Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Norwegian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

,

Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Bioengineering. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 184.73.7.143, User IP: 184.73.7.143, User IP Hex: 3091793807

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

Protocol: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

Protokollene i dette avsnittet beskrive materialer og utstyr som benyttes spesielt for å oppnå de eksperimentelle resultatene som presenteres. Vær oppmerksom på at alternative leverandører for kjemikalier og utstyr kan benyttes.

1. Enhet Fabrikasjon og Soft Litografi

Standard myke litografi teknikker, 21 flere som har vært omtalt i tidligere Jove artiklene ble 22 brukes for å skape Polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel nettverk limt til glasset underlag. Bortsett fra mester replica mugg fabrikasjon av SU-8 fotolitografi, kan prosessene utføres utenfor et rent rom eller rent hette, men støv og partikler bør fortsatt være minimert for å oppnå konsistente resultater.

  1. Lag en mikro-kanal mønster som vist i Figur 1 i AutoCAD (Autodesk Inc.). Ansett en tredjepart produsent (Fineline Imaging Inc.) for å skrive en høy oppløsning (50 000 dpi) transåpenhet maske på Mylar film eller kvarts hvor kanalene er gjennomsiktig på en mørk bakgrunn.
  2. Lag en silisium og SU-8 fotoresist master for replika støping. Kort, spinne SU-8 2050 (MICROCHEM) negativ fotoresist med produsentens anbefalte rpm på en spin-coater å lage en 52 mikrometer tykt lag på en ren 7,5 cm eller 10 cm silisium wafer. Etter myk bake, edge perle fjerning, UV eksponering gjennom en kontakt maske, post-eksponering bake, utvikling og flom eksponering, måle den faktiske tykkelsen på SU-8 lag med en Dektak profilometer (Veeco). Tape master mold på bunnen av en 4 "eller 5" petriskål å forberede PDMS replika støping.
  3. Mix PDMS elastomer base med elastomer herder (Dow Corning) i en 10:1 ratio w / w base til herdemiddel. Hell godt blandet PDMS forløper på silisium mester til å lage en 2-3 mm endelig tykkelse laget. En blanding av 20 g elastomer base med to g herder er tilstrekkelig til å dekke en 4 "diameter overflaten.
  4. Plasser master mugg og PDMS i vakuum eksikkator (Jencons) til de-gass i uherdet PDMS. Bruke en trykkregulator (Cole Parmer), langsomt minske kammeret gage press fra 0 "Hg til -27" Hg over 20 minutter for å unngå overdreven skumming. Forlate enheten i vakuum kammeret ved -27 "Hg i 30 minutter eller til luftbobler forsvinner.
  5. Slipp vakuum og flytte mester mugg og PDMS til et 65 ° C stekeovn (Thermo Scientific) i minst fire timer. Enheten kan stå i ovnen over natten for å bedre herding.
  6. Fjern enheten fra ovnen og la den avkjøles. Skjær forsiktig ut PDMS rundt sirkulære wafer med en presisjon kniv og skrelle ut PDMS. Skjær ut enhet skisse som vist i Figur 1 med en skalpell.
  7. Punch fluidic porter (tre per enhet) i de tre runde regionene vist i figur 1 ved hjelp av en biopsi punch. For denne enheten, bruker du en 0,75 mm ytre diameter punsj (Harris).
  8. Følge Scotch tape til den mønstrede siden av PDMS og skrelle å fjerne eventuellestøv. Som et kostnadsbesparende men levedyktig alternativ til konvensjonelle oksygen plasma apparater, 21,22 plasma behandle den mønstrede siden av PDMS og en ren 3 "x 1" glass objektglass med en håndholdt laboratorium Corona treater (Electro-Technic Products Inc .). 23 Merk at denne enheten skal brukes i en avtrekkshette eller godt ventilert område på grunn av ozon utslipp, og alle klokker og mobiltelefoner bør holdes på minst ti meter unna. Juster koronaen utslipp for å oppnå en stabil korona med minimal gnister. Sakte vinke elektroden ca 1/4 "over hver flate i ca 20 sekunder og deretter straks bringe de behandlede flater i kontakt for å danne en sterk permanent bånd før de PDMS overflater tilbake til sin opprinnelige tilstand.
  9. Plasser enheten på en metallplate, plass i en kjølig ovn, sett ovnen til 120 ° C, og bake over natten for å fullføre liming og å returnere PDMS til sin opprinnelige hydrofob tilstand. 24 I løpet av denne høye temperaturen baking, than glassoverflaten kanalen vil også bli gjort hydrofobe pga avleiring av et tynt hydrofob lag på glasset. Alternativt kan hydrofobe belegg som Aquapel (PPG Industries) injiseres i fluidic portene ved hjelp av en 1 ml sprøyte og en kanyle. Tolv forsiktig, men bestemt injisere Aquapel fulgt av sletting luft inn i fluidic portene uten å bryte PDMS til glass obligasjonslån . Aggressivt gjenta bensinpumpe på alle innløp og utløp porter, mens tørke av overflødig Aquapel for å unngå eventuelle forekomster som kan tette de kanalene upon tørking.

