Rensing av Patogen vakuoler fra

Christine Hoffmann, Ivo Finsel, Hubert Hilbi

Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität

1. Forberedelser til LCV Isolation

1. Streak ut Legionella pneumophila produsere DsRed-Express ^13,14 fra glyserol aksjer på CYE agar plater med 5 mikrogram / ​​ml Kloramfenikol (CAM) fire dager før LCV isolasjon. Inkuber bakterier ved 37 ° C.
2. Seed ut 1 x 10 ⁷ D. discoideum produsere GFP-calnexin eller RAW264.7 murine makrofager i 75 cm ² vevskultur kolber en dag før infeksjon. Bruk 10 ml HL5 medium med 20 mikrogram / ​​ml G418 for D. discoideum og Inkuber amøber ved 23 ° C. For RAW264.7 makrofager bruke 10 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% FCS (varme inaktivert) og 1% glutamin, og vokser cellene ved 37 ° C og 5% CO _2. Bruk minst tre 75 cm ² kolber per infeksjon og prøve (minimum 6 x 10 ⁷ celler).
3. Inokuler en overnatting kultur med L. pneumophila fra CYE plate. Ta en 15 ml reagensrør med 3 ml AYE mediumog 5 mikrogram / ml Cam. Inokuler med 100 mL av en bakteriell suspensjon å gi en OD _600nm på 0,1. Inkuber over natten kultur på en overhead rotasjon hjulet ved 37 ° C i 21-22 timer.

2. LCV Isolasjon

1. Endre medium D. discoideum celler for å fjerne antibiotika, noe som ville forstyrre følgende infeksjon.
2. Mål OD av natten kultur. Bakterier burde ha nådd sin topp smittsomhet på en OD _600nm på ≥ 3, som tilsvarer 2 x 10 ⁹ bakterier / ml.
3. Infisere cellene ved å legge ca 500 mL av L. pneumophila natten kultur til cellene vokser i 10 ml HL5 medium (D. discoideum) eller 10 ml RPMI 1640 (makrofager). Dette tilsvarer et mangfold av infeksjon (MOI) på 50. Deretter er den infeksjonen synkronisert ved sentrifugering av bakterier inn på cellene ved 500 × g for 10 min. Sentrifugeringen er fulgtved en inkubasjonstid på D. discoideum celler ved 25 ° C og RAW264.7 makrofagene ved 37 ° C og 5% CO _2, henholdsvis. Infeksjonen tid på 1 time omfatter sentrifugering trinnet.
4. Etter infeksjon fjerne medium og vaske cellene gang for å fjerne ekstracellulære bakterier. Bruk iskaldt SorC buffer for D. discoideum og iskald PBS for RAW264.7 makrofager. Legg 3 mL HS buffer, supplert med proteasehemmere (Roche) til hver kolbe og samle cellene ved hjelp av en celle skrape. Pool tilsvarende prøver i et 15 ml prøverør.
5. For homogenisering av prøven bruker 3 ml plast Luer-Lock-sprøyter og rustfritt stål ball homogenizer. Pass på at du arbeider på is. Før du starter, vaske ballen homogenizer med destillert vann, for å unngå enhver vaskemiddel forurensning og skyll den med iskald HS buffer for å bli kvitt luftbobler. Bruk 8 mikrometer clearance ball.
6. Fyll den første 3 ml i sprøyten und montere den på the homogenizer. Trykk prøven frem og tilbake ni ganger gjennom homogenizer. Utveksle sprøyter etterpå for å unngå forurensning med ikke-homogenisert materiale. Samle og bassenget på homogenisert prøven i et 15 ml reagensglass og ta en 150 mL prøve for mikroskopisk analyse. Før du fortsetter med et annet utvalg demontere og vaske ballen homogenizer.
7. Blokker homogenat med 2% CS eller FCS i 30 min på en shaker med is eller på en overhead-rokk (10-20 rpm) ved 4 ° C.
8. Etter blokkerer bruke en affinitet-renset primær antistoff mot SidC (fortynning 1:3000) eller mot noen annen bakteriell markør utelukkende binding til LCV membran. Vortex antistoffet løsningen før du legger den til homogenat. Inkuber prøven for en time på en shaker med is eller på en overhead-rokk (10-20 rpm) ved 4 ° C.
9. I mellomtiden forbereder Histodenz gradient. Bruk en 15 ml reagensglass per gradient og tre 75 cm ² flasker av en prøve. First, legg 5,75 ml 35% Histodenz til røret, og andre, tilsett forsiktig 5,75 ml 10% Histodenz løsning på toppen. Etterpå nøye legge rørene ned horisontalt for 1 time.
10. Etter inkubering av homogenat med blokkering reagens og den primære antistoffet, sentrifuger ved 600 × g for 15 min ved 4 ° C til pellet prøven. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1,5 mL HS buffer. Overfør prøvene til en frisk 15 ml reagensglass og ta en 40 mL prøve for mikroskopisk analyse senere.
11. Inkuber pellet med den sekundære antistoff - MACS geit anti-kanin IgG mikro perler (fortynning 1:25) - for 30 min på en shaker ved 4 ° C. I mellomtiden satte søylene på MACS magnetholder og likevekt dem med 0,5 mL HS buffer.
12. Deretter gjelder prøvene til kolonnen. Samle 150 mL av gjennomstrømning for påfølgende mikroskopisk analyse. Vask kolonnen tre ganger med 0,5 mL HS buffer.
13. Fjern kolonnene fra than magnet og eluatet de varebiler med 0,5 ml HS buffer ved umiddelbar squirting. Ta en 20 mL prøve for mikroskopisk analyse. Den rensingen av immuno-magnetisk separasjon forventes å gi per 1 × 10 ⁷ smittet D. discoideum celler ca 1 × 10 ⁶ intakte varebiler, som er omtrent syv ganger beriket i eluatet sammenlignes med gjennomstrømning ^13.
14. Sett Histodenz stigningsdata rør tilbake til en vertikal stilling og nøye laste eluatet på toppen. Sentrifuger rørene på 3350 × g for en time ved 4 ° C.
15. Etter sentrifugering ta 1,5 ml fraksjoner start fra bunnen av reagensglasset ved hjelp av en lang glass Pasteur pipette. Tilsammen samle åtte fraksjoner, hver fra bunnen av røret. Ingen synlige lag er observert i den kontinuerlige Histodenz gradient. Den høyeste avkastningen av varebiler er vanligvis forventes i brøkdelen 4 i forholdet ~ 2 × 10 ⁵ intakte varebiler per 1 × 10 ⁷ ifected amøber ^13. Mindre mengder av varebiler er også til stede i fraksjoner 3 og 5, henholdsvis. Dermed er den samlede avkastningen av renset varebiler ~ 1 × 10 ⁶ intakte varebiler pr 6 × 10 ⁷ smittet D. discoideum celler ^13. Oppgangen av varebiler kan utføres ved romtemperatur (RT) og varebiler vises stabilt i flere timer.

3. Mikroskopisk Analyse av innsamlede prøver

1. Forbered en 24-brønns flat bunn vevskultur plate med poly-L-lysin belagt Dekkglass.
2. Pipettering hver prøve tatt under LCV rensing pluss 150 mL av hver tettshetsgradient brøkdel inn i 24-brønnen plate. Tilsett 0,5 mL HS buffer til hver brønn for å fortynne høye Histodenz konsentrasjon. Etterpå sentrifuger platen på 600 × g for 10 min ved 4 ° C. Fjern forsiktig supernatanten og fikse prøvene med 4% paraformaldehyde (PFA) for 20 min ved RT. Etter fiksering vaske prøvene to ganger. Osse SorC for D. discoideum og PBS for RAW264.7 makrofager.
3. 1. Monter prøvene fra GFP-calnexin uttrykke D. discoideum, tatt på ulike trinn under LCV isolasjon, direkte på glass-lysbilder med f.eks Vectashield.
   2. Inkuber prøvene fra RAW264.7 makrofager, tatt på ulike trinn i løpet LCV isolasjon, med blokkering løsning (1% BSA i PBS) for 10 min ved RT. Bruk en anti-SidC primær antistoff å farge varebiler og inkuber 1t i en våt kammer på RT (affinitet-renset kanin anti-SidC, 1:1000 i blokkering buffer). Deretter vasker prøvene tre ganger med PBS. Inkuber med en sekundær antistoff (f.eks anti-kanin Cy5; 1:200 i blokkering løsning) for 30 min i et vått og mørkt kammer på RT. Til slutt, vaske prøvene tre ganger med PBS og montere dem på glass-lysbilder med f.eks Vectashield.
4. Morfologi, integritet og kvantitet av varebiler isolert fra GFP-calnexin uttrykke D. DIScoideum eller fra RAW264.7 makrofager blir analysert av en fluorescens mikroskop utstyrt med tilstrekkelige filtrene.

4. Representative Resultater

Kvaliteten og utbytte av LCV rensing av immuno-affinitet separasjon og tettshetsgradient sentrifugering kan bli etterfulgt av fluorescens mikroskopi (Fig. 1). En oversikt over prøver innsamlet i løpet av LCV isolasjon fra D. discoideu m eller makrofager vises (Fig. 2). Den homogenat av L. pneumophila-infiserte fagocytter viser intakte varebiler, men også mye celleavfall og ekstracellulære bakterier. Etter pelletering prøven, er bildet ligner på homogenat, noen ganger litt tettere. Siden intakte varebiler bør holde seg til kolonnen, inneholder gjennomstrømning meste ekstracellulære bakterier og celleavfall. Etter eluting prøven fra kolonnen, inneholder eluatet intakte varebiler i store mengder. I våre hender, den LCV purificati på synes å være mer effektive for D. discoideum enn for makrofager. I D. discoideum patogenet vakuoler vises rundere og utbyttet av isolerte varebiler er mer enn 10 ganger høyere sammenlignet med makrofager (fig 3). I intakte makrofager LVCs farget med forskjellige antistoffer også vises mer uregelmessig form.

Figur 1. Skjematisk oversikt over LCV isolasjon. A) Isolering av varebiler ved immuno-magnetisk separasjon ved hjelp av en affinitet-renset antistoff mot bakterielle effektor protein SidC, lokalisere utelukkende til LCV membran. Et sekundært MACS mikro bead-coupled antistoff og en magnet brukes til å isolere varebiler fra celleavfall. B) Etter immuno-magnetisk separasjon varebiler blir ytterligere renset ved Histodenz tettshetsgradient sentrifugering. Varebiler er beriket i fraksjonen 4.

upload/4118/4118fig2.jpg "/>
Figur 2. Prøver samlet inn under LCV rensing. Bilder fra homogenat, pellet, gjennomstrømning og eluatet fra D. discoideum eller makrofager blir avbildet. Prøvene viser L. pneumophila produsere DsRed-Express (rødt) i D. discoideum produsere GFP-calnexin signal (grønn, øvre panel) eller i makrofager farget med en anti-SidC antistoff (cyan, nedre panel). Barer, 10 mikrometer.

Figur 3. Purified varebiler fra D. discoideum eller makrofager. Prøvene viser brøkdel 4 etter Histodenz tettshetsgradient sentrifugering av L. pneumophila produsere DsRed-Express (rødt) i (A) D. discoideum produsere GFP-calnexin signal (grønn) eller (B) i makrofager farget med en anti-SidC antistoff (cyan). Barer, 10 mikrometer.

I motsetning til tidligere publiserte metoder, er denne protokollen basert på to trinn, først ved separasjon av varebiler med en immuno-magnetisk tilnærming, og andre, rensing av varebiler ved tettshetsgradient sentrifugering. Den LCV isolasjon kan lett følges av fluorescens mikroskopi, da enten fluorescensmerkede bakterier og GFP-produserende celler eller antistoff flekker brukes. Protokollen er beskrevet her er en enkel, rett-fram metoden, som resulterer i anriking av varebiler med høy renhet. Viktigere er proteasehemmeren i homogenisering buffer som kreves for RAW264.7 makrofager, men valgfritt for D. discoideum ^13.

I prinsippet kan protokollen skal vedtas for andre patogener eller vertsceller, så lenge en bestemt, selektivt lokalisere markør er til stede, noe som er nødvendig for separasjon trinn. Ideelt sett er det tydelig markør for bakteriell opprinnelse, fraktet til vakuole membran, ennd selektivt lokalisere der. Målrette en vertscelle markeringslys sannsynlig resultat i den uønskede co-rensing av organismen vakuole med andre vertscellen rom.

Når en særegen markør av organismen vakuole er identifisert, har en passende polyklonale eller monoklonale antistoff skal heves. For hver primær antistoff konsentrasjonen og blokkerer reagens bør optimaliseres, som blokkerer reagenser andre enn FCS kan være mer hensiktsmessig (f.eks BSA, de-lipidated melk, andre kommersielt tilgjengelige blokkerende reagenser).

En annen kritisk punkt er smittsomhet av organismen. Bakteriene som brukes for infeksjon bør være i sin mest infeksiøs scenen. L. pneumophila, f.eks, trenger å bli dyrket i post-exponential/early stasjonær vekstfase i flytende kultur. Under disse forholdene, bakteriene er også morfologisk uniform (~ 2 x 0,5 mikrometer), i motsetning til bakterier dyrket på CYE agar plater. Videre antibiotics muligens brukes i cellekultur medium må fjernes før en infeksjon for å unngå lav smittsomhet og skade bakteriene. For å unngå en negativ effekt på opptaket effektivitet, bør fagocytter har nådd en confluency på ca 80% (ikke mer) på tidspunktet for infeksjon. Til slutt, selv om en inkubasjonstid på en time er standard infeksjon tid for L. pneumophila, som gir en ganske homogen og robust bestand av varebiler, kan andre tidspunkter velges for proteomikk eller biokjemiske studier på LCV formasjon ^13.

Når metoden ovenfor er etablert for en gitt patogen-vert celle par, er det også mulig å teste bakterielle mutante stammer og / eller ulike vertsceller, blant annet D. discoideum definert sletting mutanter. Generelt kan patogen vakuoler renset med denne protokollen bli analysert av ulike metoder, inkludert mikroskopi (fluorescens og elektronmikroskopi), biokjemiske analyser (Western blot), som vill som proteomikk og lipidomics. For de sistnevnte metodene, er det tilrådelig å koordinere med ansvarlige for de proteomikk / lipidomics analyse buffer forhold, eksempler beløp og nedstrøms behandling av renset patogene vakuoler.