Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Danish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

,

Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Bioengineering. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 50.16.36.153, User IP: 50.16.36.153, User IP Hex: 839918745

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

Protocol: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

Protokollerne i dette afsnit beskriver de materialer og udstyr anvendes specifikt til opnåelse af de eksperimentelle præsenterede resultater. Bemærk, at alternative leverandører af kemikalier og udstyr kan anvendes.

1. Device Fabrikation og Soft Litografi

Standard bløde litografi teknikker, 21 et antal, der er blevet præsenteret i tidligere Jové artikler, blev 22 anvendes til at skabe polydimethylsiloxan (PDMS) mikrokanalplader netværk bundet til glas substrater. Bortset fra master replica skimmel fabrikation af SU-8 fotolitografi, kan processerne udføres uden et rent rum eller rent hætte, men støv og partikler stadig skal minimeres for at opnå ensartede resultater.

  1. Designe en mikro-kanal mønster som vist i figur 1 i AutoCAD (AutoDesk Inc.). Ansæt en tredjepart producent (Fineline Imaging Inc.) til at udskrive en høj opløsning (50.000 dpi) transgennemsigtighed maske på Mylar film eller kvarts, hvor kanalerne er gennemsigtige på en mørk baggrund.
  2. Opret en silicium og SU-8 photoresist master for replika støbning. Kort fortalt dreje SU-8 2050 (MicroChem) negativ fotodækmiddel med producentens anbefalede rpm på en spin-coater at skabe et 52 um tykt lag på en ren 7,5 cm eller 10 cm silicium wafer. Efter blød bage, kantrand fjernelse, UV-eksponering gennem en kontakt maske, post-eksponering bage, udvikling og oversvømmelse eksponering, måle den faktiske tykkelse af SU-8 lag ved hjælp af en Dektak profilometer (Veeco). Båndet master formen på bunden af ​​en 4 "eller 5" petriskål til at forberede PDMS replika støbning.
  3. Blanding PDMS elastomer base med elastomer hærdningsmidlet (Dow Corning) i et 10:01-forhold vægt / vægt base hærdemiddel. Hæld velblandet PDMS precursor på silicium føreren for at skabe en 2-3 mm sluttykkelse lag. En blanding af 20 g elastomer base med 2 g hærder, er tilstrækkelig til at dække en 4 "diameter overflade.
  4. Placer master mug og PDMS i vakuum (Jencons) til de-gas den uhærdede PDMS. Ved hjælp af en trykregulator (Cole Parmer), aftage langsomt kammeret gage trykket fra 0 "Hg til -27" Hg i løbet af 20 minutter for at undgå overdreven skumdannelse. Efterlade anordningen i vakuumkammeret ved -27 "Hg i 30 minutter eller indtil luftbobler forsvinder.
  5. Frigive vakuum og bevæger fører formen og PDMS til en 65 ° C ovn (Thermo Scientific) i mindst fire timer. Indretningen kan efterlades i ovn natten over til forbedring af hærdning.
  6. Fjern enheden fra ovnen og lad den afkøle. Skær forsigtigt PDMS omkring cirkulær wafer med en præcision kniv og skræl ud PDMS. Udskåret indretning omrids som vist i figur 1 med en skalpel.
  7. Punch strømningstekniske porte (tre pr enhed) i de tre runde regioner er vist i figur 1 anvender en biopsitang. For denne enhed, skal du bruge en 0,75 mm udvendig diameter punch (Harris).
  8. Adhærere tape til den mønstrede side af PDMS og skræl at fjernestøv. Som en omkostningsbesparende, men levedygtigt alternativ til konventionelle ilt plasma apparater, behandle 21,22 plasma den mønstrede side af PDMS og en ren 3 "x 1" objektglas ved hjælp af en håndholdt laboratorium corona behandlingsapparatur (Electro-Technic Products Inc. .). 23 Bemærk, at denne enhed skal bruges i et stinkskab eller godt ventileret område på grund af ozon udledning, og alle ure og mobiltelefoner skal holdes mindst ti meter væk. Juster koronaudladning at opnå en stabil korona med minimal gnister. Langsomt bølge elektroden omkring 1/4 "over hver overflade for omkring 20 sekunder og derefter straks bringe de behandlede overflader i kontakt at danne en stærk permanent obligationen før PDMS overflader vende tilbage til deres oprindelige tilstand.
  9. Placer enheden på en metalplade, sted i et køligt ovn, indstil ovnen til 120 ° C, og bage natten over for at fuldføre limning og returnere PDMS til sin oprindelige hydrofobe tilstand. 24 Under denne høje temperatur bagning, tHan glasoverflade kanalen vil også blive gjort hydrofobt grund af aflejring af et tyndt hydrofobt lag på glasset. Alternativt kan hydrofobe overtræk såsom Aquapel (PPG Industries) injiceres i de strømningstekniske porte ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en kanyle. 12 forsigtigt, men godt Injicer Aquapel efterfulgt af renseluft ind i strømningstekniske havne uden at bryde PDMS til glas binding . Aggressivt gentage luftrensningen alle indløbs-og udløbsporte, mens aftørre overskydende Aquapel for at undgå aflejringer, som kan tilstoppe kanaler efter tørring.

