenne ^4. Une mutation génétique et d'autres traitements expérimentaux (l'exposition au médicament, par exemple) peuvent modifier non seulement le volume et les valeurs d'intensité et de distributions de fréquence des grappes synaptiques, mais peut-être le développement du temps bien sûr et de la synchronie des vers, conduisant à une plus grande variabilité. Toutefois, les résultats quantitatifs doivent toujours refléter ce qui peut être apprécié visuellement et si elle n'est pas, à l'inspection des images et des objets identifiés par Volocity devrait révéler l'endroit où l'erreur s'est produite et de proposer des mesures correctives telles que re-seuillage ou la suppression d'objets artefactuelles.

Figure 1. Préparation de synchrone C. cultures elegans. cultures synchrones sont obtenus à partir de cette procédure parce que C. arrestations de développement elegans et le stade larvaire L1 en l'absence de nourriture, et reprend lorsque la nourriture est introduite.

1. Régions d'origine étrangère de l'image sont rognés pour réduire la taille des fichiers et d'accroître la spécificité. Panneau de gauche montre l'image de départ, le panneau du milieu montre la région sélectionnée, panneau de droite montre l'image après le recadrage. Signal rouge est UNC-49 immunofluorescence récepteur GABA, le signal vert est synaptobrévine-GFP (un marqueur présynaptique) exprimée en présynaptiques des neurones GABA ^4. Cliquez ici pour agrandir la figure .
2. Une ligne est tracée la longueur du segment moelle épinière à analyser, et sa longueur est automatiquement enregistré dans le tableau des résultats. Cette information est nécessaire pour normaliser les données synaptiques dues à la longueur de la moelle épinière analysable, qui peut varier de plusieurs fois si les vers se fragmenter pendant la coloration.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
3. Un seuil est appliqué à identifier individuellement les clusters synaptiques. Le panneau de gauche montre l'image avant de seuillage; des exemples de niveaux de seuillage différents sont présentés dans des panneaux séparés (signal vert omis). Chaque objet identifié est représenté sur l'image en tant que région colorée. Notez la correspondance entre les groupes visuellement évidentes synaptiques dans le panneau le plus à gauche et les régions de couleur sur le panneau le plus à droite. Cliquez ici pour agrandir la figure .
4. Chaque objet identifié est répertorié séparément dans le tableau des résultats. Objets individuels peuvent être sélectionnés, et sont mises en évidence sur l'image pour l'inspection, si désiré. Notez que la table contient des informations pour le rouge ("rhodamine") et vert ('EGFP ») des canaux; les informations du canal vert est potentiellement trompeuse, car les objets sontidentifiés sur la base strictement sur la fluorescence rouge. Cette analyse peut également être exécutées sur les images d'une seule couleur. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Des résultats représentatifs. Micrographies représentatives de type sauvage C. elegans colorés pour UNC-49 récepteurs GABA avant (A) et après (B) le traitement par le muscimol, un agoniste des récepteurs GABA qui provoque récepteurs deviennent contrerégulés après une longue exposition. Panneaux montrer des images recadrées avant (à gauche) et après (à droite) de seuillage et l'enlèvement des taches de fond de petite taille. (C) Parcelles de paramètres quantitatifs synaptiques pour les spécimens présentés dans (A) et (B): fluorescence totale normalisé à la longueur du cordon nerveux (à gauche), et les histogrammes probabilité cumulative de contenu synapse fluorescence individuelle (au milieu) et le volume des synapses (right), démontrant une réduction statistiquement significative de la teneur et le volume synaptique induite par l'exposition agoniste (n = 60 pour les synapses non traités, n = 115 synapses pour muscimol-traité, p <0,001, test de Kolmogorov-Smirnov http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html ).