2. Prøvepreparering

  1. Forbered en cellekultur i henhold til etablerte prosedyrer for din valgte celletype. For en bestemt enhet brukt i denne studien, bør 8-15 mikrometer partikler eller celler tilstrekkelig bestille for innkapsling. Mindre eller større celletyper kan kreve endring av dimensjoner fokusere kanalen for å oppnå tilstrekkelig Re s.. For megThOD demonstrasjonsanlegg resultatene vist i denne artikkelen er det 9,9 mikrometer polystyren mikrosfærer (G1000, Thermo Scientific) benyttes som celle surrogater.
  2. Klargjør vandige partikkel eller cellesuspensjon gjennom skånsom blanding. Ved bruk av celler eller polystyren partikler, er konsentrasjonen kontroll avgjørende (se figur 4) for å oppnå ideell bestilt innkapsling. Bruke tidligere data 12 som en guide, beregne ønsket celle eller partikkelkonsentrasjonen basert på bestilte tog avstanden og mikro-kanal størrelse som: en celle eller partikkel per forventede langsgående tog mellomrom ganger fokuserer kanalen tverrsnittsareal. Dersom aksjen konsentrasjon (1% w / w) er utilstrekkelig, øker konsentrasjonen (her til 1,5% w / w) ved forsiktig sentrifugering aksjen prøven, fjerne supernatant væske, og re-suspendere partiklene av Vortex blanding, eller mildere blanding ved bruk av celler. Forbered en tilstrekkelig volum for å redegjøre for ønsket samling volum og for kjøring i forbindelse med flow tuning.
  3. Både celler og polystyren partikler har en egenvekt større enn én. Selv om det ikke påvist i denne protokollen, for langvarige eksperimenter som varer i størrelsesorden mange minutter til timer, oppdrift matche løsningen ved å legge en stoff som CaCl 2 for partikler eller OptiPrep (Sigma-Aldrich) for cellene.
  4. Forbered en 10 mL prøve av kontinuerlig fluorkarbon oljefasen ved å blande fluorkarbon olje FC-40 (3M) og PFPE-PEG blokk kopolymer surfaktant 25 (2,5% w / w) (Raindance Technologies) i en 15 ml sentrifugerør. Alternativt kan lett mineralolje (PTI Prosesskjemikalier) skal utnyttes med ABIL-EM 90 surfactant (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Eksperimentell Setup