2. Prøvefremstilling

  1. Forbered en cellekultur efter de fastlagte procedurer for din valgte celletype. For den særlige indretning, der anvendes i denne undersøgelse, skal 8-15 um partikler eller celler tilstrækkeligt bestille til indkapsling. Mindre eller større celletyper kan kræve ændring af dimensionerne af den fokuserende kanalen for at opnå tilstrækkelig Re p. For migThOD demonstration resultater vist i dette papir, er 9,9 um polystyren mikrokugler (G1000, Thermo Scientific) anvendes som celle surrogater.
  2. Fremstilling af den vandige partikel eller celle suspensionen gennem forsigtig blanding. Ved anvendelse af celler eller polystyren partikler, koncentration kontrol er afgørende (se figur 4) for at opnå ideel bestilt indkapsling. Brug af tidligere data 12 som en guide, beregner den ønskede celle eller partikel koncentration baseret på det bestilte tog afstand og mikro-kanal størrelse: en celle eller partikel per forventede langsgående tog afstand gange fokuserer kanalen tværsnitsareal. Hvis stamkoncentration (1% w / w) er utilstrækkelig, forøge koncentrationen (her til 1,5% w / w) ved forsigtig centrifugering af bestanden prøven, fjernes supernatanten, og re-suspendere partiklerne ved hvirvelblanding eller mildere blanding når celler. Fremstilling af en tilstrækkelig mængde for at tage højde for den ønskede opsamlingsvolumen og kørselstid er forbundet med flOW tuning.
  3. Både celler og polystyrenpartikler har en vægtfylde større end én. Selvom det ikke er påvist i denne protokol, for langsigtede eksperimenter varighed på rækkefølgen af mange minutter til timer, passer opdrift løsningen ved at tilføje en solut som CaCl 2 for partikler eller OptiPrep (Sigma-Aldrich) for celler.
  4. Fremstilling af en 10 ml prøve af den kontinuerlige fluorcarbon oliefase ved at blande fluorcarbon olie FC-40 (3M) og PFPE-PEG-blok-copolymer overfladeaktive 25 (2,5% w / w) (Raindance Technologies) i et 15 ml centrifugerør. Alternativt kan let mineralolie (PTI-processen Chemicals) anvendes med ABIL-EM 90 overfladeaktivt middel (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Forsøgsopstilling

  1. Tænd den omvendte optiske mikroskop (Axio Observer, Zeiss) og high speed kamera (Phantom V310, Vision Research). Fokus og inspicere de kanaler til træsko og stumper ved enten manuelt at flytte enheden ellerved anvendelse af en motoriseret mikroskopobjektbord. Nogle mindre affald kan blive skubbet ud, når væske strømmer igennem. For store rester eller åbenlyse træsko, vælge en anden kanal på enheden, som fremmedlegemer i fokus kanalen kan forringe bestilling kvalitet betydeligt. Bemærk, at tilstopning ofte kan fjernes under strømning, ved at trykke på en eller anden PDMS overflade over det ramte område med stumpe pincet.
  2. Skær tre længder af PVC-rør (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) for vandige indløb, oliepåfyldning, og emulsion udtag. At minimere dødvolumen, skåret lige nok rør til at nå fra sprøjtepumper til mikroskopbordet. Skåret rør ender i en 45 ° vinkel for at lette indføring i strømningstekniske porte.
  3. Anvende en pincet til at prespasning rørenderne i de strømningstekniske portene udstansede i trin 1 og tryk passer to 30 gauge stump-spids rustfrit stål injektionsnåle (SmallParts) til de frie ender af de respektive vandige og olie indløbsrør (ingen klæbemiddel nødvendigt) . Placer udløbsslangen i et spild reservoir. Dette rør vil senere blive bevæget ind i en opsamlingsbeholder.
  4. Flyt enheden og vedlagte slange til mikroskopbordet, justere og fokusere på enheden dyse ved hjælp af et tilgængeligt mål (20x blev brugt til dette eksperiment). Juster for K hler belysning og andre mikroskop indstillinger, som kræves for optimal optagelse.
  5. Fyld en 1 ml sprøjte (BD) med godt blandet vandig fase og en 3 ml sprøjte (BD) med oliefasen opløsningen fremstillet i trin 2. Bemærk, at de sprøjter med en mængde, kan anvendes og skal omhyggeligt vælges afhængigt af de ønskede driftstid og minimering af Pulsatilitetsindeks. Vip en sprøjte lodret og svirp til at flytte luftbobler i sprøjten stikkontakten. Langsomt trykkes stemplet tilstrækkeligt til at skubbe luften til sprøjten. Hold sprøjten lodret, forbinde sprøjter til de respektive sprøjtenålen allerede fastgjort til enheden i trin 3,3. Trykkes stemplet for at tvinge luft gennem kanylen døde volumen, indtil væsken er pushed gennem røret nærmest til enheden. Sikkert at montere en sprøjte til en sprøjtepumpe (Nexus 3000, Chemyx) og indgribe med stemplet blok. Gentage forbindelser til den anden sprøjte og montere en anden sprøjtepumpe.
  6. Strøm på hver sprøjtepumpe og programmet ved hjælp af pumpen producentens protokoller. Indstillet indledende strømningshastigheder Q olie = 50 uL / minut og Q aq = 5 uL / minut i oliefasen og den vandige fase, hhv. Starte pumperne.
  7. Vent for hver væske ind i apparatet og fylde kanalerne, skubber de resterende døde luft. Dette kan tage flere minutter. Hvis der er en stor mængde luft i indløbsrøret, midlertidigt øge hver strømningshastighed, indtil luften er drevet ud. Ikke forøger strømningshastigheder så høje, at store tryk forekommer i kanalen, hvilket potentielt fører til PDMS-til-glas binding svigt.
  8. Brug de første strømningshastighederne, observere dannelsen af ​​dråber på dysen (resultater vist her: 20x magnification, frame rate 21005 fps, eksponering 3 us). Reducere kameraets synsfelt kun dysen for at maksimere rammehastighed og reducere hukommelseskrav hvis muligt. Capture prøve videoer og bekræfter, at samplingfrekvens er tilstrækkelig til at undgå aliasing.
  9. For at undgå jet (se figur 2), skal du starte med lave vandige flowhastigheder. Langsomt øge den vandige strømningshastigheden at observere bestilling af partikler i lange vandige opløsning kanal som strøm stiger.
  10. Hvis partiklen koncentrationen er for lav til at give tog med relativt få "manglende" partikler og prøven blev ikke opdrift matchede fysisk vippe sprøjtepumpen mod sprøjten udløbet for at tilvejebringe gradvise bundfældning af partikler mod sprøjten udløbet. Denne metode er vist i video-protokollen. Periodisk rotation af sprøjten langs sin akse kan også reducere uønsket bundfældning.
  11. Når tilstrækkelig bestilling sker, justere olien strømningshastigheden at indstille generation frekvens ogStørrelsen af ​​dråber. Det gennemsnitlige fald volumen kan beregnes ved hjælp af vandige strømningshastigheden divideret med den dråbe generation frekvens målt ved videooptagelse. Iterativt justere begge strømningshastigheder for at opnå de ønskede indkapsling priser og drop mængder.
  12. Når stabil bestilt indkapsling bekræftes bevæge udløbsslangen fra affaldet reservoiret ind i et opsamlingsreservoir eller foderstoffer i en anden anordning til efterfølgende testning.
  13. Bestem den indsamling tid baseret på ønskede antal dråber, og den beregnede generation frekvens.
  14. Registrere den fraktion af dråber indeholdende 0, 1, 2, ..., N partikler at kvantificere effektivitet ved anvendelse af enten forlader generation video resultater eller pipettering af en prøve af opsamlet emulsion for inspektion.

4. Repræsentative resultater

Resultaterne er præsenteret som opnår både kontrolleret enkelt partikel og kontrolleret dobbelt-partikel indkapsling (figur 3). Ved at skæreFC-40 olie flow i halve, enkelt-partikel indkapsling bliver to-partikel indkapsling. Omvendt kunne vi have øget vandige strømningshastigheden at levere partikler til dysen hurtigere, men vi har også ville have øget risiko for spuling af den vandige strøm. Histogrammerne i Figur 3 præsenterer fraktioneret antallet af partikler pr dråbe for de to tilfælde, sammen med sammenligninger Poisson statistikker. Lejlighedsvis dråber med nul partikler primært "manglende" partikler i de bestilte togene, medens de tilfælde, hvor der er flere indkapslede partikler end ønsket resultat af lokale høje partikelkoncentrationer og partikler, som undertiden migrerer mod et af de to lodrette fokus positioner. Bemærk, at opdriften matchende som beskrevet i afsnit 2 blev ikke udnyttet. I stedet blev sprøjtepumpen fysisk vippes for at tillade bundfældning af partikler mod sprøjten udløbet, hvilket fører til en høj koncentration af partikler under kørslen.

figur 4. Uden fuld bestilling, er lokaliserede grupper af partikler orden og indkapslet, men mange dråber er uden partikler. Et histogram viser faldet indkapslingseffektivitet for det ønskede to partikeltyper indkapsling.

Figur 1
Figur 1. Indkapsling enhed. a) Samlet enhed med indløb, udløb og lang bestilling kanal. Indretningen højde er 52 um, og bestilling kanalbredden er 27 um. b) Både vandig og olie indløb har store klippestykker filtre med mellemrum på rækkefølgen af ​​bestilling kanalbredden for forstørret billede af oliepåfyldning. c) Det udvidede dysen billede viser lige kanalbredder af 27 um til de vandige og olie kanaler, efterfulgt af dysen sammentrækning af 22 um og pludselig ekspansion til en bredere 61 um kanal.Bemærk, at dimensionerne af indretningen vist her, er blevet kontrolleret ved hjælp af et profilometer efter microfabrication og adskiller sig lidt fra de nominelle dimensioner på masken. Et retvisende billede af bestilling kanal og dyse er tilgængelige online, som Supplemental Figur 1 . Det AutoCAD Masken fil er også blevet inkluderet online som et supplement til dette manuskript.

Figur 2
Figur 2. Hysterese af en drypning til jet overgang med et bredere anordning (80 um brede x 22 um høj). a) Ved konstant FC-40 strømningshastighed (Q olie = 45 uL / minut), steady dråbedannelse forekommer ved 10 kHz med en vandig strømningshastighed Q aq = 8 uL / minut. Som den vandige strømningshastigheden langsomt forøget til 10 & Mu; L / min, jetting af den vandige væskestrøm udløses. b) Når strømningshastigheden returneres til 8 ul / min strålehoved fortsætter. Bemærk, at steady dråbedannelse kan genetableres ved kort pause vandige pumpe (en 1 sekund pause er typisk).

Figur 3
Figur 3. Enkelt-og dobbelt-partikel indkapsling. A) dråbedannelse med én celle pr dråbe (Q olie = 60 uL / minut, Q aq = 9 uL / minut) med en dråbe generation på 6,1 kHz, gennemsnitlig dråbestørrelse på 24,4 pL og en enkelt-celleindfangning effektiviteter D k = 79,5% og P k = 83,7% (λ = 0,95) for en prøvestørrelse n d = 517 dråber og n p = 491 partikler. b) dråbedannelse med to celler dråbe opnås simpelthen ved at reducere FC-40 strømningshastigheden Q olie til 30 μL / min. Den større (39,8 pL) dråber dannes ved en hastighed på 3,8 kHz med en to-celle indfangningseffektiviteten D k = 71,5% og P k = 79,5% (λ = 1,80) for en prøvestørrelse n d = 383 dråber og n p = 689 partikler. cd) To histogrammer sammenligne drop indkapsling partikel effektivitet D k af bestilt enkelt-og dobbelt-partikel indkapsling med Poisson-statistik (tilfældig indkapsling). Bemærk, at for begge tilfælde partikel afstand i retning af strømningen er ca 17-18 um for fuldt sorteret og skiftevise partikler. Supplerende videoer, der viser både enkelt-og dobbelt-partikel indkapsling er tilgængelige online. Klik her for at se Supplerende Movie 3a . Klik her for at se Supplerende Movie 3b .


Figur 4. Koncentration i høj grad påvirker indkapslingseffektivitet. A), idet koncentrationen falder, betyder fuld bestilling ikke forekomme, og dermed "huller" i togene frem, efterlader nogle dråber med færre end forventede partikler. B) Histogrammet viser nedsat effektivitet ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) for to-partikel indkapsling skyldes en lavere værdi af λ = 1,57, hvor der er næsten lige så mange enkelt partikel falder, da der er dobbelt partikel dråber. Dette tal er fremkommet fra Q olie = 30 ul / min, og Q aq = 9 uL / minut, samme flow betingelser som for figur 3b. En repræsentant supplerende video er tilgængelig online. Klik her for at se Supplemental Movie 4 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

På trods af relativt høje grader af bestilling, vil ikke alle dråber indeholder det rette antal af partikler eller celler. Indkapslingseffektivitet kan beregnes som antallet af celler eller partikler, der bliver indkapslet i dråber med den ønskede belægning divideret med det samlede antal. Disse rådata kan fås enten fra et automatiseret high speed video algoritme eller fra billeddannelse en prøve af indsamlet emulsion. Dette kan sammenlignes med den fraktion af partikler P k indkapslet i en dråbe indeholder K-partikler, og fraktionen af dråber D k, der indeholder K-partikler. Af figur 3, overgår både enkelt og dobbelt partikler indkapslingseffektiviteter tilfældige indkapslingseffektiviteter med mere end en faktor to og reducerer antallet af dråber med mere end ønsket antal partikler Figur 4 viser behovet for passende koncentrationer for høj effektivitet. det vil sige, og lambd en, er en funktion af både partikelkoncentration og slip volumen bør være lig med eller tæt på antallet af ønskede celler pr dråbe for at maksimere korrekt-indkapslede partikler eller celler. Bemærk, at en højere koncentration af partikler eller celler er normalt en god ting for fuld bestilling så tætte tog tendens til at sprede ud over tid og udfylde tommere regioner mellem tog. På den anden side, hvis koncentrationen er for høj, kan det store antal partikler forårsage grænsefladespændinger ustabiliteter, som inducerer stråleretningen ved dysen. I specifikke undersøgelser (f.eks enkelt celleindkapsling, for eksempel) kan det være mere fordelagtigt at undgå multipel-celle dråber på bekostning af at indføre nogle flere tomme smådråber, så en smule lavere λ vil være ønsket. Dette gælder også for undersøgelser med henblik på interaktioner mellem to celler eller mellem en celle og en partikel, hvor enkelt-partikel-eller enkelt-celle smådråber er mere acceptabel end små dråber med to eller flere af en type af celle eller partikel.

jove_content "> Opretholdelse af en konstant λ over tid er afgørende for sammenhængende indkapsling. Afbalanceringsveste matchende hjælper på længere sigt koncentration kontrol ved at reducere afregning af celler og partikler i sprøjten og slanger. Men opdrift matchende også resulterer i en højere vandig viskositet, der kan forsinke bestilling (hvilket resulterer i længere fokusering kanal krav), øger kanalen trykfald, og ændre strømningshastigheder, der kræves for dråbe generation. Et alternativ til flydeevne matchende anvendt i dette eksperiment er fysisk vippe sprøjtepumpen, så at sprøjten udløbet peger næsten lodret nedad (for at minimere adhæsion af celler eller partikler til sprøjten indre). her anvendte vi 9,9 um diameter mikrosfærer med en partikelstørrelse volumenfraktion på 1,3% (omkring 25 millioner partikler pr ml), men vi anvendte vipning for at øge volumenfraktioner til 2% for de data, der er vist i fig. 3. Et andet alternativ er at blande den vandige væske intermittstændigt med lukket rustfri kugleleje (Teflon-belagt for at arbejde med celler) under anvendelse af en lille udvendig magnet. Omhu er imidlertid nødvendigt at undgå at lade kuglelejet sedimentere til sprøjten, hvor det kan okkludere indgangen til indløbsrøret. Men disse alternativer er mere arbejdskrævende og mindre gentagelig end opdrift søgeord, så opdrift matchning er bedst egnet til større skala eksperimenter opstået over lange tidshorisonter. Mens inerti bestilling kræver høj Re og Re p at betjene, ture, hvor den vandige og olie strømme bliver skubbet højere og højere, konstant dryppende dråber til jet-14 (se figur 2) og ukontrollerede indkapsling resultater. For celler mindre end 10 um partikler, der anvendes her, kan mindre kanal dimensioner være forpligtet til at opnå tilstrækkelig Re P Hvis strømningshastighederne ikke kan øges uden højtryksspuling. Et særligt træk ved jetting i mikrofluide systemer er, at hysterese effekter kan opstå wVILKEN gør det vanskeligt at stoppe jet ved simpelthen at sænke den vandige strømningshastighed, når den forekommer tilbage til et punkt, hvor det blev ikke observeret. Baseret på eksperimentelle resultater, kunne man udvikle en dimensionel eller ikke-dimensionel dryp til jet-strømme kort som dem, der tidligere er udviklet for aksiale co-strømmende dyser 14 og T-kryds 26-28 med ekstra konturer for drop generation sats, celler pr drop, og indkapslingseffektivitet. Dette kort ville give en robust køreplan, hvorfra drop generation sats kan forudsiges at beregne λ og dermed give en anslået flow for vand og olie vandløb a priori.

Ikke direkte påvist her, vil yderligere reduktioner i olie strømningshastigheden Q olie fra dem vist i figur 3b yderligere at forøge antallet af partikler pr dråbe til tre, fire, og så videre. For at opnå flere partikler pr drop, skal enten Q olie reducere eller vandigtEOUS flow Q aq skal øges. Som en sidebemærkning, har vi inkluderet en online supplerende MATLAB script som modellerer indkapslingseffektiviteten at indfange et vilkårligt antal partikler i dråber. Brugeren indlæser gennemsnitlige partikel afstand og en partikel afstand standardafvigelse, som modellerer graden af ​​bestilling. For bestilte tog, vil standardafvigelsen være lille. Derudover brugeren indlæser gennemsnitlige dråbestørrelse og dråbestørrelse standardafvigelse, der tegner sig for polydispersitet dråbestørrelser. Se scriptet dokumentationen for yderligere oplysninger.

Ved øgning af vandige strømningshastighed eller nedsætte olie strømningshastighed til at øge antallet af partikler eller celler pr dråbe, risikoen for ustabile jetting stiger de respektive strømningshastigheder nær ekstreme værdier. Således, det maksimale antal opnåelige partikler / celler pr dropvil afhænge af enhedens geometri og væske egenskaber. Given partikel / cellekoncentrationen og olie strømningshastighed, er antallet af partikler eller celler pr dråbe begrænset af en øvre grænse for vandige strømningshastigheder, der skal være stor nok til at inducere bestilling, men skal være lille nok til at undgå ustabil jet (og begrænser forskydning understreger på celler til at sikre levedygtighed). Alternativt gives en vandig strømningshastighed, ved hvilken rækkefølge forekommer, skal olien strømningshastighed forbliver tilstrækkeligt stort nok til at forblive i den dryppende regime.

Bemærk, at drop generation og den dryppende til jet-overgangen er meget følsomme over for tensidkoncentration. Høje koncentrationer af overfladeaktivt stof forøge viskositeten af ​​olien, ændre drop generation parametre. Som en sidebemærkning, præsenterer manglen på bredt tilgængelige biokompatible overfladeaktive stoffer til fluorocarbon olier en stor udfordring. Dag, en kommerciel leverandør (Raindance Technologies) findes for PFPE-PEG-blok-copolymer overfladeaktive midler, 25, men undersøgelser viser små syntese teknikker i en række af overfladeaktive grupper såsom PFPE-HEG. 29,30 alternativer såsom let mineralolie er blevet anvendt i biologiske drop generation af applikationer adgang til en bredere vifte af tilgængelige overfladeaktive stoffer, 24,31 men bemærk at den ledsagende stigning i viskositet sammenlignet med fluorcarbon olie ændrer drop generation parametre. En nylig undersøgelse 32 beskriver en lang række publicerede kontinuerlige fase olier og overfladeaktive midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

JE er en opfinder en verserende patent baseret på teknologien anvendt i dette skrift.

Acknowledgements: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

Vi takker Raindance Technologies for prøven af ​​PFPE-PEG overfladeaktive stoffer anvendt i denne undersøgelse, og vi takker BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, direktør) for silicium wafer formen bruges til at skabe PDMS kanal reproduktioner.

Materials: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

References: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

  1. Zagnoni, M., Le Lain, G., & Cooper, J.M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X.Z., Gielen, F., Edel, J.B., & deMello, A.J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M.E., Liu, W., Haney, E.B., & Ismagilov, R.F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A., et al. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications., 1218-1220 (2007).
  5. Love, J.C., Ronan, J.L., Grotenbreg, G.M., van der Veen, A.G., & Ploegh, H.L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E.M., et al. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W.S., Kim, H.J., Lucchetta, E.M., Du, W.B., & Ismagilov, R.F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J.Q., Li, L., Kline, T.R., & Ismagilov, R.F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R.T., Page, J.S., Marginean, I., Tang, K., & Smith, R.D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A.J., & Jayasinghe, S.N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
  12. Edd, J.F., et al. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S.L., Bontoux, N., & Stone, H.A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., & Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99 (2007).
  15. Chabert, M. & Viovy, J.L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segré, G. & Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Di Carlo, D., Edd, J., Humphry, K., Stone, H., & Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102 (2009).
  19. Humphry, K.J., Kulkarni, P.M., Weitz, D.A., Morris, J.F., & Stone, H.A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H.A., & Di Carlo, D. Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413-22418 (2010).
  21. Duffy, D.C., McDonald, J.C., Schueller, O.J.A., & Whitesides, G.M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., & Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319, DOI: 10.3791/319 (2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., & Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A.C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., & Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94 (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M.J., Stone, H.A., & Whitesides, G.M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z., et al. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. (2008).
  29. Holt, D.J., Payne, R.J., Chow, W.Y., & Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D.J., Payne, R.J., & Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A.C., Fisher, J.S., Pentoney, S.L., Yang, D.L., & Lee, A.P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J.C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Ask the Author: High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter