Påvisning av MicroRNAs i microglia av Real-time PCR i Normale CNS og under Neuroinflammation

1. Isolering av microglia fra Normal CNS

Isolering av microglia utføres som beskrevet tidligere med modifikasjoner ^tre.

1. Forbered instrumenter for disseksjon og perfusjon: sakser, pinsetter, 10 ml sprøyte med 27g nål, 15 ml Dounce homogenizer (Teflon / glass), 40 mikrometer nylon celle sil, 40% og 70% Percoll løsninger, 1X PBS.
2. Avlive mus ved rask kvelning (berøvelse av oksygen) i CO ₂ kamera og umiddelbart overføre dem til laboratoriet for kirurgiske manipulasjoner og perfusjon.
3. Utfør kirurgiske manipulasjoner (bruke saks og pinsett og 70% etanol som et antiseptisk): Åpen bukhulen, kutte mellomgulvet, åpne brysthulen og klipp høyre atrium med saks.
4. Utfør hele kroppen intracardial perfusjon ved å injisere 10 ml sprøyte inn i venstre hjertekammer og settes under trykk. Pass 8-10 ml 1X PBS gjennom blodsirkulasjonen ved langsom og jevn pace.
5. Gjenta trinn 01.02 til 01.04 for alle mus i gruppen (vanligvis 5-10 mus). Etter perfusjon holde mus på is inntil alle mus perfused.
6. Etter perfusjon av alle mus, dissekere hjerner og ryggmargen. (Valgfritt: å studere uttrykket av miRNAs i ulike områder av hjernen, dissekere disse spesifikke områder som lillehjernen, hippocampus etc. for gruppen av 5-10 mus og basseng dem sammen for homogenisering).
7. Homogenisere hjerner og ryggmargen med 15-ml Dounce homogenizer. Plasser en hjerne og en ryggmarg i homogenizer og tilsett 5 ml 1X PBS. Utfør 10-20 milde streik; passere homogenat gjennom celle sil i 50 ml-konisk rør og sertifikat på 2000 rpm på en stor sentrifuger 5-7 minutter.
8. Kast supernatant, resuspender hjerne / ryggmarg homogenat fra 2-3 mus i 5-7 ml av 70% Percoll og overlay 7 ml 40% Percoll. Snurr på 2000 rpm (ingen brems!) I 30 minutter.
9. Kast ødelagte celler / myelin rusk på en topp på 70% og samle mononukleære celler på 40% / 70% grensesnitt. Fortynn samlet celler på minst 1:1 med 1X PBS og snurrer på 2000 rpm for 5-7 minutter. Resuspender celler i 0,5 ml PBS og overføre dem til 1,7 ml ependorf tube. Typisk avkastning er ~ 500 x 10 ³ av mononukleære celler per mus, noe som ville gi antall microglial celler ~ 1x10 ⁶ i 0,5 ml for utarbeidelsen av celler fra hjernen og ryggmargen av 2-3 mus.

2. Kontroll av renhet microglia med flowcytometri

Farging med antistoffer utføres som tidligere beskrevet med modifikasjoner ^7,8.

1. Forbered FACS buffer (1X PBS med 2% FBS), FCR blokkerende antistoffer, anti-CD11b ^- PE, anti-CD45-APC-Cy7 antistoffer, 1% paraformaldehyde i PBS.
2. Ta 50 mL av cellene fra trinn 1,9 og overføre dem til nye 1,7 ml Eppendorf rør og tilsett 350 mL av FACS buffer.
3. Legg 5-10 mL av anti-FCR antistoffer og inkuber 10-15minutter på isen.
4. Dele celler i to Eppendorf-rør. Legg til en tube en mL av anti-CD11b ^- PE og 2 mL anti-CD45-APC-Cy7 antistoffer og inkuber 10-15 minutter på isen. Second tube vil bli brukt som en negativ kontroll for antistoff farging. Etter inkubering med antistoffer legge til 1 ml FACS buffer til både rør og sentrifuger i små sentrifuger ved 5400 rpm i 5 min. Etter spinningen fikse cellene ved resuspending dem i 400 mL av 1% paraformaldehyde i PBS og virvling.
5. Utføre flowcytometri analyse på flowcytometeret (LSR II, BD Biosciences) med BD compubeads (BD Biosciences) for kompensasjon kontroller som ble beskrevet ^åtte. Eksempler på gode og dårlige forberedelser er vist i fig. 1a, b.

3. Isolering av microglia og perifere Makrofager fra Betente CNS i mus modell av Neuroinflammation

Eksperimentell autoimmun encefalitt (EAE) er indusert som tidligere ble beskreveti vår papir ^7; FACS sortering utføres på samme måte som publiseres protokoll ^8.

1. Fremkall EAE ved subkutan vaksinering med 150 mg Mog _35-55 peptid i 4 mg / ml komplett Freund sin adjuvans (CFA) av gruppe 5-10 av 8-12-ukers gamle C57BL / 6 mus. Kikhoste toksinet bør gis ip (150 ng / mus) på dag null og to per dag, etter immunisering. Mus er observeres for tegn på sykdom som starter på dag 10 etter vaksinasjon, og sykdommens alvorlighetsgrad er scoret på en numerisk skala 0-5 som følger: 0) ingen sykdom; 1) svak hale eller ustø gange, 2) hind lem pareser; 3) hind lem lammelse, 4) hind og forbena lammelse, og 5) død eller avlivning på grunn av humane grunner. Mus på toppen av sykdommen (D21 post-immunisering) brukes for eksperimentet med typisk sykdom Resultat alt 1,5 til 2,5.
2. Isoler mononukleære celler fra CNS i gruppe 5-10 mus som i trinn 1.1-1.4 og beis cellene med anti-CD11b og anti-CD45 antistoff som i trinn 2.1-2.4.I trinn 2.4 ikke fikse cellene, i stedet resuspender dem i 400 mL av 1X PBS i stedet for 1% paraformaldehyde.
3. Cell sortering utføres av FACSAria for bestander av CD11b ⁺ CD45 ^lav microglia og CD11b ⁺ CD45 ^hi celler (~ 80% av dem er perifere makrofager og ~ 20% av dem er aktivert microglia ^3; i fremtiden vil vi referere disse cellene som " makrofager "). Bruk 1,7 ml ependorf rør for oppsamling av prøvene. 300 mL av 1X PBS med 10% FBS bør legges til samling rør for å unngå skade av de sorterte cellene. Eksempler på tre bestander av microglia, makrofager og lymfocytter er vist i fig. 2a med riktige sortering gate innstillinger vist i fig. 2b. Typiske sortering renhet var på 98-100%, målt ved analysere på nytt sortert bestander av microglia (Fig. 2c) og makrofager (Fig. 2d). Typisk avkastning er 20-50 x10 ³ for microglia og50-100 x10 ³ for makrofager isolert fra gruppen av fem mus.

4. Isolering av RNA

RNA vil bli isolert ved hjelp av Mirvana settet i henhold til produsentens anvisninger med modifikasjoner.

1. Spinn microglia fra normale CNS fra trinn 1,9 eller sortert undergrupper av microglia og makrofager fra trinn 3,3 i 1,7 ml Eppendorf-rør på 5400 rpm i 5-7 minutter i små sentrifuger, forsiktig kast supernatanten og frys cellen pellets på tørris. Gå videre til trinn 4.2 eller overføre frosne celle pellets til -70 C, hvor det kan lagres i 2-3 måneder.
2. Overfør frosne celle pellets til vanlig is for tining. Legg 300 mL av Lysis buffer fra Mirvana kit og forsiktig bland med pipeting 5-7 ganger.
3. Tilsett 30 mL av homogenat Additive fra Mirvana kit, vortex 30 sekunder å blande, holde på is i 10 minutter
4. Legg 300 mL av Acid-Pehnol: kloroform fra Mirvana kit, vortex 30 sekunder, spinn for 5 minn på 10 000 rpm på små sentrifuger.
5. Nøye ta øvre vannfasen (300 mL) og overføre til en annen 1,7 ml Eppendorf rør, bland med 375 mL av 100% etanol, overføre til filteret fra Mirvana kit og spinn i 1 min ved 10 000 rpm.
6. Kast gjennomstrømning buffer, tilsett 700 mL av Wash løsningen jeg fra Mirvana kit, og spinn i 1 min ved 10 000 rpm.
7. Vask to ganger med 500 mL av vaskeløsning II fra Mirvana kit og til slutt Eluer RNA fra patron med 60 mL av forvarmet nukleasefritt vann.
8. Mengden og kvaliteten på RNA vurderes ved hjelp Nanodrop spektrofotometer. Konsentrasjonen av RNA bør være 5-20 ng / ml og OD λ260 / λ280 ratio innenfor området 1,7 til 2,0. Hvis konsentrasjonen av RNA er lavere enn 3 ng / ml og OD 260λ/280λ er lavere enn 1,6, er prøvene forkastet. RNA prøver kan oppbevares ved -70 ° C i 6-12 måneder.
9. For ytterligere estimering av kvaliteten på RNA, prøvene are analyseres ved hjelp av elektroforese i 15% TBE-Urea Gel (Life Technologies). Typiske eksempler på god og dårlig kvalitet på RNA preparater er vist i fig. 3a og Fig.3b, henholdsvis.

5. Påvisning av miRNA i microglia og Makrofager

For analyse av miRNA uttrykk, real-time kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR) analyser utføres med TaqMan analyser med primere og fluorescerende prober for spesiell mikroRNA av interesse og en av de overalt uttrykt korte RNA (f.eks snoRNA-55, snoRNA -135 eller U6) for normalisering. Primere og fluorescerende prober for bestemte menneske eller mus miRNA kan kjøpes fra Life Technologies Inc. Her vil vi bruke Mir-124 som et eksempel for miRNA av interesse og snoRNA-55 som et eksempel for normalisering.

1. Utfør reverstranskriptase reaksjon å lage cDNA fra RNA prøver ved hjelp TaqMan revers transkripsjon kit:

Fortynn RNA prøver å konsentrasjon 3 ng / mL. Forbered RT Enzyme Mix og satte 3,33 mL til PCR-rør og legge 1,67 mL av RNA prøven. Inkuber i PCR Instrument (BioRad) ved 16 ° Ci 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 min, og innstilt på 4 ° C på vent.

2. Utfør real-time PCR reaksjonen ved hjelp TaqMan PCR mix:

Bruk en 384-godt klar optisk reaksjonsplaten (Life Technologies) for hver reaksjon og real-time PCR instrument AB 7900 HT. Sykkelforholdene: 95 ° C i 10 min, [95 ° C i 5 sek, 60 ° C i 60 sek] x 40 sykluser.

3. Typiske kurver for mengden Fluorescently merket spesifikke PCR-produkter (y-aksen) for snoRNA-55 og Mir-124 for RNA prøver (hver prøve er i duplikater) isolert fra microglia og benmarg avledet makrofager (BMDMs) vs antall sykluser (x-akser) er vist i fig. 4a, b.

6. Normalisering og dataanalyse

Relative uttrykk nivåer for miRNA av interesse (Mir-124) beregnes etter ΔΔCT metoden som tidligere beskrevet ^7,9 hjelp snoRNA-55 for normalisering av den opprinnelige mengden RNA.

1. Eksempelet for beregning av den relative nivået av Mir-124 uttrykk for microglia og BMDMs er vist i tabell.
2. Som et første skritt, er Ct-verdier for snoRNA-55 og Mir-124 bestemmes for microglia og BMDMs fra QRT-PCR kurver (Fig.4, tabell, kolonner: snoRNA-55 og Mir-124).
3. Som en andre trinn, ΔCt verdierberegnes for hver kopi av hver prøve ved subtraksjon av CT for snoRNA-55 (normalisering) fra CT for Mir-124 (eksperiment) (tabell I, kolonner: CT (Norm), CT (Exp), og ΔCt).
4. Som et tredje trinn. ΔΔCt verdiene beregnes ved subtraksjon av ΔCt av referansen prøven (ΔCt (Ref)) fra ΔCt verdier av andre prøvene (tabell I, kolonne: ΔΔCt). En prøve er definert som en referanse, det relative nivået på miRNA uttrykk for denne prøven vil bli definert som 1,0. Alle andre prøver vil bli sammenlignet med denne referansen prøven. I vårt tilfelle, definerer vi nivået av Mir-124 i den første prøven for microglia som 1,0, derfor ΔCt (Ref) = 0,49 (tabell I, første rad, markert med rødt).
5. Endelig er den relative nivået på uttrykket beregnes som ^2-ΔΔCt (tabell I, kolonne: Mir-124 expression).
6. Alle QRT-PCRs utføres i triplicates eller i duplikater, og den relative nivået av uttrykk presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) for triplicates (Fig. 5a, b) eller som begge duplikater ved siden av hverandre som vist i fig. 5c.

7. Representative Resultater

Typiske kurver for real-time PCR og CT verdier for Mir-124 (mikroRNA av interesse) og snoRNA-55 (normalisering) samt relative nivåer av uttrykk av Mir-124 er vist i fig. 4 og Tabell jeg. I våre forsøk har vi brukt snoRNA-55 som en kontroll for normalisering. Som vi nevnte ovenfor, kan andre allestedsnærværende RNAS også brukes til normalisering som snoRNA-135 og U6.

De eksempler på uttrykk av Mir-124 hos voksne microglia vs benmarg avledet makrofager (BMDMs) er vist i fig. 5a (BMDMs ble dyrket i presence av M-CSF som beskrevet ^7). I fig. 5b, sammenlignet vi uttrykket av Mir-124 i sortert populasjoner av CD45 ^lav microglia vs CD45 ^hi makrofager. I begge disse eksperimentene viste vi at microglia er forskjellig fra andre makrofager ved å uttrykke høyere nivåer av Mir-124. Lignende eksperimenter kan utføres i fremtiden for Saab microglia aktivering in vivo eller in vitro.

Expression of Mir-124 i microglia isolert fra CNS av C57BL / 6 mus på ulike stadier i utviklingen er vist i fig. 5c. Disse dataene viser at microglia i tidlige stadier av utviklingen uttrykkelig lavere nivåer av Mir-124, som er korrelert med deres aktivert fenotype ^7. Tilsvarende analyse kan utføres for å studere de funksjonene microglia i normale CNS eksempel sammenligning av uttrykk for bestemte miRNAs i microglia isolert fra ulike områder av sentralnervesystemet: lillehjernen, sPinal ledningen, hippocampus etc.

Figur 1. De eksempler på gode og dårlige forberedelser av microglia som bestemmes av flowcytometri. I tilfelle av "gode" isolering av microglia fra normale CNS, 95-98% av cellene representerer CD11b ⁺ CD45 ^lav microgla med 2-5% av CD11b ⁺ CD45 ^hi perivaskulær makrofager. Mindre enn 1% av CD11b ^- CD45 ^{hi-lymfocytter} eller CD11b ^- CD45 ^- astroglial eller oligodendroglial celler eller celle fragmenter bør være til stede (a). Ved "dårlig" preparatet er vist her (b), der 18% av forurensende CD11b ^- CD45 ^- celler er til stede (b, nedre venstre kvadrant) antyder utilstrekkelig Percoll gradient separasjon. Ved god forberedelse, bør 95-98% av cellene representerer CD11b ⁺ CD45^lav microglia (a, øverst til venstre kvadrant), bør 2-5% av alle celler representerer CD11b ⁺ CD45 ^hi perivaskulær makrofager (en, øvre høyre kvadrant), og mindre enn 1% av alle cellene skal representere CD11b negative forurensende celler (en, senke venstre kvadrant). I tilfelle av "dårlige forberedelser", signifikant kontaminering av CD11b ^- CD45 ^- celler eller celle fragmenter (astroglia, myelin partikler etc.) er tilstede (b, nedre venstre kvadrant), som gjør utarbeidelse av cellene uegnet for RNA isolering og ytterligere analyse. I tillegg CD11b ^- kunne CD45 ^hi celler også være til stede i tilfelle av "dårlig forberedelse" (b, nedre høyre kvadrant) som indikerer forurensning av blodlymfocytter grunn av utilstrekkelig perfusjon.

Figur 2. Flow cytometri analysis og sortering av bestander av microglia og perifere makrofager fra syke CNS (a) Under neuroinflammation tre populasjoner av cellene er til stede i CNS: CD11b ⁺ CD45 ^lav (microglia), CD11b ⁺ CD45 ^Hi (makrofager), og CD11b ^- CD45. ^hei (lymfocytter), som vist i øverste venstre, øvre høyre og nedre høyre kvadranter, henholdsvis. Gates for sortering bestander av CD11b ⁺ CD45 ^lav microglia og CD11b ⁺ CD45 ^hi makrofager er vist i (b) og renhet på reanalysert sortert populasjoner er vist i (c, d). Foreløpig gating på levedyktige celler basert på FSC / SSC parametre ble implementert.

Figur 3. Eksempler på "gode" og "dårlig" qualities av RNA isolert fra microglia og analysert ved gel elektroforese. I tilfelle av god kvalitet, er RNA stige og ribosomal RNA tydelig (a). I tilfelle av dårlig kvalitet, smear, og lavmolekylære nedbrytingsprodukter er tydelig (b).

Figur 4. Sanntids QRT-PCR kurver for fluorescensmerkede Mir-124 og snoRNA-55 PCR produktene. Kurver for snoRNA-55 (a) og Mir-124 (b) er vist for microglia og benmarg avledet makrofager (BMDMs). Forsøket ble utført i duplikater. Ct-verdier ble bestemt av skjæringspunktet mellom grunnlinjen med den nedre delen av lineær rekke QRT-PCR kurver som vist i (b). Klikk her for å se større figur .

Tabell I. Beregning av relative nivåer av Mir-124 uttrykk i microglia vs beinmarg utledet makrofager basert på C _T verdier for Mir-124 (mikroRNA av interesse) og snoRNA-55 (kontroll for normalisering).

Figur 5. Analyse av Mir-124 uttrykk i microglia og makrofager. Sammenligning av Mir-124 uttrykk i microglia fra normale CNS vs beinmarg avledet makrofager (BMDMs) er vist i (a). Sammenligning av Mir-124 i microglia vs perifere makrofager isolert fra CNS til i mus med neuroinflammation er vist i (b). Endringer inivå av uttrykk av Mir-124 i microglia under utvikling i mus på 1, 2 og 4 uker gammel i forhold til voksne mus (ved 8 uker gammel) er vist i (c). I (a, b) Forsøket ble utført i tre eksemplarer med gjennomsnitt ± SD av tre separate PCR reaksjoner vist. I (c) Forsøket ble utført i duplikater som angitt.

Nylig betydelig interesse ble gitt til microglia og involvering av disse cellene i mange patologi forbundet med neuroinflammation og neurodegeneration. I tillegg har rollen microRNAs i differensiering av immunsystemet og kreft celler dramatisk vokst de siste årene ^5,10. Vi har tidligere rapportert rolle Mir-124 i vedlikehold av ikke-aktivert eller hvile fenotypen av microglia i normale CNS ^7, men den rollen de andre typene microRNAs i microglia fenotype og aktivisering staten fortsatt å bli oppdaget. Dette vil kreve utvikling av nye metoder for måling av miRNA uttrykk spesielt i microglia.

Microglia er vanskelige celler å håndtere i eksperimenter, siden de blir aktivert og betydelig endret etter deres isolasjon fra CNS. Protokollene for isolering av microglia fra normale CNS ble tidligere publisert ^11,12. Selv om disse protokollene Could være nyttig for RNA isolering, tror vi at disse protokollene er mer egnet for mRNA uttrykk snarere enn for vurderingen av mikroRNA uttrykk. Først mange etterforskere bruker enzymatisk fordøyelse av homogenisert vev eller magnetisk perle rensing som aktiverer microglia og medføre betydelige endringer i mikroRNA uttrykk (ikke publisert observasjon). Second, forfatterne bruker Trizol-baserte metoder for RNA isolering ¹¹ som ikke er optimal for mikroRNA analyse i et lite antall microglial celler, spesielt for de bestander som ble sortert fra CNS ved FACS. Her presenterer vi en rask og enkel protokoll med minimale manipulasjoner under isolering av microglia fra CNS. Denne metoden gjør det mulig mottak av rene bestander av microglia med minimale nivåer av spontan aktivering kombinert med en teknikk for effektiv isolering av RNA fra et lite antall celler. I tillegg brukte vi protokollen for isolering av RNA som vil bli spesielt beriketmed korte ikke-kodende RNA og mikroRNA.

I tillegg til renhet av isolerte microglia, er det også viktig å sørge for at kvaliteten på RNA er egnet. Uten riktig separasjon av microglia på Percoll stigning resultatet er forurensning av RNA prøver med myelin rusk, som ville gjøre miRNA profilering i microglia ikke bare vanskelig å tolke, men også reduserer kvaliteten på RNA heller drastisk på grunn av en høy konsentrasjon av nukleinsyrer, proteiner og lipider i myelin partikler.

Som vi nevnte ovenfor, en betydelig vanskelighet i måling miRNA uttrykk i microglia er det lite antall celler og lav mengde av RNA innhentet selv fra en stor gruppe mus (10 eller mer). Derfor vil vi anbefale å lage en kort liste over 10-30 microRNAs og se separat på nivå uttrykk for hver av en bruker singleplex QRT-PCR stedet for å bruke mindre følsomme multiplekse PCR-analyser eller matriser somkrever en ganske høy mengde RNA. Etter vurdering av uttrykket av flere microRNAs av singleplex QRT-PCR som vi beskrev, kunne andre store miRNA profilering metoder brukes etter deres nøye validering. Nylig var det en reportasje om en mer følsom metode for multiplex analyse av microRNAs på MicroFluidics plattformer ^13, som potensielt kan bli vedtatt for storskala mikroRNA uttrykk profilering i microglia.