  1. Slå på den omvendte optisk mikroskop (Axio Observer, Zeiss) og høy hastighet kamera (Phantom V310, Vision Research). Fokus og inspisere kanaler for tresko og rusk enten manuelt flytte enheten ellerved hjelp av en motorisert mikroskop scene. Noen små rusk kan bli skjøvet ut når væske strømmer gjennom. For store rusk eller åpenbare tresko, velg en annen kanal på enheten som rusk i fokus kanalen kan forringe bestiller kvalitet betraktelig. Merk at tresko kan ofte fjernes i henhold flyt ved å trykke hardt på PDMS overflaten over det berørte området med butte pinsett.
  2. Skjær tre lengder av PVC rør (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) for vandige innløpet, olje inlet og emulsjon outlet. For å minimere døde volum, klippe akkurat nok slange til å komme fra sprøyten pumper til mikroskop scenen. Kutt slangen ender i en 45 graders vinkel for å lette innsetting i fluidic porter.
  3. Bruk pinsett til å trykke passe røret ender inn i fluidic portene slo i trinn 1 og trykk deretter passe to 30 gauge stump-tip rustfrie sprøyte nåler (SmallParts) i de frie endene av respektive vandige og olje rørene (ikke lim nødvendig) . Plasser utløp slangen inn en avfall reservoir. Dette røret vil senere bli flyttet inn i en samling reservoaret.
  4. Flytt enheten og vedlagte slangen til mikroskop scenen, justere og fokusere på enheten munnstykket ved hjelp av en tilgjengelig objektiv (20x ble brukt til dette eksperimentet). Juster for K hler belysning og andre mikroskop innstillinger som kreves for optimal opptak.
  5. Fyll en 1 ml sprøyte (BD) med godt blandet vannfasen og en 3 ml sprøyte (BD) med oljefasen løsning utarbeidet i trinn 2. Merk at eventuelle sprøyter av noe volum kan brukes og bør velges med omhu avhengig av ønsket run ganger og minimering av alle pulsatility. Vipp en sprøyte vertikalt og fingeren for å flytte luftbobler til sprøyten uttaket. Sakte trykke ned stempelet nok til å skyve luften til sprøyten tips. Hold sprøyten vertikalt, kobler sprøyter til de respektive sprøytespissen allerede festet til enheten i trinn 3.3. Trykk stempelet for å tvinge luft gjennom sprøytespissen døde volum inntil væsken er pushed gjennom slangen nesten til enheten. Sikkert montere sprøyten til sprøytepumpe (Nexus 3000, Chemyx) og engasjere stempelet blokken. Gjenta tilkoblinger for andre sprøyten og montere på en andre sprøytepumpe.
  6. Strøm på hver sprøytepumpe og program å bruke pumpen produsentens protokoller. Sett de første strømningshastighetene til Q olje = 50 mL / min og Q AQ = 5 mL / min for oljefasen og vannfasen, henholdsvis. Begynn pumpene.
  7. Vent til hver væske inn i enheten og fylle kanalene, presser ut resterende døde luft. Dette kan ta flere minutter. Hvis det er en stor mengde luft i innløpsslangen, midlertidig øke hver strømningshastighet til luften er utvist. Ikke øke strømningsrater så høy at store presset oppstår i kanalen, kan føre til PDMS-til-glass obligasjon svikt.
  8. Bruke de innledende strømningsrater, observere dannelsen av dråper ved dysen (resultatene vist her: 20x magnification, bildefrekvens 21005 fps, eksponering 3 μs). Reduser kameraet synsfeltet til bare munnstykket å maksimere bildefrekvens og redusere minne om mulig. Fange eksempelvideoer og bekrefter at samplingsfrekvensen er tilstrekkelig for å unngå aliasing.
  9. For å unngå jetting (se figur 2), starter med lave vandige hastigheter. Øk vandige strømningshastigheten å observere bestilling av partikler i lange vandig løsning kanal som flyt øker.
  10. Hvis partikkelkonsentrasjonen er for lav til å gi tog med relativt få "mangler" partikler, og prøven ble ikke oppdrift matchet, fysisk vipper sprøyten pumpen mot sprøyten utløp for å gi gradvis bosetting av partikler mot sprøyten utløp. Denne metoden er demonstrert i videoen protokollen. Med jevne roterende sprøyten langs sin akse kan også redusere uønsket settling.
  11. Når tilstrekkelig bestilling skjer, justere oljestrømmen rate å justere generasjon frekvens ogStørrelsen av dråper. Middelverdien dråpe volum kan beregnes ved hjelp av vandige strømningshastigheten dividert med dråpe generasjon frekvensen målt ved videoopptak. Iterativt justere begge strømningshastigheter for å oppnå ønskede innkapsling priser og slipp volumer.
  12. Når stabil bestilt innkapsling er bekreftet, flytter utløp slangen fra avfallet reservoaret inn i en samling reservoaret eller mate det inn i en annen enhet for senere testing.
  13. Bestem samlingen tiden basert på ønsket antall dråper og beregnet generasjon frekvens.
  14. Noter brøkdel av dråper som inneholder 0, 1, 2, ..., N partikler å kvantifisere effektivitet ved hjelp av enten dropper generasjons video resultater eller ved å pipettere et utvalg av innsamlet emulsjon for inspeksjon.