La méthode présentée ici est conçu pour extraire quantitatives multi-paramètres de données pour de grandes populations de synapses dans C. elegans, tout en maximisant la cohérence au sein des groupes de traitement. Trois caractéristiques contribuent à ces objectifs. Tout d'abord, immunomarquage est effectué sur les populations de vers synchrones afin de s'assurer que tous les animaux ont le même âge. Cette étape est cruciale, car la régulation du développement des niveaux d'expression peut masquer les effets du traitement expérimental (par exemple UNC-49 immunofluorescence récepteur GABA varie plusieurs fois au cours du développement (K. Davis et al., En préparation)). En outre, la perméabilisation et la fixation peut être très variable, rendant les comparaisons quantitatives difficile. Utilisation de cultures synchronisées minimise cette variabilité inhérente, l'amélioration de la fiabilité de la technique. Autres moyens pour remédier à cette variabilité comprennent l'utilisation d'un second anticorps à une cible non lié qui peut être visualisée indépendamment comme un internecontrôler de perméabilisation, ou l'imagerie GFP-tagged protéines dans des vers vivants, ce qui évite la nécessité d'une perméabilisation tout à fait. Toutefois, cette approche-ci introduit de nouveaux problèmes, car la protéine endogène n'est plus mesurée objets directement, de sorte potentiels dus à des incohérences dans l'expression du transgène / nombre de copies, la modification structurelle due à la fusion de la GFP, ou non-physiologiques des niveaux d'expression des transgènes doivent être considérée. Aucune méthode n'est parfaite, idéalement, les données concordantes peuvent être obtenus en utilisant des approches multiples. Dans ce protocole, la taille des cultures starter a été optimisé pour aboutir à un nombre suffisant de vers fixes et colorées pour l'analyse confocale. Un grand nombre de vers sont nécessaires parce que les critères géométriques utilisées pour sélectionner des vers pour l'imagerie sont strictes, ce qui est le second long métrage du protocole afin de minimiser la variabilité. La structure anatomique même doit être visualisées dans chaque animal (soit le site le plus biologiquement pertinente, ou unchoisi arbitrairement le site dans le cas de la distribution tissulaire large de la protéine d'intérêt), et que la structure doit être orientée vers l'objectif avec un écart seulement légère de chaque côté. Ce critère améliore l'uniformité en éliminant la variabilité de la quantité de tissu qui peut intervenir d'excitation de dispersion et d'émission de lumière, affectant la puissance du signal. Il est important que ce soit le seul critère utilisé pour sélectionner des vers, comme il est facile de biaiser les résultats basés sur les attentes d'un certain résultat. En effet les expériences sont mieux réalisées aveugle lorsque cela est possible. La troisième caractéristique qui contribue à la puissance de cette technique est l'identification automatique et la caractérisation quantitative des grappes synaptiques en trois dimensions en utilisant Volocity. Cette analyse est simple et rapide, capable d'identifier et de tabulation des centaines de milliers de synapses individuelles pour chaque condition expérimentale. Plus important encore, Volocity comprend les données de tous les avions de multi-plans confocal piles de données, plutôt que de données en rejetant pour générer les 2-dimensionnelles z projections utilisées dans les précédents protocoles. En aval de cette analyse, les groupes expérimentaux peuvent être comparées en termes de fluorescence synaptique totale par animal, la distribution spatiale des synapses, et des distributions de fréquences de volumes, la fluorescence totale, et la fluorescence maximale pour les synapses individuelles. Ces paramètres peuvent révéler des transitions clés indiquant des événements de développement synaptiques, les rôles des protéines de développement et de réglementation, et la plasticité synaptique.

La quantification des signaux de fluorescence à l'aide Volocity a des applications dans la neurobiologie au-delà de l'analyse des perméabilisées fixe C. échantillons elegans, étant utile pour la quantification d'un signal fluorescent localisé à contraste élevé. puncta Il est donc adapté à l'analyse de tissus fixes ou des cellules provenant de tout organisme. Toutefois, la fixation et perméabilisation conduit à la visualisation de la population totale en protéines synaptiquess indépendamment du fait qu'ils sont exprimé en surface, tandis que pour les récepteurs au moins, seule la fraction de surface exprimé contribue à la force synaptique. Analyse à base de Volocity peut également être utilisé pour quantifier la surface-exprimés populations, à condition non perméabilisant conditions de fixation sont utilisés. Analyse Volocity sera également utile pour étudier la dynamique des protéines dans les cellules vivantes. Un grand nombre de domaines de protéine navette entre environnements vésiculaires et extracellulaire dont le pH est différente pendant des événements de signalisation (par exemple neuronales l'extrémité carboxy-terminale de synaptobrévine pendant ^8-10 synaptiques libération des vésicules ou des domaines terminaux amino de récepteurs de neurotransmetteurs pendant la traite à la surface cellulaire ^11). Fusing sensibles au pH balises GFP écliptique à ces régions peuvent produire dans les reporters in vivo de ces transitions qui peuvent être étudiés quantitativement en utilisant une approche basée sur Volocity. De même, la GFP-tagging des résultats des gènes de neuropeptides dans GFP marqués à noyau dense de vésicules qui-tache queces vésicules fusionnent avec la membrane plasmique ^12; analyse Volocity peut être utile dans ce contexte comme un test pour la libération des neuropeptides spécifique in vivo. L'avantage de l'analyse Volocity dans l'ensemble de ces paramètres est sa capacité à rapidement identifier et de quantifier un grand nombre de synapses, ce qui permet de subtiles différences dans leurs propriétés individuelles ou des distributions de la population à être démontré avec une rigueur statistique.