ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

1。ノーマルCNSからミクログリアの分離

修正³で以前に説明したようにミクログリアの分離が実行されます。

1. はさみ、ピンセット、27グラム針、15ミリリットルダウンスホモジナイザー（テフロン/ガラス）、40μmのナイロンセルストレーナー、40％、70％パーコール溶液、1×PBSで10mlの注射器：解剖と血流のために楽器を準備します。
2. CO ₂カメラの迅速な窒息（酸素の欠乏）によりマウスを安楽死させるとすぐに手術操作と灌流のために実験室のベンチに転送します。
3. 外科的操作（防腐剤としてはさみや鉗子、70％エタノールを使用）を実行：オープン腹腔を、ハサミで右心房横隔膜、開いている胸腔とスニップを切った。
4. 左心室に10 mlの注射器を注入し、圧力をかけて全身心臓内灌流を行います。ゆっくりと着実なPAの血液循環を介して1X PBSの8-10 mlを渡すCE。
5. 繰り返しは、グループ内のすべてのマウス（通常、5〜10匹）のために1.2から1.4を繰り返します。すべてのマウスが灌流されるまで灌流後氷の上でマウスを保持します。
6. すべてのマウスの灌流後、脳と脊髄を分析。 （オプション：脳の異なる領域におけるmiRNAの発現を研究するために、このような小脳、5-10マウスと​​均質化のために一緒にプールしてのグループの海馬などのこれらの特定の領域を分析する）。
7. 15 mlのダウンスホモジナイザーを用いて脳や脊髄をホモジナイズする。ホモジナイザーの1つの脳一脊髄を配置し、1X PBS 5 mlを加える。 10月20日穏やかなストライキを行う。大きな遠心5-7分2000回転で50ミリリットル、コニカルチューブと証明書にセルストレーナーを通してホモジネートを渡します。
8. 70％パーコール40％パーコールのオーバーレイ7ミリリットル5-7 mlの2月3日のマウスからの上清を、再懸濁し、脳/脊髄ホモジネートを破棄します。 30分間2000rpmで（ブレーキなし！）で回転。
9. 70％の上に損傷した細胞/ミエリン破片を捨てて、モノを収集する40％/ 70％界面で核細胞。少なくとも5-7分2000回転で1×PBSとスピンと1:1で採取した細胞を希釈します。 PBS 0.5 mlに細胞を再懸濁し、1.7ミリリットルependorfチューブに移す。典型的な収率は、脳と2-3マウスの脊髄由来の細胞の調製のためにミクログリア細胞の数〜0.5 mlの^{1×10 6を}与えるだろうマウス当たりの単核細胞、の〜500×10 ³である。

2。フローサイトメトリーによるミクログリアの純度の制御

以前に変更^7,8で説明したように抗体を用いた染色が行われます。

1. PE、抗CD45-APC-Cy7抗体、PBS中の1％パラホルムアルデヒド^- FACSバッファー（2％FBSを含む1X PBS）、FcRブロッキング抗体、抗CD11bを準備します。
2. ステップ1.9から細胞の50μlを取り、新しい1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにそれらを転送し、FACS緩衝液350μlを加える。
3. 抗FcRを抗体とインキュベート10月15日の5〜10μlを加え氷の上で数分。
4. 2エッペンドルフチュー​​ブに細胞を分割します。抗CD11bのいずれかのチューブを1μlに追加^- PEと2μlの抗CD45-APC-Cy7抗体と氷上で10-15分インキュベートします。第二の管は、抗体染色のためのネガティブコントロールとして使用されます。抗体とのインキュベーション後に5分間5400 rpmで小型遠心機でチューブとスピンの両方にFACS緩衝液1 mlを加える。スピンした後PBSとボルテックスで1％パラホルムアルデヒド400μlのでそれらを再懸濁することにより細胞を固定します。
5. ^8を説明したように補正コントロール用BD compubeads（BD Biosciences）を用いてフローサイトメーター上でフローサイトメトリー分析（LSR II、BD Biosciences）を実行します。良い面と悪い面の製剤の例は、 図に示されています。 1A、B。

3。神経炎症のマウスモデルにおける炎症CNSからミクログリアおよび末梢マクロファージの単離

以前に説明したように実験的自己免疫性脳炎（EAE）を誘導される我々の論文⁷で、FACSソーティングが公開プロトコル⁸と同様に実行されます。

1. 150 mgのは、8から12週齢のC57BL / 6マウスの5-10のグループの4 mg / mlの完全フロイントアジュバント（CFA）で_35から55のペプチドをモグに皮下免疫してEAEを誘導する。百日咳毒素は、ポスト予防接種、日数はゼロと二日目でip（150 ngの/マウス）を与えられるべきである。マウスは10日後の予防接種に始まる疾患の徴候を観察し、次のように、疾患の重症度を0-5から数値の​​スケールで採点されていない：0）が病気、1）弱尾または不安定な歩行、2）後肢の不全麻痺を。 3）後肢の麻痺、4）後肢と前肢麻痺、5）死亡または人道的理由により安楽死。病気のピーク時にはマウス（D21ポスト予防接種）を1.5から2.5までの典型的な疾患スコアを使って実験するために使用されます。
2. ステップ1.1から1.4のように5月10日マウスのグループの中枢神経系から単核球を分離し、ステップ2.1から2.4のように抗CD11bおよび抗CD45抗体で細胞を染色。ステップ2.4​​で細胞を固定していない代わりに、1X PBSの代わりに1％パラホルムアルデヒド400μlの再懸濁します。
3. "将来的に我々は、これらのセルを参照する。細胞選別は⁺ CD45 ^ハイテク細胞（そのうちの約80％は末梢マクロファージであり、それらの〜20％がミクログリア^3を活性化されるCD11bを⁺ CD45 ^低ミクログリアおよびCD11bの集団をFACSAriaによって実行されますマクロファージ "）。サンプルの収集のために1.7 mlのependorfチューブを使用しています。 10％FBSとの1X PBS300μlをソートした細胞の損傷を防ぐために、コレクションチューブに追加する必要があります。 3ミクログリアの集団、マクロファージ、リンパ球の例は、 図に示されています。図に示すように、適切なソートゲートの設定と2A。図2b。ソートされたミクログリアの集団（ 図2c）およびマクロファージ（ 図2D）を再分析によって決定される典型的な選別純度は98から100パーセントであった。典型的な収率は、ミクログリアのために20から50×10 ³であり、5匹のマウスの群から分離したマクロファージが50〜100×10 ^3。

4。 RNAの分離

RNAは、修正を加えた製造業者の指示に従ってmirVanaキットを用いて単離することになります。

1. ステップ1.9または小型遠心機で5〜7分間5400 rpmで1.7 mlのエッペンドルフチュー​​ブにステップ3.3からミクログリアやマクロファージのソートされたサブセットから正常な中枢神経系からスピンミクログリアは、慎重に上清を捨て、ドライアイス上で細胞ペレットを凍結する。 4.2をステップ実行したり、それが2-3ヶ月保存できます-70℃に凍結細胞ペレットを転送するために進んでください。
2. 解凍のために定期的な氷に凍結細胞ペレットを転送します。 mirVanaキットから溶解バッファー300μlを加え、穏やかに5〜7倍のピペッティングにより混和します。
3. 、ミックスを氷上で10分間維持するmirVanaキット、ボルテックス30秒からホモジネート添加の30μLを加える
4. mirVanaキットからクロロホルム、ボルテックス30秒、5メートルのスピン：酸Pehnol 300μlの小型遠心機で10,000 rpmでインチ
5. 慎重に上部の水相（300μl）を取り、別の1.7ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに、100％エタノール375μlのミックスに移し、10,000 rpmで1分間mirVanaキットとスピンからカートリッジをフィルタリングするために転送します。
6. フロースルーバッファを破棄し、10,000 rpmで1分間700 mirVanaキットから洗浄液の液I、スピンを追加します。
7. mirVanaキットから洗浄溶液IIを500μlで2回以上洗浄し、最終的に予熱したヌクレアーゼフリー水60μlをカートリッジからRNAを溶出します。
8. RNAの量と質は、光度計、分光光度計を用いて評価されています。 RNAの濃度は5〜20 ng / mlおよび1.7から2.0の範囲内でODλ260/λ280比からでなければなりません。 RNAの濃度が3 ng / mlおよびOD260λ/280λが1.6より低い場合よりも低い場合、サンプルは破棄されます。 RNAサンプルは6-12ヶ月間-70℃で保存することができます。
9. RNAの品質の一層の推定は、サンプルARの電子は15％TBE-尿素ゲル（Life Technologies）を、ゲル電気泳動を用いて分析した。 RNA調製の良い点、悪い品質の典型的な例は、 図に示されています。それぞれ図3aおよび図3b、。

5。ミクログリアとマクロファージにおけるmiRNAの検出

miRNA発現の分析のために、リアルタイム定量的逆転写PCR（定量RT-PCR）分析は、プライマーと関心と偏在的に発現する短いRNA（例えば、snoRNA-55、snoRNAのいずれかの特定のマイクロRNAの蛍光プローブを用いてTaqManアッセイを用いて実施される正規化のための-135またはU6）。プライマーおよびヒトまたはマウスmiRNAの特定のセットのための蛍光プローブは、ライフ·テクノロジーズ·インクから購入することができますここでは、正規化の例として、興味やsnoRNA-55のmiRNAの例としてのmiR-124を使用します。

1. のTaqMan逆転写キットを使用して、RNAサンプルからcDNAを作る転写酵素反応を逆に実行します。

濃度3 ng /μlにするRNAサンプルを希釈する。 RT酵素ミックスを調製し、PCRチューブに3.33μLを入れ、RNAサンプルの1.67μlを追加します。 16°Cで、PCR装置（BioRad社）でインキュベート30分、42℃で30分間、85℃で5分間、4℃に設定、保留中のCのCの。

2. TaqMan PCR法ミックスを使用してリアルタイムPCR反応を行います。

各反応とリアルタイムPCR装置AB 7900 HT用384ウェルクリア光反応プレート（Life Technologies社）を使用します。サイクリング条件：95℃で10分間、[95℃で5秒、60℃で60秒C]×40サイクル。

3. 蛍光量の典型的な曲線rescentlyミクログリアと骨髄由来マクロファージ（BMDMs）対サイクル数（x軸）から単離したRNAサンプル（各サンプルは重複である）のsnoRNA-55とmiR-124の特異的なPCR産物（y軸）標識された図に示す。 4A、B。

6。正規化とデータ解析

興味のあるmiRNAの相対的発現レベルは、（MIR-124）RNAの初期量の正規化のためにsnoRNA-55を使用して、前述の^7,9のようにΔΔCT法を用いて計算されます。

1. ミクログリアとBMDMs用のmiR-124発現の相対レベルの計算例を表Iに示しています。
2. 最初のステップとして、snoRNA-55とmiR-124のCt値は、定量RT-PCR曲線からミクログリアとBMDMsに決定される（図4、 表I、カラム：snoRNA-55とmiR-124）。
3. 第二段階として、ΔCt値のmiR-124（実験）（：CT（ノーム）、CT（紙ジャケット仕様）、およびΔCt表I、列）のCTからsnoRNA-55（正規化）のCtの減算によって、各サンプルの各重複のために計算されます。
4. 第三段階として。 ΔΔCTの値は他のサンプルのΔCt値（：ΔΔCT 表I、カラム）から参照サンプルのΔCtの減算（ΔCt（参考））によって計算されます。つのサンプルを基準として定義されています。このサンプルのmiRNA発現の相対レベルは、1.0として定義されます。他のすべてのサンプルは、この基準サンプルと比較されます。私たちのケースでは、ΔCt（参考）= 0.49（ 表I、最初の行に、赤色でマークされている）ので、1.0とミクログリアの最初のサンプルでのmiR-124のレベルを定義します。
5. のmiR-124 E：最後に、発現の相対レベルは^2-ΔΔCT（ 表I、列のように計算されます。xpression）。
6. すべての定量RT-PCRには3連でまたは重複で実行され、 図に示すように、発現の相対レベルは、側で三連の平均±標準偏差（SD）（ 図5A、B）として、またはその両方を重複側として提示されます。 5C。

7。代表的な結果

リアルタイムPCRとのCT値のmiR-124のために（目的のマイクロRNA）とsnoRNA-55（正規化）と同様のmiR-124の発現の相対レベルの典型的な曲線は、 図に示されています。 4および表私は我々の実験では、正規化のためのコントロールとしてsnoRNA-55を使用していました。我々は上述したように、他のユビキタスRNAはまた、snoRNA-135とU6として正規化に使用することができます。

大人のミクログリア対骨髄由来のマクロファージ（BMDMs）でのmiR-124の発現の例は図に示されています。 5A（BMDMsがpresencで増殖させたM-CSFの電子は^、7を参照）。 図。 5bは 、我々はCD45 ^低ミクログリア対CD45 ^ハイテクマクロファージのソートされた集団でのmiR-124の発現を比較した。これらの実験の両方で、我々はミクログリアは、miR-124のより高いレベルを発現させることにより、他のマクロファージからの異なっていることを実証した。同様の実験は、in vivoまたは in vitro でミクログリア活性化の動力学のために将来的に行うことができます。

開発の各段階でC57BL / 6マウスの中枢神経系から単離したミクログリアでのmiR-124の発現は、 図に示されています。 5C。このデータは、その活性化表現型⁷との相関のmiR-124の開発エクスプレス下位レベルの初期段階でそのミクログリアを示しています。小脳、S：同様の分析は、CNSのさまざまな領域から分離されたミクログリア内の特定のmiRNAの発現の比較として通常のCNSにおけるミクログリアの機能を研究するために実行することができますピナルコード、海馬など

図1。フローサイトメトリーによって決定されるミクログリアの良い面と悪い面の製剤の例としては、通常のCNS ​​からミクログリアの"良い"分離の場合には、細胞の95から98パーセントは、CD11bをの2-5％とCD11bを⁺ CD45 ^低 microglaを表します⁺ CD45 ^ハイテク血管周囲マクロファージ。 CD11bを1％未満^- CD45 ^{こんにちはリンパ}球またはCD11bを^- CD45 ^-アストログリアやオリゴデンドログリア細胞または細胞フラグメント（）は存在する必要があります。 "悪い"製剤の場合はここに示されています（b）のCD11bを汚染する場所18％ ^- CD45 ^-細胞が存在している（B、左下の象限）が不足しPercoll勾配分離を示唆している。良い準備の場合には、細胞の95から98パーセントは、CD11bを⁺ CD45を表す必要があります^低ミクログリア（左上象限）、すべての細胞の2-5％が（右上の象限）CD11bを⁺ CD45 ^ハイテク血管周囲マクロファージを表すべきであり、すべての細胞の1％未満では、CD11bを負の混入細胞（、表すべき）左の象限を下げます。 "悪いの準備"の場合、CD11bを、かなりの汚染^- CD45 ^-細胞または細胞断片（アストログリア、ミエリンの粒子など）のRNAの分離、さらには適さない細胞の調製をなす、（B、左下の象限）が存在する分析。さらに、CD11bを^- CD45 ^ハイテク細胞^は不十分な灌流に起因する血リンパ球による汚染を示す"悪いの準備"（A、B、右下の象限）の場合にも存在するかもしれません。

図2。フローサイトメトリーanalysisと病気のCNS ​​からミクログリアおよび末梢マクロファージの集団のソート（）細胞の3つの集団は、中枢神経系に存在する神経炎症時：CD11bを⁺ CD45 ^低 （ ミクログリア）、CD11bを⁺ CD45 ^HI（マクロファージ ）、 および CD11b ^- 、CD45。として、それぞれ左上、右上と右下の象限に示すように^、HI（リンパ球 ）、。 CD11bを集団をソートするためのゲイツ⁺ CD45 ^低ミクログリアおよびCD11b ⁺ CD45 ^{こんにちは}マクロファージに示されている（b）は、再測定ソートされた集団の純度は、（C、D）に示されています。 FSC / SSCのパラメータに基づいて、生細胞の予備ゲートが実装されています。

図3。 "良い"と"悪い"な高いレベルの例ミクログリアから単離され、ゲル電気泳動により分析したRNAのIEは、良い品質の場合には、RNAラダーとリボソームRNA（）は明らかである。品質が悪い、汚れ、および低分子量の分解生成物の場合には（b）は明らかである。

図4。蛍光標識されたのmiR-124とsnoRNA-55 PCR産物のためのリアルタイム定量RT-PCR曲線 snoRNA-55（）およびmiR-124（b）の曲線は、ミクログリアと骨髄由来のマクロファージ（BMDMs）に示されています。実験は、重複で行われた。に示すように、Ct値は、定量RT-PCR曲線の直線範囲の下部のベースラインの交点によって決定した（b）の拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

のmiR-124（興味のあるマイクロRNA）とsnoRNA-55（正規化のための制御）のためのC _T値ベースのミクログリア対骨髄由来マクロファージでのmiR-124発現の相対レベルの表I.計算。

図5。ミクログリアとマクロファージにmiR-124発現の解析。通常のCNS ​​対骨髄由来マクロファージ（BMDMs）からミクログリアでのmiR-124発現の比較は（a）に示されています。ミクログリア対神経炎症を持つマウスでの中枢神経系から単離した末梢マクロファージでのmiR-124の比較は、（b）に示されています。の変化成体マウス（8週齢時）に比べて1歳、2、4週間のマウスの開発時にミクログリアでのmiR-124の発現レベルは、（c）に示されています。には、（a、b）の実験は、平均で三連で行われた±3つの別々のPCR反応のSDが示すように。示されているように（c）の実験は、重複で行われた。

最近大きな関心は、ミクログリアと神経炎症および神経変性に関連する多くの病態におけるこれらの細胞の関与に与えられた。さらに、免疫やがん細胞の分化におけるマイクロRNAの役割は劇的に過去数年間^5,10を介して成長してきました。我々は以前通常のCNS ​​におけるミクログリアの非活性化または休止表現型の維持⁷でのmiR-124の役割を報告しているが、ミクログリアの表現型と活性化状態におけるマイクロRNAの他の種類の役割が発見されていない。これは、ミクログリアに特異的miRNA発現を測定するための新しい方法の開発が必要になります。

ミクログリアは、CNSからの分離後、活性化し、大幅に変更になるので、実験で扱うために困難な細胞である。通常のCNS ​​からミクログリアの分離のためのプロトコルは、以前^11,12を公開^しました。ただし、これらのプロトコルcouldは、RNAの分離に有用である、我々は、これらのプロトコルは、mRNAの発現のためにではなく、microRNA発現の評価に適していると信じています。まず、多くの研究者は、microRNA発現の重要な変更にミクログリアと結果を有効に均質化された組織または磁気ビーズ精製の酵素消化を（観測を公表していません）を使用します。第二に、著者らは、特にFACSによりCNSからソートされ、それらの集団のために、ミクログリア細胞の少数のマイクロRNA解析のための最適ではありませんRNA分離¹¹のトリゾールベースのメソッドを使用しています。ここでは、CNSからミクログリアの分離時に最小限の操作で迅速かつ単純なプロトコルを提示します。このメソッドは、少数の細胞からのRNAの効率的な分離のための技術と組み合わせて自発的活性化の最小レベルとミクログリアの純粋な集団の受信を可能にします。さらに、我々は、特に濃縮されたRNAの分離のためのプロトコルを使用短い非コードRNAとマイクロRNAである。

孤立したミクログリアの純度に加えて、RNAの品質が適切であることを確認することも重要です。 Percoll勾配上でミクログリアの適切な分離せずに結果がミクログリアでmiRNAプロファイリングになるだろうことは困難に解釈するだけでなく、高濃度のためにむしろ大幅にRNAの品質を低下させるミエリンの破片を持つRNAサンプルの汚染であり、核酸、タンパク質、およびミエリン粒子の脂質。

ミクログリアでのmiRNAの発現を測定するのに我々は上述したように、かなりの難しさは、マウスの大規模なグループ（10以上）からも得られたRNAの細胞と少量の数が少ないです。 singleplex定量RT-PCRを用いたというよりも感度マルチプレックスPCRアッセイまたは配列それを使用して、したがって我々は10から30マイクロRNAの短いリストを作るお勧めしますと1つのそれぞれの発現のレベルで個別に見てRNAのかなり高い金額が必要になります。我々が説明されているようsingleplex定量RT-PCRによって、いくつかのマイクロRNAの発現を評価した後、他の大規模なmiRNAプロファイリングメソッドは、その慎重に検証した後に使用することができます。最近では、潜在的にミクログリアの大規模なmicroRNAの発現プロファイリングのために採用することができるマイクロ流体プラットフォーム¹³上にマイクロRNAの多重解析のためのより敏感な方法について報告がありました。