4. Representative Resultater

Resultatene presenteres som oppnår både kontrollert single-partikkel og kontrollert dobbelt-partikkel innkapsling (figur 3). Ved å kutteFC-40 olje strømningshastighet i to, blir én partikkel innkapsling to-partikkel innkapsling. Motsatt kunne vi ha økt vandige strømningshastigheten å levere partikler til munnstykket raskere, men vi ville også ha økt risiko for spyling av den vandige strømmen. Histogrammer i Figur 3 presentere brøk antall partikler per dråpe for de to sakene, sammen med sammenligninger til Poisson statistikk. Den sporadiske dråpene med null partiklene er hovedsakelig skyldes "manglende" partikler i de bestilte tog, mens de tilfeller der det er mer innkapslede partikler enn ønsket resultat fra lokale høye partikkelkonsentrasjoner og partikler som noen ganger migrere mot en av de to vertikale fokus posisjoner. Merk at oppdrift matchende som beskrevet i punkt 2 ble ikke utnyttet. I stedet ble sprøytepumpe fysisk vippet å tillate bosetting av partikler mot sprøyten uttak, fører til en høy konsentrasjon av partikler under kjøringen.

Figur 4. Uten fullstendig bestilling, er lokaliserte grupper av partikler orden og innkapslet, men mange dråper er uten partikler. Et histogram viser redusert innkapsling effektivitet for ønsket to partikkel innkapsling.

Figur 1
Figur 1. Encapsulation enhet. a) Samlet enhet med inntakene, uttak, og en lang bestilling kanal. Enheten høyde er 52 mikrometer og bestilling kanal bredde er 27 mikrometer. b) Både vandig og olje viker har store rusk filtre med hull på rekkefølgen av bestillingsprosessen kanalbredden for forstørret visning av olje innløpet. c) Den utvidede dysen visningen viser like kanal bredder på 27 mikrometer for vannholdige og olje kanaler, etterfulgt av dysen sammentrekning av 22 mikrometer og plutselig utvidelse til et bredere 61 mikrometer kanal.Vær oppmerksom på at dimensjonene på enheten vises her er verifisert ved hjelp av en profilometer etter microfabrication og avviker noe fra de nominelle dimensjoner på masken. Et sant bilde av bestillingsprosessen kanalen og munnstykke er tilgjengelig på nettet som Supplemental Figur 1 . Den AutoCAD maske Filen har også blitt inkludert på nettet som et supplement til dette manuskriptet.

Figur 2
Figur 2. Hysterese av en dryppende å jetting overgang ved hjelp av en bredere enhet (80 mikrometer brede x 22 mikrometer høy). a) Ved konstant FC-40 strømningshastighet (Q olje = 45 mL / min), oppstår stabilt fall formasjon ved 10 kHz ved hjelp av en vandig vannmengde Q aq = 8 mL / min. Som vandige strømningshastigheten langsomt økes til 10 & mu; L / min, spyling av den vandige væsken stream utløses. b) Når vannmengden blir returnert til 8 mL / min spyling fortsetter. Vær oppmerksom på at stabilt fall formasjon kan bli re-etablert av kort pause i vandige flyt pumpe (en 1 sekund pause er typisk).

Figur 3
Figur 3. Single-og dobbel-partikkel innkapsling. A) Drop formasjon med én celle per dråpe (Q olje = 60 mL / min, Q aq = 9 mL / min) med en dråpe generasjon rate på 6,1 kHz, gjennomsnittlig dråpestørrelse på 24,4 pl, og en encellet fangst effektivitet D k = 79,5% og P k = 83,7% (λ = 0.95) for et utvalg størrelse n d = 517 dråper og n p = 491 partikler. b) Drop formasjon med to celler per dråpe oppnås ved å redusere FC-40 strømningshastighet Q olje til 30 μL / min. De større (39,8 pl) dråper dannes med en hastighet på 3,8 kHz med en to-celle-fangst effektivitet D k = 71,5% og P k = 79,5% (λ = 1,80) for en utvalgsstørrelse på n d = 383 dråper og n p = 689 partikler. cd) To histogrammer sammenligne drop innkapsling partikkelen effektivitet D k av bestilt enkelt-og dobbel-partikkel innkapsling med Poisson statistikk (tilfeldig innkapsling). Merk at for begge tilfeller er partikkel mellomrom i retning av strømmen om 17-18 mikrometer for fullt bestilt, vekslende partikler. Supplerende videoer som viser både single-og dobbelt-partikkel innkapsling er tilgjengelige på nettet. Klikk her for å vise tilleggstekst Movie 3a . Klikk her for å vise tilleggstekst Movie 3b .


Figur 4. Konsentrasjon påvirker sterkt innkapsling effektivitet. A) som konsentrasjonen avtar, ikke fullt bestilling ikke forekomme, og dermed "hull" i tog dukke, etterlot noen dråper med færre enn forventet partikler. B) Histogrammet viser redusert effektivitet ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) for to-partikkel innkapsling skyldes lavere verdi av λ = 1,57 hvor det er nesten like mange single-partikkel faller så er det dobbel-partikkel dråper. Dette tallet resultater fra Q olje = 30 mL / min og Q AQ = 9 mL / min, de samme strømningsforhold som for Figur 3b. En representant supplerende video er tilgjengelig online. Klikk her for å vise Supplemental Movie 4 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

Til tross for relativt høy grad av bestilling, vil ikke alle dråpene inneholder riktig antall partikler eller celler. Innkapsling effektivitet kan beregnes som antall celler eller partikler som blir innkapslet i dråper med ønsket belegget delt av sin totale antallet. Disse rådata kan fås enten fra en automatisert høyhastighets video algoritme eller fra avbildning et utvalg av innsamlet emulsjon. Dette kan sammenlignes med brøkdel av partikler P k innkapslet i en dråpe som inneholder k partikler og brøken av dråper D k som ville inneholde k partikler. Fra Figur 3, både enkle og doble partikkel innkapsling effektivitet utkonkurrere tilfeldige innkapsling effektivitet med over en faktor på to og sterkt redusere antall dråper med mer enn ønsket antall partikler Figur 4 viser behovet for skikkelige konsentrasjoner for høy effektivitet.; det er, og lambd en, en funksjon av både partikkelkonsentrasjonen og slipp volum, skal være lik eller nær antall ønskede celler per dråpe å maksimere riktig-innkapslede partikler eller celler. Merk at en høyere konsentrasjon av partikler eller celler er vanligvis en god ting for full bestilling som tette tog tendens til å spre seg ut over tid og fylle tommere regionene mellom tog. På den annen side, hvis konsentrasjonen er for høy, kan det høye antallet partikler føre grenseflatespenningen ustabilitet som induserer jetting ved munnstykket. I spesifikke studier (som encellet innkapsling, for eksempel), kan det være mer fordelaktig å unngå flere celle dråpene på bekostning av å innføre noen flere tomme dråper, så en litt lavere λ vil være ønsket. Dette vil også gjelde for studier med sikte på interaksjoner mellom to celler eller mellom en celle og en partikkel, hvor én partikkel eller encellet dråpene er mer utholdelig enn dråper med to eller flere av en type celle eller partikkel.

