Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

,

Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Bioengineering. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 23.22.252.150, User IP: 23.22.252.150, User IP Hex: 387382422

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

Protocol: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

De protokoll i det här avsnittet beskriver material och utrustning som används specifikt för att få de experimentella resultat som presenteras. Observera att alternativa leverantörer för kemikalier och utrustning kan utnyttjas.

1. Device Tillverkning och mjuk litografi

Standard mjuk litografi tekniker, 21 ett antal av dem har varit med i tidigare Jové artiklar, var 22 används för att skapa polydimetylsiloxan (PDMS) Mikrokanalplattor nätverk bundna till glas substrat. Bortsett från mästaren replika formen tillverkning av SU-8 fotolitografi, kan processerna utföras utanför ett rent rum eller rent huva, men damm och partiklar bör fortfarande minimeras för att uppnå jämna resultat.

  1. Designa ett mikro-kanal mönster som visas i figur 1 i AutoCAD (Autodesk Inc.). Använda sig av en tredje part tillverkare (Fineline Imaging Inc.) för att skriva ut en hög upplösning (50.000 dpi) transöppenhet mask på Mylar film eller kvarts där kanaler är öppna på en mörk bakgrund.
  2. Skapa en kisel och SU-8 fotoresist befälhavaren replik gjutning. Kortfattat, snurra SU-8 2050 (MICROCHEM) negativ fotoresist med tillverkarens rekommenderade rpm på en spin-coater för att skapa en 52 m tjockt lager på en ren 7,5 cm eller 10 cm kiselskiva. Efter mjuka baka, kantvulst avlägsnande, UV exponering genom en kontakt mask efter exponering baka, utveckling och översvämningar exponering, mäta den verkliga tjockleken på SU-8 lager med en Dektak profilometer (Veeco). Tejpa befälhavaren formen på botten av en 4 "eller 5" petriskål att förbereda sig för PDMS replik gjutning.
  3. Blandning PDMS elast bas med elastomer härdningsmedel (Dow Corning) i en 10:01-förhållande vikt / vikt bas till härdare. Häll välblandade PDMS föregångaren på kisel befälhavaren att skapa en 2-3 mm slutlig tjocklek skikt. En blandning av 20 g elastomerbas med 2 g härdare är tillräcklig för att täcka en 4 "diameter yta.
  4. Placera master mögel och PDMS i vakuum torkapparat (Jencons) för att de-gas den ohärdade PDMS. Användning av en tryckregulator (Cole Parmer), långsamt minska tryckkammaren gage från 0 "Hg till -27" Hg under 20 minuter för att undvika överdriven skumning. Lämnar enheten i vakuumkammaren vid -27 "Hg under 30 minuter eller tills luftbubblor försvinna.
  5. Frigöra vakuum och rör sig huvudsakliga gjutformen och PDMS till en 65 ° C ugn (Thermo Scientific) under ett minimum av fyra timmar. Anordningen kan vara kvar i ugn över natten för att förbättra härdningen.
  6. Ta bort enheten från ugnen och låt svalna. Skär försiktigt PDMS runt runt wafer med en precision kniv och skala ut PDMS. Skära ut anordningen kontur som visas i figur 1 med en skalpell.
  7. Stansen fluidiska portar (tre per enhet) i de tre runda regionerna som visas i figur 1 med användning av en biopsistans. För enheten, använd en 0,75 mm ytterdiameter stans (Harris).
  8. Vidhäfta tejp till den mönstrade sidan av PDMS och skal för att avlägsna eventuelltdamm. Som en kostnadsbesparande men livskraftiga alternativ till konventionella apparater syrgasplasma, 21,22 plasma behandla mönstrade sidan av PDMS och en ren 3 "x 1" glasmikroskopskiva med hjälp av en handhållen laboratoriet koronabehandlare (Electro-Technic Products Inc .). 23 Observera att denna enhet bör användas i ett dragskåp eller väl ventilerad plats på grund av ozon urladdning, och alla klockor och mobiltelefoner bör hållas minst tio meter bort. Justera koronaurladdningen att uppnå en stabil corona med minimal gnistbildning. Sakta vifta elektroden ca 1/4 "ovan varje yta för ca 20 sekunder och sedan omedelbart föra de behandlade ytorna i kontakt att bilda en stark permanent bindning innan PDMS ytor återvända till sitt naturliga tillstånd.
  9. Placera enheten på en metallplatta, plats i en sval ugn, Sätt ugnen på 120 ° C och baka över natten för att slutföra bindning och tillbaka PDMS till sitt ursprungliga hydrofoba skick. 24 Under denna höga temperatur bakning, than glasytan på kanalen kommer också att göras hydrofob beroende på avsättning av en tunn hydrofobt skikt på glaset. Alternativt kan hydrofoba beläggningar såsom Aquapel (PPG Industries) injiceras i den fluidala portar via en 1 ml spruta och en sprutnål. 12 försiktigt men fast injicera Aquapel följt av rening luft in i fluida portarna utan att bryta PDMS till glas bindning . Aggressivt upprepa luften utrensning på alla in-och utsugningskanaler samtidigt torka bort eventuellt överskott av Aquapel för att undvika avlagringar som kan täppa igen kanalerna vid torkning.

2. Provberedning

  1. Förbered en cellkultur enligt fastställda rutiner för din valda celltyp. För den speciella anordning som används i denna studie bör 8-15 ^ m partiklar eller celler att på ett lämpligt för inkapsling. Mindre eller större celltyper kan kräva att man ändrar dimensioner fokuserar kanalen för att uppnå adekvat Re s.. För migThOD demonstration resultaten visas i detta dokument är 9,9 m polystyren mikrosfärer (G1000, Thermo Scientific) utnyttjas som cell surrogat.
  2. Framställa den vattenhaltiga partikel eller cell-suspensionen genom försiktig blandning. Vid användning av celler eller partiklar polystyren är koncentrationen styrning nödvändig (se figur 4) för att uppnå perfekt beställt inkapsling. Med hjälp tidigare uppgifter 12 som en vägledning, beräkna den önskade cellen eller partikelkoncentration baserat på den beställda tåget avstånd och mikro-kanal storlek som: en cell eller partikel per förväntade längsgående tider tåg avstånd fokuseringen kanalen tvärsnittsarean. Om lagret koncentration (1% vikt / vikt) är otillräcklig, öka koncentrationen (här till 1,5% vikt / vikt) genom att försiktigt centrifugering av provet lager, avlägsnande överstående vätska, och åter-suspendera partiklarna genom att vortexa, eller mjukare blandning vid användning av celler. Förbered en tillräcklig volym för att redogöra för önskad uppsamling volym och under körning i samband med flOW tuning.
  3. Både celler och partiklar av polystyren har en specifik vikt större än ett. Även om det inte visas i detta protokoll för långsiktiga försök som pågår på order av många minuter till timmar, flytkraft matcha lösningen genom att tillsätta en löst ämne som CaCl 2 för partiklar eller OptiPrep (Sigma-Aldrich) för celler.
  4. Framställ en 10 ml prov av den kontinuerliga fluorkol oljefasen genom blandning av fluorkol olja FC-40 (3M) och PFPE-PEG-segmentsampolymer ytaktivt 25 (2,5% vikt / vikt) (Raindance Technologies) i en 15 ml centrifugrör. Alternativt kan lätt mineralolja (PTI Process Chemicals) utnyttjas med ABIL-EM 90 ytaktivt medel (2,5% vikt / vikt) (Evonik Goldschmidt Corp).

3. Experimentuppställning

  1. Slå på den inverterade optiska mikroskop (Axio Observer, Zeiss) och höghastighetskamera (Phantom V310, Vision Research). Fokus och inspektera kanaler för träskor och skräp genom att antingen manuellt flytta enheten ellergenom användning av en motoriserad mikroskopställningen. Några små skräp kan tryckas ut när vätska strömmar igenom. För stora skräp eller uppenbara träskor, välj en annan kanal på enheten som skräp i fokus kanalen kan försämra beställa kvaliteten betydligt. Notera att täpps ofta kan avlägsnas under flöde genom att trycka nedåt på PDMS ytan ovanför den påverkade regionen med trubbiga pincett.
  2. Skär tre längder av PVC slang (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) för vatten inloppet, olja inlopp och emulsion utlopp. För att minimera dödvolym, klippa precis tillräckligt slang för att nå från sprutan pumpar till mikroskopet scenen. Skär slangar slutar vid en 45 ° vinkel för att underlätta införande i fluidic portar.
  3. Använd pincett för att trycka passa röret spetsar i fluidic portarna stansade i steg 1 och tryck sedan på montera två 30 gauge trubbig spets i rostfritt stål kanyler (SmallParts) i de fria ändarna av respektive vatten-och olje rör inloppet (inget lim behövs) . Placera utloppsslangen i en papperskorg reservoir. Detta rör kommer senare att förflyttas in i en uppsamlingsbehållare.
  4. Flytta enheten och bifogade slangen till mikroskop scenen, rikta in och fokusera på enheten munstycket med en tillgänglig objektiv (20x användes för detta experiment). Justera för K hler belysning och andra inställningar mikroskop som krävs för optimal inspelning.
  5. Fylla en 1 ml spruta (BD) med den väl blandade vattenhaltiga fasen och en 3 ml spruta (BD) med oljefasen lösningen framställd i steg 2. Observera att alla sprutor av någon volym kan användas och bör väljas med omsorg beroende på de önskade run tider och minimering av eventuella pulsatilitet. Luta en spruta vertikalt och skaka för att flytta luftbubblor till sprutan utlopp. Långsamt trycka kolven tillräckligt för att driva luft till sprutspetsen. Håll sprutan lodrätt, anslut sprutor till respektive sprutnålen redan ansluten till enheten i steg 3,3. Nedtrycka kolven för att tvinga luft genom injektionsnålen dödvolym tills vätskan är pushed genom slangen nästan till anordningen. Säkert montera sprutan till en sprutpump (Nexus 3000, Chemyx) och ingriper med kolven blocket. Upprepa anslutningar för den andra sprutan och montera en andra sprutpump.
  6. Ström på varje spruta pump och program med pumpens tillverkarens protokoll. Ställa de initiala flödena till Q olja = 50 | il / min och Q aq = 5 | il / min för oljefasen och vattenfasen resp. Starta pumparna.
  7. Vänta varje vätska att komma in i enheten och fylla kanalerna, trycka ut kvarvarande döda luft. Det kan ta flera minuter. Om det finns en stor mängd luft i inloppsröret, temporärt ökar varje flödeshastighet tills luften drivs ut. Ökar inte de flödeshastigheter så höga att stora tryck uppträder i kanalen, vilket kan leda till PDMS-till-glas-bindning misslyckande.
  8. Med användning av de initiala flödena, observera bildandet av droppar vid munstyckets (resultat visas här: 20x magnification, bildhastighet 21005 bps, exponering 3 ps). Reducera kamerans synfält för att endast munstycket för att maximera den bildfrekvens och minska minneskraven om möjligt. Fånga prov videor och bekräfta att samplingshastigheten är tillräcklig för att undvika aliasing.
  9. För att undvika spruta (se figur 2), börja med låga vattenbaserade flödeshastigheter. Långsamt öka den vattenhaltiga flödet att observera beställning av partiklar på längre vattenlösning kanal som flödeshastigheten ökar.
  10. Om partikeln koncentrationen är för låg för att ge tåg med relativt få "saknas" partiklarna och provet inte flytförmågan matchade, fysiskt luta sprutpump mot sprutan utlopp för att tillhandahålla gradvisa sedimentering av partiklar mot sprutans utlopp. Denna metod visas i videon protokollet. Periodvis rotera sprutan längs dess axel kan också minska oönskad sedimentering.
  11. När tillräcklig beställning sker, justera hastigheten oljeflödet att ställa generering frekvens ochStorleken av dropparna. Den genomsnittliga minskningen Volymen kan beräknas med hjälp av vatten flödet dividerat med droppe generation frekvens som mäts genom videoinspelning. Iterativt justera båda flöden för att uppnå önskade inkapsling priser och volymer drop.
  12. När en stabil beställt inkapsling bekräftas, flytta utloppsröret från avfallet reservoaren in i en uppsamlingsbehållare eller mata i en annan enhet för efterföljande testning.
  13. Bestäm samlingen tid baserat på önskat antal droppar och den beräknade generation frekvens.
  14. Anteckna bråkdel av droppar som innehåller 0, 1, 2, ..., N partiklar att kvantifiera effektiviteten antingen med drop resultat generationens video eller genom att pipettera ett prov av insamlade emulsion för inspektion.

4. Representativa resultat

Resultaten presenteras som uppnår både kontrollerad enda partikel och kontrollerad dubbelblind partikel inkapsling (figur 3). Genom att skäraFC-40 oljeflöde på mitten, blir en enda partikel inkapsling två-partikel inkapsling. Omvänt kunde vi ha ökat vattenbaserade flöde för att leverera partiklar till munstycket snabbare, men vi skulle också ha ökat risken för sprutande av vattenströmmen. Histogram i figur 3 presenteras den fraktionella antalet partiklar per droppe för de två fallen, tillsammans med jämförelser med Poisson statistik. De tillfälliga droppar med noll partiklar är främst på "saknas" partiklar i de beställda tågen, medan de fall där det finns flera inkapslade partiklar än önskat resultat från lokala höga partikelhalter och partiklar som ibland vandrar mot en av de två vertikala fokus lägen. Observera att flytkraft matchande som beskrivs i avsnitt 2 inte utnyttjades. I stället var den sprutpumpen fysiskt lutas för att tillåta sedimentering av partiklar mot sprutans utlopp, som leder till en hög koncentration av partiklar under körningen.

figur 4. Utan fullt beställning är lokaliserade grupper av partiklar ordning och inkapslade, men många droppar utan partiklar. Ett histogram visar den minskade effektiviteten hos inkapslandet för den önskade partikeln två inkapsling.

Figur 1
Figur 1. Inkapsling anordning. a) Övergripande enhet med vikar, utlopp och långt beställning kanal. Anordningen höjd är 52 fim och den beställande kanalbredden är 27 pm. b) Både vatten och inlopp olja har stora skräp filter med luckor på i storleksordningen beställning kanalens bredd för förstorad bild av oljan inloppet. c) den utvidgade Munstycket vyn visar lika kanalbredder av 27 m för vattenbaserade och olja kanaler, följt av munstycket sammandragning av 22 nm och plötslig expansion för en bredare 61 m kanal.Observera att anordningens dimensioner som visas här har verifierats med hjälp av en profilometer efter mikrofabrikation och skiljer sig något från de nominella måtten på masken. En sann bild av beställa kanalen och munstycket finns online som Supplemental figur 1 . Den AutoCAD maskfilen har också tagits på nätet som ett komplement till detta manuskript.

Figur 2
Figur 2. Hysteres i en droppande för att spruta övergången med hjälp av en bredare enhet (80 nm breda x 22 m hög). a) Vid konstant FC-40 strömningshastigheten (Q olja = 45 | il / min), inträffar stadig droppbildning vid 10 kHz med användning av en vattenhaltig strömningshastigheten Q aq = 8 | il / min. Såsom det vattenhaltiga flödet ökas långsamt till 10 & mu, L / min, utsprutning av den vattenhaltiga vätskeströmmen utlöses. b) När flödet tillbaka till 8 pl / min sprutande fortsätter. Observera att jämn droppbildningsprocessen kan återupprättas genom att kort pausa vatten pump (en 1 sekund paus är typiskt).

Figur 3
Figur 3. Enkel-och dubbelsträngade-partikel inkapsling. En) droppbildning med en cell per droppe (Q olja = 60 | il / min, Q aq = 9 | il / min) med en droppe generering hastighet av 6,1 kHz, genomsnittlig droppstorlek av 24,4 pL, och en encelliga effektiviteter capture Dk = 79,5% och Pk = 83,7% (λ = 0,95) för en provstorlek av n d = 517 droppar och n p = 491 partiklar. b) droppbildning med två celler per droppe uppnås helt enkelt genom att reducera FC-40 strömningshastigheten Q olja till 30 μL / min. De större (39,8 pl) droppar bildas vid en hastighet av 3,8 kHz med en två-cell infångningseffektiviteten Dk = 71,5% och p k = 79,5% (λ = 1,80) för en provstorlek av n d = 383 droppar och n p = 689 partiklar. cd) Två histogram jämföra drop inkapslingseffektiviteter partikel D k beställde enkel-och dubbel-partikel inkapsling med Poisson statistik (random inkapsling). Observera att i båda fallen, är partikel avstånd i flödesriktningen ca 17-18 m för fullt beställda, omväxlande partiklar. Kompletterande videor som visar både enkel-och dubbel-partikel inkapsling är tillgängliga online. Klicka här för att se Kompletterande Movie 3a . Klicka här för att se Kompletterande Movie 3b .


Figur 4. Koncentrationen påverkar i hög grad inkapsling effektivitet. A) När koncentrationen minskar, inte fullt beställning inte uppstår, och därmed "hål" i tågen fram, lämnar några droppar med färre än väntat partiklar. B) Histogrammet visar den minskade effektivitet ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) för två-partikel inkapsling på grund av ett lägre värde på λ = 1,57 där det finns nästan lika många enda partikel sjunker eftersom det är dubbel-partikel droppar. Denna siffra är resultatet Q olja = 30 | il / min och Q aq = 9 | il / min, samma strömningsbetingelser som för figur 3b. Ett representativt kompletterande video finns tillgänglig online. Klicka här för att se Supplemental Movie 4 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

Trots relativt höga grader av beställning, kommer inte alla droppar innehåller den korrekta antalet partiklar eller celler. Inkapslingseffektivitet kan beräknas som antalet celler eller partiklar som blir inkapslade i droppar med den önskade beläggningen dividerat med deras totala antal. Dessa rådata kan erhållas antingen från en automatisk hög hastighet videoalgoritmen eller avbildning ett prov av insamlade emulsion. Detta kan jämföras med den fraktion av partiklarna P k inkapslad i en droppe innehållande K-partiklar och fraktionen av droppar Dk som skulle innehålla k partiklar. Av figur 3, både enkla och dubbla partikelfilter inkapslingseffektiviteterna överträffa slumpmässiga inkapslingseffektiviteterna med över en faktor två och kraftigt minska antalet droppar med mer än den önskade antalet partiklar figur 4 visar på behovet av lämpliga koncentrationer för hög effektivitet. dvs & lambd en;, en funktion av både partikelkoncentrationen och droppvolymen, bör vara lika med eller nära det önskade antalet celler per droppe att maximera korrekt-inkapslade partiklar eller celler. Observera att en högre koncentration av partiklar eller celler är oftast bra för fullt beställning så täta tåg har en tendens att spridas ut över tiden och fylla tommare regioner mellan tåg. Å andra sidan, om koncentrationen är för hög, kan det stora antalet partiklar orsaka gränsytorna instabiliteter som inducerar spruta vid munstycket. I särskilda studier (t.ex. encelliga inkapsling, till exempel), kan det vara mer fördelaktigt att undvika flera cell droppar på bekostnad av att införa några fler tomma droppar, så en något lägre λ kommer att önskas. Detta skulle även gälla för studier som syftar till att växelverkan mellan två celler eller mellan en cell och en partikel, där enda partikel eller en enda cell droppar är drägligare än droppar med två eller flera av en typ av cell eller partikel.

jove_content "> Att upprätthålla en konstant λ över tiden är kritisk för konsekvent inkapsling. Avvägningsvästar matchande hjälper på lång sikt koncentrationen kontroll genom att minska sedimentering av celler och partiklar i sprutan och slangen. Men flytkraft matchande resulterar också i en högre vatten viskositet som kan fördröjning beställning (vilket resulterar i längre fokusera kanal krav), öka drop-kanalen tryck och ändra flöden som krävs för drop generation. Ett alternativ till bärighet matchning används i detta experiment är att fysiskt luta sprutan pumpen så att sprutan utloppet pekar nästan lodrätt nedåt (för att minimera vidhäftning av celler eller partiklar till sprutan inre). Här använde vi 9,9 mikrosfärer m diameter med en partikel volymfraktion på 1,3% (ca 25 miljoner partiklar per ml), men vi utnyttjade luta för att öka volymen fraktioner till 2% för de data som visas i figur 3. Ett andra alternativ är att blanda den vattenhaltiga vätskan intermittently med en sluten rostfritt stål kullager (Teflon belagd för att arbeta med celler) med användning av en liten extern magnet. Försiktighet erfordras emellertid för att undvika att låta kullagret sedimentera till sprutspetsen där de kan täppa till ingången till inloppsröret. Men dessa alternativ är mer arbetsintensiva och mindre repeterbara än flytkraft matchning, så flytkraft matchning är mest lämpad för större skala experiment som förekommer över långa tidsramar. Även tröga beställning kräver hög Re och Re p att driva, varv när vatten-och flöden olja trycks högre och högre, stadig dropp av droppar bestyckningen 14 (se figur 2) och okontrollerade resultatet inkapsling. För celler mindre än de 10 um partiklarna som används här, kan mindre kanal dimensioner som krävs för att uppnå tillräcklig Re P om flödeshastigheter kan inte ökas utan sprutas. En egenhet av bestyckningen i mikroflödessystem system är att hystereseffekter kan uppstå which gör det svårt att sluta spruta genom att helt enkelt sänka vattenbaserade flödet när det väl inträffar tillbaka till en punkt där det inte observerades. Baserat på experimentella resultat, kan man utveckla en endimensionell eller icke-dimensionell droppade för att spruta flödet kartan som de tidigare utvecklats för axiella samarbete flytande munstycken 14 och T-korsningar 26-28 med ytterligare konturer för drop generation takt, celler per droppe, och inkapslingseffektivitet. Denna karta skulle ge en robust plan som droppen generation ränta kan förutsägas att beräkna λ och därmed ge en uppskattad flöde för vatten och olja strömmar a priori.

Även om det inte direkt demonstreras här, skulle ytterligare minska olja strömningshastigheten Q olja från de som presenteras i figur 3b att ytterligare öka antalet partiklar per droppe till tre, fyra, och så vidare. För att skapa fler partiklar per droppe, måste antingen Q olja minskar eller vattenhaltigexportorienterade företag flödet Q aq måste öka. Inom parentes har vi inkluderat en online kompletterande MATLAB script som modellerar inkapslingseffektiviteten att fånga ett antal partiklar i droppar. Användaren matar in genomsnittliga partikelstorleken avstånd och en partikel avstånd standardavvikelse, som modellerar graden att beställa. För beställda tågen kommer standardavvikelsen vara liten. Dessutom matar användaren in den genomsnittliga droppstorleken och droppstorleken standardavvikelse, som står för den polydispersitet av droppstorlekar. Se skriptet dokumentationen för ytterligare information.

Vid ökning av vattenhaltiga flödet eller minska hastigheten oljeflödet att öka antalet partiklar eller celler per droppe, risken för instabila strålorgan ökar respektive flödeshastigheterna nära extremvärden. Således det maximala antalet uppnås partiklar / celler per droppeberor på enheten geometri och egenskaper vätska. Med tanke på partiklar / cellkoncentrationen och olja flöde, är antalet partiklar / celler per droppe begränsas av övre gränser för vattenbaserade flöden, som måste vara tillräckligt stor för att framkalla beställa men måste vara tillräckligt liten för att undvika instabila spruta (och begränsa skjuvning påkänningar på celler för livsdugligheten). Alternativt, givet en vattenbaserad flöde med vilken beställning sker måste oljeflöde förbli tillräckligt stor nog att stanna kvar i dropp regimen.

Observera att släppa generation och droppade för att sprutas övergången är mycket känsliga för ytaktivt koncentration. Höga koncentrationer av ytaktiva medel öka viskositeten hos oljan, att ändra parametrarna droppbildningen. Inom parentes visar bristen på allmänt tillgängliga biokompatibla tensider för fluorkarbonpolymerer olja en stor utmaning. För närvarande finns en kommersiell leverantör (Raindance Technologies) under PFPE-PEG-segmentsampolymer tensider, 25 men studier visar småskaliga syntestekniker av ett antal ytaktiva grupper såsom PFPE-HEG. Har 29,30 alternativ såsom lätt mineralolja använts i biologiska tillämpningar droppbildningen att komma ett bredare spektrum av tillgängliga ytaktiva medel, 24,31 men lägg märke till att den åtföljande ökningen i viskositet jämfört med fluoriderad kolväteolja förändrar de parametrar droppbildningen. En färsk översikt 32 beskriver ett stort antal publicerade kontinuerlig fas oljor och ytaktiva ämnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

JE är upphovsman till en patentsökt baserad på tekniken som används i detta manuskript.

Acknowledgements: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

Vi tackar Raindance Technologies för provet PFPE-PEG tensid som används i denna studie, och vi tackar BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, direktör) för kiselskivan form som används för att skapa PDMS kanal repliker.

Materials: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

References: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

  1. Zagnoni, M., Le Lain, G., & Cooper, J.M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X.Z., Gielen, F., Edel, J.B., & deMello, A.J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M.E., Liu, W., Haney, E.B., & Ismagilov, R.F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A., et al. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications., 1218-1220 (2007).
  5. Love, J.C., Ronan, J.L., Grotenbreg, G.M., van der Veen, A.G., & Ploegh, H.L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E.M., et al. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W.S., Kim, H.J., Lucchetta, E.M., Du, W.B., & Ismagilov, R.F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J.Q., Li, L., Kline, T.R., & Ismagilov, R.F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R.T., Page, J.S., Marginean, I., Tang, K., & Smith, R.D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A.J., & Jayasinghe, S.N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
  12. Edd, J.F., et al. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S.L., Bontoux, N., & Stone, H.A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., & Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99 (2007).
  15. Chabert, M. & Viovy, J.L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segré, G. & Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Di Carlo, D., Edd, J., Humphry, K., Stone, H., & Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102 (2009).
  19. Humphry, K.J., Kulkarni, P.M., Weitz, D.A., Morris, J.F., & Stone, H.A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H.A., & Di Carlo, D. Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413-22418 (2010).
  21. Duffy, D.C., McDonald, J.C., Schueller, O.J.A., & Whitesides, G.M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., & Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319, DOI: 10.3791/319 (2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., & Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A.C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., & Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94 (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M.J., Stone, H.A., & Whitesides, G.M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z., et al. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. (2008).
  29. Holt, D.J., Payne, R.J., Chow, W.Y., & Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D.J., Payne, R.J., & Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A.C., Fisher, J.S., Pentoney, S.L., Yang, D.L., & Lee, A.P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J.C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Ask the Author: Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter