Векторной ДНК на основе РНК-интерференции по изучению функции генов в Раке

1. Генерация Конструкции ShRNA

1. Определить миРНК-последовательности-мишени (20-23 нуклеотидов) на основе ранее опубликованных критериев ⁶ или использовать веб-сервер на основе алгоритма, такие как "миРНК целевой Finder" от Ambion и GenScript.
2. Синтез олигонуклеотидов на основе дизайна на рисунке 1 и пример последовательности в таблице 1. Проведение ПЦР-амплификации использованием олигонуклеотидов Р1 и Р2 (30 циклов денатурации при 94 ° С в течение 30 секунд, отжиг при температуре 60 ° С в течение 30 сек, а удлинение при 72 ° С в течение 30 сек) и плазмиды, несущие U6 или H1 Промоутер в качестве шаблона. Очищение ПЦР продукта с использованием ПЦР колонка очистки. Дайджест его BamHI и HindIII и очистить переваривается ДНК с использованием ПЦР колонка очистки. Отжиг олигонуклеотидов P3 и P4 (2,5 пмоль / мкл в 100 мкл 50 мМ трис • HCl, рН 8,0) при кипячении в течение 5 мин и медленно остыть до комнатной температуры. Дайджест лентивирусов векторовтор, как это описано в рисунке 2А, по BamHI и EcoRI, а также выполнять гель для очистки.
3. Проведение 3-фрагмента перевязки с BamHI / EcoRI-переваренной вектор, BamHI / HindIII-переваренной ПЦР-фрагмента и одна пара из отожженной олигонуклеотидов (формирование HindIII и EcoRI участков на обоих концах) в молярном соотношении 1:10:10 (рис. 1).
4. Преобразование высокоэффективных компетентных E. DH5α кишечной клетки, используя перевязанной продукта. Экран колонии использованием олигонуклеотидов Р5 (в векторе) и P6 (в промоутер H1 или U6) ^7.
5. Подготовить плазмидной ДНК из положительных колоний коммерческого набора и подтвердить наличие вкладыша по BamHI / EcoRI пищеварения и ДНК в агарозном электрофорезе. Последовательность области, содержащей промотор и ShRNA использованием олигонуклеотидных P5.
6. Использование ДНК плазмиды Midi или Maxi-подготовка комплектов (эндотоксин без предпочтительнее) для подготовки проведения ДНК лентивирус выражение ShRNAкассету. Определить концентрацию ДНК, измеряя поглощение при 260 нм. Проверьте чистоту ДНК использованием 260 нм nm/280 отношения и убедитесь, что она находится в диапазоне от 1.8 до 2.0. Проверьте целостность лентивирус плазмиды использованием электрофореза в агарозном геле. ДНК для трансфекции должны быть супер-спиральный.

2. Лентивирус Трансфекция

Меры предосторожности: лентивирусов векторов на основе вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) и репликации генома некомпетентны. Они нашли широкое применение в генной доставки в связи с возможностью заражения как деление и не делящихся клеток. Тем не менее, две основные риски существуют в исследованиях с использованием лентивирусов. (1) потенциал для генерации репликации компетентных лентивирусов. Этот риск может быть существенно уменьшена, если третье поколение лентивирусов система. (2) потенциал для онкогенеза. Этот риск может быть усилено, если осуществляется вставки онкогенных или пресечения опухолевых супрессоров.Научно-исследовательской работы в области ВИЧ на основе лентивирусов должны следовать «Биобезопасность Вопросы исследования с лентивирусов Вектора" НИЗ ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) и требуют одобрения со стороны комитета по биобезопасности учреждения исследователя. Вообще, повышение уровня биобезопасности-2 (BSL-2) сдерживание необходимо для лабораторных условиях, если лентивирусов векторов используются.

1. Пластина 4 × 10 ⁶ клеток HEK 293T с полной DMEM среде (DMEM поставляется с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) в 10 см блюд и культура ночь при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора. Замените среду с 5 мл подогретого Opti-MEM я уменьшил сыворотки СМИ (Invitrogen).
2. Подготовить решение: 10 мкг ShRNA содержащие лентивирусов вектор, 5 мкг каждого третьего GENERЦ И А Ц лентивирус упаковке плазмиды (подготовлен с высокой чистотой, три плазмиды упаковка включает VSV-G: для конверта белка, pRSV-Rev: на оборот, и pMDLg / pRRE: для кляп / пол, которые необходимы для лентивирус упаковки), 36 мкл 2М CaCl ₂ и 300 мкл стерильной воды.
3. Подготовить решение B: 300 мкл 2 × Hepes буферном растворе (281 мм NaCl, 100 мМ HEPES, 1,5 мМ Na ₂ HPO _4, рН до 7,12 на 0,5 N NaOH и стерилизуют 0,22 мкм фильтр).
4. Медленно падать решение в решение B в то время как пузырится воздух через решение B с помощью пипетки. Оставьте трубки при комнатной температуре в течение 30 мин.
5. Медленно опустить смешанных растворов A / B в клетки HEK 293T культуры блюдо в шаге 2.1 и инкубировать при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора в течение 4-6 часов.
6. Замените среду с 7 мл полной среды DMEM. Через 24 ч, добавить еще 5 мл полной среды DMEM. Урожай средний продолжениеaining лентивирус после еще 24 ч культуры.
7. Спиновая среде при 1500 оборотах в минуту, температура окружающей среды в течение 10 мин. Фильтр супернатант использованием 0,45 мкм фильтр и спина проточной среде, содержащей лентивирус ультрацентрифугированием при 25000 оборотов в минуту (равный 125 000 × г с ЮЗ28 бакет ротора, Beckman ультрацентрифуге XL-90), 4 ° C в течение 90 мин. Декантируйте супернатант в контейнер с 5% отбеливателя (конечная концентрация).
8. Ресуспендируют лентивирус гранул в 0,5-1,0 мл холодного PBS и сделать лентивирус аликвоты в 50-100 мкл на трубе. Храните их при температуре -80 ° C.
9. Титр лентивирус можно определить коммерческие наборы (например, QuickTiter лентивирус количественный набор из сотового Biolabs, Inc), с помощью ПЦР в реальном времени протокол ^8, или по определению совместно выразили флуоресцентный маркер с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии . Как правило, один 10-см культуры блюдо может производить около 0,5-1,0 × 10 ⁸ инфекцииинфекционных единиц (МЕ).

3. Инфекции и характеристика инфицированных клеток

1. Семенной ячейки, которые будут инфицированы в 2 мл полной среды в 6-луночный планшет с 30-40 слияния% (около 5-8 × 10 ⁵ клеток, в зависимости от размера ячейки). Культура клеток в течение ночи при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора.
2. Замените среду с 1 мл свежей среды, содержащей 8 мкг / мл polybrene (Sigma, Cat # H9268) или 5 мкг / мл протамина (Sigma, Cat # P4020).
3. Определить подходящую множественности заражения (МВД) от ⁹ для конкретной клеточной линии использованием лентивирусов с флуоресцентным маркером. Рассчитать или эмпирически определить количество лентивирусов, которые будут использоваться для заражения клеточной линии. Медленно опустить лентивирус в тарелку и осторожно встряхните его в течение 10 сек.
4. Инкубируйте планшет при 37 ° С в 5% CO ₂ инкубаторе в течение 6 часов, а затем заменить среду с нормальной полной среде.
5. По крайней мере два даЮ.С. после заражения, проверьте клеток с помощью флуоресцентной микроскопии для лентивирус выражения флуоресцентных маркеров и / или добавить соответствующий антибиотик среды для лентивирусов векторов выражение генов устойчивости к антибиотикам. Для индуцируемый вектор, например, Тет-On системы (рис. 2), культуры клеток в среде с тетрациклином подготовлена ​​без FBS. Разделите клетки 2-3 дней после заражения. Возьмите часть клеток для тестирования нокдаун гена индуцибельной при культивировании их в среднем поставляется и без 1,5 мкг / мл доксициклина (DOX) в течение ≥ 2 дней.
6. Проверьте ген нокдаун западных блот, ПЦР в реальном времени или окрашивания ≥ 2 дней после заражения, через 2 дня после антибиотиков выбора, или (для Tet-On индуцибельной системы) ≥ 2 дней после того Dox.
7. Использование различных подходов (например, клеточной пролиферации анализы, исследования культуры мягкий агар, миграции анализы, анализы вторжения и опухолевым образование), чтобы определить последствия кп гена-мишениockdown на злокачественные клетки.

4. Ксенотрансплантата Исследование модели мыши

1. Очистите все поверхности для обезболивания мыши и инъекции на 70% этанолом, чтобы предотвратить заражение мышей. Обезболить бестимусных голым мышам (NCI-Frederick), используя 2% изофлуран в смеси с кислородом в камере вводного наркоза 10 минут до клетки прививки. Поддержание анестезии используют 1% изофлуран в смеси с кислородом через носовой конус. Провести этот шаг в комнате с отличной вентиляцией и приложить ИФ фильтров мусорщик к индукции камеры.
2. Распространить клеток, несущих shRNAs. Использование тетрациклина без среда для Tet-On индуцибельной векторов. Trypsinize клеток и их ресуспендируют в полной среде, содержащей 50% Матригель. Установите голым мышам на грелку (30 ° C) и ввести 200 мкл клеток (1-10 × 10 ^6, в зависимости от злокачественных клеток) в мышах с 1-2 инъекций на мышь. Использование шприцев с 25.5-иглы для подкожных инъекций, и 28-30 иглы для инъекций ортотопической.
3. В учредительных векторов ShRNA, используют 2 группы мышей вводили клетки, экспрессирующие ген-мишень ShRNA и платные ShRNA. Для Тет-на векторы индуцибельной ShRNA, используют 4 группы мышей вводили клетки, несущие ген-мишень ShRNA и платные ShRNA, поставляется с обычной водой и Dox (1,5 мг / мл), содержащей воду (2 × 2 shRNAs лечения = 4 группы) . Замените Dox содержащих воду два раза в неделю.
4. Следите за длиной и шириной опухоли в неделю или раз в две недели с помощью цифровой штангенциркуль и рассчитать объемы опухоли (V) по формуле V = 1/2 (длина × ширина ^{2) 10.} Убедитесь, что объем опухоли не превышает принципы институционального ACUC (например, 10% от массы тела). Усыпить любую мышь, используя протокол, утвержденный институциональных ACUC, если он показывает никаких признаков обширной язвы или некроз, очевидно infectioп, неконтролируемые кровотечения или терминальной стадии болезни.
5. Рост опухоли и метастазов можно наблюдать у затравленных опухоль клеток, экспрессирующих маркер биолюминесцентного ^11, такие как люциферазы Firefly. Очистите все поверхности для обезболивания мыши и изображения на 70% этанолом, чтобы предотвратить заражение мышей. Анестезию мыши, как описано в пункте 4.1. Вводите люциферин (150 мг / кг) внутрибрюшинно. Поместите мышь в камеру дезинфекции изображений коммерческой системы визуализации, такие как система ИВИС Imaging (суппорт Life Sciences, Inc.) Включите анестезии рычаг для поддержания анестезии 1% изофлуран в смеси с кислородом. Проведение этого этапа в комнате с отличной вентиляцией.
6. Возьмите первый образ, подвергая 5 минут и проверить его интенсивность сигнала. Отрегулируйте время экспозиции для получения изображения оптимального сигнала от фона. Определить время эмпирически изображений, которые, как правило, 1-5 минут для опухолей клетчатки.
7. Усыпить мышей протокол утвержденныйинституциональной ACUC, когда опухоль достигает размеров около 1000 мм ^3, или, как указано в ACUC принципов. Акцизные опухолей ксенотрансплантата, взвесить их и сфотографировать. Обработка образцов опухоли для различных исследований, таких как патологические анализы, чтобы определить морфологию клеток опухоли и Вестерн-блот и ПЦР в реальном времени исследования для тестирования экспрессии генов.

5. Представитель Результаты

Этот протокол был использован для изучения влияния YY1 нокдаун на ксенотрансплантата опухоли формирования Светлячок люциферазы экспрессией MDA-MB-231 клеток (человеческих клеток аденокарциномы молочной железы; суппорт Life Sciences) в бестимусных голым мышам. Последовательность ShRNA цель человека YY1 в «GGG AGC AGC AGA AGA AGG ТГК Т". Платные последовательность "GGG ACT ACT CTA TTA ВКТ CAT Т" была создана для управления (продолжение) ShRNA, которые не имеют значительное сходство в любом известном протоколе. Олигонуклеотиды используются для Tet-On конструкции индуцибельной ShRNA с YY1 в качестве примера, Приведены в таблице 1. В результате, два лентивирусов векторов, плю-Puro-Indu-YY1 ShRNA и плю-Puro-Indu-продолжение ShRNA, были построены, и они были использованы для производства лентивирусов. Мы использовали эти лентивирусов индивидуально заразить два MDA-MB-231 клеточных клонов (клоны 1 и 3), выражающая как тетрациклин регулятор (TetR) и Firefly люциферазы. Поликлональные популяции клеток были получены после пуромицин выбор. 3А показывает Dox вызванных YY1 нокдаун в этих MDA-MB-231 клеток зараженных плю-Puro-Indu-YY1 ShRNA лентивирусов. Затем мы использовали поликлональные клетки клон 3 инфицированных индивидуально эти индуцибельной YY1 ShRNA и продолжение ShRNA лентивирусов и отметил, что истощение YY1 уменьшить инвазивность MDA-MB-231 клеток (рис. 3В). Вестерн-блот анализ подтвердил Dox вызванных YY1 глушителей в MDA-MB-231 клеток с пром-YY1 ShRNA, в то время как клетки, содержащие пром-продолжение ShRNA не показывают этот эффект (рис. 3). Затем мы использовали эти клетки для исследования ксенотрансплантата модель мыши. По сравнению с контрольными группами, мышей имплантированные в MDA-MB-231 клеток с пром-YY1 ShRNA и поставляется с Dox содержащие воды показали снижение опухолей, когда визуализируется на биолюминесценции (рис. 4а) и определяется опухоль весом (рис. 4В ). YY1 глушителей в этих ксенотрансплантата опухоли была подтверждена западным исследованиям пятном показано на рисунке 4C.

Рисунок 1. Схема для генерации ShRNA конструкции и ShRNA транскрипции. P1 праймеров для P6 показано (см. таблицу 1, например, последовательности). Pol III: РНК-полимеразы III (г). Переваривается конца. Рисунок не в масштабе. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

2 "SRC =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Схемы (А) лентивирусов вектор и (Б) механизм Тет-H1 на индуцируемый промотор для генов. Лентивирусов вектор был реконструирован на основе pLL3.7 ^14. H1-Pr: H1 промоутер, UBC-Pr: Human убиквитин промоутер C; Puro: пуромицин; TRE: Тетрациклин реагировать элемент; Dox: доксициклин. TetR: тетрациклин регулятора. 5'LTR, 3'SIN-LTR и WRE являются важными компонентами лентивирусов ¹⁴ вектор.

Рисунок 3. Dox вызванных YY1 глушителей и его влияние на инвазивность MDA-MB-231 клеток. А. YY1 уровней в двух поликлональных популяций клеток, полученных из TetR экспрессирующих клонов 1 и 3 заражены плю-Puro-Indu-YY1 ShRNA лентивирусов и культивировали в отсутствие и в присутствии Dox. Б. Бойден камеры анализ в MDA-MB-231 клетки с индуцибельной shRNAs. (* P <00,05 по сравнению с другими тремя группами). С представителем Западной пятна от YY1 выражение в этих четырех клеточных популяций.

Рисунок 4. Эффекты индуцированного YY1 глушителей на ксенотрансплантата формирование опухоли MDA-MB-231 клеток. А. Схема клеточного имплантации (слева) и представитель биолюминесцентного изображений, системы визуализации ИВИС на 4 недели (справа) после прививки клетки. Б. ксенотрансплантата опухоль весом в 4 недели. * Р ≤ 0,05. С. Западные кляксы из YY1 и β-актина выражение в ксенотрансплантаты из MDA-MB-231 клеток с пром-YY1 ShRNA в отсутствие и в присутствии Dox. Этикетки на верхней имена отдельных мышей.

Таблица 1. Синтезированных олигонуклеотидов, используемых в создании ShRNA конструкций. P1 и P6 последовательности для мыши U6 и Тет-индуцируемой на человека промоутеров H1 предоставляются. YY1 человека используется как пример последовательности ShRNA цель GGG AGC AGC AGA AGA AGG ТГК Т. последовательности, характерные для YY1 выделены. Два P2 последовательности YY1 предназначены для двух промоутеров, соответственно. Учредительные U6 / YY1 ShRNA было описано выше ^15, а Тет-на H1/YY1 была использована в данном протоколе. P5 является вектор конкретным и последовательность pLL3.7 ¹⁴ показано на рисунке. Последовательности ферментов рестрикции подчеркнуты, а последовательности для отжига для промоутеров во время ПЦР выделены курсивом.

Этот протокол описывает метод, чтобы сбить генов использованием ShRNA и визуализировать его биологический эффект использования биолюминесцентного визуализация роста опухолевых клеток в живом организме. Целевой сайт ShRNA не должны содержать любой из трех сайтов рестрикции (BamHI, HindIII и EcoRI), используемых для субклонирования. В редких сценарий, когда любого из этих сайтов есть, дополнительный фермент, ограничение может быть использована для замены в производстве конструкции.

Несколько ключевых шагов в этом протокол позволит ускорить строительство ShRNA лентивирусов векторов. Во-первых, шаблон ПЦР плазмиды, содержащей U6 или H1 промоутер может иметь другой ген устойчивости к антибиотикам (например, канамицин) из лентивирусов векторов (как правило, ампициллин). Это может уменьшить фоне трансформации вызваны шаблон плазмиды. Во-вторых, необходимо использовать компетентные E. кишечной клетки с высокой эффективностью преобразования. Протокол использования калиям ионов марганца может быть использован для создания компетентных E. кишечной клетки с очень высокой компетенции ^12. В-третьих, выбор маркера может способствовать 3-фрагмент субклонирования. Например, лентивирусов вектор может быть спроектирован, чтобы содержать выражение кассету для β-галактозидазы (LacZ), которые будут заменены вставки фрагментов ПЦР и отожженных P3/P4 олигонуклеотидов. В этом случае рекомбинантных плазмид с вставками белого образуют колонии, в то время как эти без вставок будет синим, при контакте с X-галлон (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галакто-pyranoside) .

Качество лентивирусов векторов и три плазмиды упаковка необходима для эффективного производства лентивирусов. Очень экономичным и эффективным методом трансфекции осадков фосфата кальция была оказана. Реагенты полиэтиленимина ¹³ или большинство коммерческих трансфекции также может быть использован в лентивирус производства. Чтобы использовать надлежащее МВД лГ инфекции, важно определить титр производится лентивирусов.

Мыши всех экспериментальных группах должны быть размещены в одной комнате, чтобы устранить их циркадный ритм разница, что может привести к изменению биолюминесценции во время ксенотрансплантата визуализации опухоли. Подходы мыши эвтаназии включает CO ₂ удушья и передозировки isofluorane и должны быть одобрены институциональные ACUC.