jove_content "> Opprettholde en konstant λ over tid er avgjørende for konsekvent innkapsling. Oppdrift matchende bistår i langsiktig konsentrasjon kontroll ved å redusere bosetting av celler og partikler i sprøyten og slangen. Men oppdrift matchende også resulterer i en høyere vandig viskositet som kan forsinke bestilling (som resulterer i lengre fokus kanal krav), øke kanalen trykkfall, og endre strømningsrater kreves for dråpe generasjon. Et alternativ til oppdrift sammenligning brukt i dette eksperimentet er å fysisk vippe sprøyten pumpen slik at sprøyten uttaket peker nesten loddrett nedover (for å minimere vedheft av celler eller partikler til sprøyten interiør). Her brukte vi 9,9 mikrometer diameter mikrosfærer med en partikkel volum brøkdel av 1,3% (rundt 25 millioner partikler per ml), men vi utnyttet tilting å øke volumet fraksjoner til 2% for de data som vist i Figur 3. Et annet alternativ er å blande den vandige væsken intermittently med en lukket rustfritt stål ball bearing (Teflon belagt for å arbeide med celler) med en liten ekstern magnet. Care kreves imidlertid å unngå å la ballen peiling bosette til sprøyten spissen der det kan occlude inngangen til innløpsslangen. Men disse alternativene er mer arbeidskrevende og mindre repeterbare enn oppdrift matching, så oppdrift søkeord er best egnet for større skala eksperimenter forekommende over lange tidsrammer. Mens treghet bestilling krever høy Re og Re p å operere, snur når den vandige og oljemengder blir presset høyere og høyere, jevn drypper dråper til jetting 14 (se figur 2) og ukontrollerte innkapsling resultater. For celler som er mindre enn de 10 mikrometer partikler som brukes her, kan mindre kanal dimensjoner være nødvendig for å oppnå tilstrekkelig Re p dersom strømningsrater ikke kan økes uten spyling. En eiendommelighet jetting i microfluidic systemer er at hysteresen effekter kan forekomme which gjør det vanskelig å stoppe spyling ved å senke den vandige strømningshastigheten når det oppstår tilbake til et punkt der det ikke ble observert. Basert på eksperimentelle resultater, kan man utvikle en dimensjonal eller ikke-dimensjonale dryppende å jetting flyte kart som de tidligere utviklet for aksiale co-renn dyser 14 og T-kryss 26-28 med ekstra konturer for dråpe generasjon sats, celler per dråpe, og innkapsling effektivitet. Dette kartet vil gi en robust veikart som drop generasjon prisen kan spådd å beregne λ og dermed gi en estimert strømningshastigheten for vann og olje strømmer a priori.

Selv om det ikke direkte påvist her, vil dette medføre ytterligere reduksjoner i olje vannmengde Q olje fra dem presentert i figur 3b ytterligere øke antall partikler per dråpe til tre, fire, og så videre. For å oppnå flere partikler per dråpe, må enten Q olje redusere eller aqueous strømningsrate Q AQ må øke. Som en side, har vi inkludert en online supplerende MATLAB script som modellerer innkapsling effektiviteten fange så mange partikler i dråper. Brukeren innganger gjennomsnittet partikkel avstand og en partikkel avstand standardavvik, som modellerer graden av bestilling. For bestilt tog, vil standardavviket være liten. I tillegg brukeren innganger gjennomsnittlig dråpestørrelse og dråpestørrelsen standardavvik, som står for den polydispersitet av drop-størrelser. Slå opp i dokumentasjonen for for ytterligere informasjon.

Når man øker vandig strømningshastigheten eller redusere oljestrømmen rate å øke antallet partikler eller celler per dråpe, er risikoen for ustabile jetting øker de respektive strømningsrater nær ekstreme verdier. Dermed maksimalt antall oppnåelige partikler / celler per dråpevil avhenge enhet geometri og fluidegenskaper. Gitt den partikkelen / cellekonsentrasjonen og olje strømningshastighet, er antall partikler / celler per dråpe er hemmet av øvre grenser for vandige strømningshastigheter, som må være stor nok til å indusere bestiller, men må være små nok til å unngå ustabil jetting (og grense shear belastninger på celler for å sikre levedyktighet). Alternativt, gitt en vandig strømningsrate der bestilling skjer, må oljen strømningshastigheten forbli tilstrekkelig store nok til å forbli i dryppende regimet.

Merk at dråpe generasjon og dryppende å jetting overgang er svært følsomme for surfaktant konsentrasjon. Høye surfactant konsentrasjoner øke viskositeten på oljen, endre slippe generasjon parametrene. Som en side, presenterer knapphet på allment tilgjengelige biokompatible tensider til fluorkarbon oljer en stor utfordring. For øyeblikket finnes det en kommersiell leverandør (Raindance Technologies) for PFPE-PEG blokk kopolymer tensider, 25 Men studier viser småskala syntese teknikker i en rekke surfactant grupper som PFPE-HEG. 29,30 alternativer som lett mineralolje har blitt brukt i biologisk slippe generasjons applikasjoner tilgang til et bredere spekter av tilgjengelige tensider, 24,31 men merk at den medfølgende økning i viskositet sammenlignet med fluorkarbon olje endrer drop generasjon parametrene. En fersk gjennomgang 32 beskriver et stort antall publiserte kontinuerlig fase oljer og tensider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

JE er en oppfinner på en ventende patent basert på teknologien benyttes i dette manuskriptet.

Acknowledgements: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

Vi takker Raindance Technologies for utvalget av PFPE-PEG surfactant utnyttet i denne studien, og vi takker den BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, direktør) for silisium wafer mugg brukt til å lage PDMS kanal kopier.

Materials: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

References: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

  1. Zagnoni, M., Le Lain, G., & Cooper, J.M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X.Z., Gielen, F., Edel, J.B., & deMello, A.J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M.E., Liu, W., Haney, E.B., & Ismagilov, R.F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A., et al. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications., 1218-1220 (2007).
  5. Love, J.C., Ronan, J.L., Grotenbreg, G.M., van der Veen, A.G., & Ploegh, H.L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E.M., et al. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W.S., Kim, H.J., Lucchetta, E.M., Du, W.B., & Ismagilov, R.F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J.Q., Li, L., Kline, T.R., & Ismagilov, R.F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R.T., Page, J.S., Marginean, I., Tang, K., & Smith, R.D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A.J., & Jayasinghe, S.N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
  12. Edd, J.F., et al. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S.L., Bontoux, N., & Stone, H.A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., & Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99 (2007).
  15. Chabert, M. & Viovy, J.L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segré, G. & Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Di Carlo, D., Edd, J., Humphry, K., Stone, H., & Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102 (2009).
  19. Humphry, K.J., Kulkarni, P.M., Weitz, D.A., Morris, J.F., & Stone, H.A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H.A., & Di Carlo, D. Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413-22418 (2010).
  21. Duffy, D.C., McDonald, J.C., Schueller, O.J.A., & Whitesides, G.M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., & Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319, DOI: 10.3791/319 (2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., & Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A.C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., & Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94 (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M.J., Stone, H.A., & Whitesides, G.M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z., et al. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. (2008).
  29. Holt, D.J., Payne, R.J., Chow, W.Y., & Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D.J., Payne, R.J., & Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A.C., Fisher, J.S., Pentoney, S.L., Yang, D.L., & Lee, A.P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J.C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Ask the Author: Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter