癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

1。 shRNAコンストラクトの生成

1. 以前に発行された基準⁶またはそのようなAmbion社とGenScriptから"siRNAのターゲットファインダー"などのWebベースのアルゴリズムサーバーを使用に基づいて、siRNAを標的配列（20-23ヌクレオチド）を識別します。
2. 表1の図1と例配列の設計に基づいてオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドはP1とP2（30 94℃で変性のサイクル℃で30秒C、60℃アニーリング温度で30秒C、30秒間72℃での伸長）とU6またはH1を有するプラスミドを用いてPCR増幅を行うテンプレートとしてプロモーター。 PCR精製カラムを用いたPCR産物を精製します。 BamHI及びHindIIIでそれを消化し、PCR精製カラムを用いて消化したDNAを精製する。 5分ゆっくりと周囲温度に冷却のために煮沸してオリゴヌクレオチドP3およびP4（50 mMトリス•HCl、pH8.0に100μlの各2.5 pmol /μl）をアニールする。レンチウイルスVEC​​を消化そのようなBamHIおよびEcoRIで、 図2Aで説明したようにインダクタ、およびゲル精製を行います。
3. のBamHI / EcoRIで消化したベクターを、BamHI / HindIII消化したPCR断片と1時10分10秒モル比でアニールしたオリゴヌクレオチドの1ペア（2つの両端にHindIIIとEcoRI部位を形成する）で3断片ライゲーションを行う（ 図1）。
4. 高効率のコンピテントE.を変える連結された製品を使用して大腸菌 DH5α細胞。オリゴヌクレオチドP5（ベクトル）とP6（H1またはU6プロモーター^）7を用い^てコロニーをスクリーニング
5. 市販のキットで陽性コロニーからプラスミドDNAを調製し、BamHI / EcoRIで消化し、DNAのアガロース電気泳動によりインサートの存在を確認してください。シーケンスオリゴヌクレオチドP5を使用して、プロモーターとshRNAを含む領域。
6. shRNA発現レンチウイルスを運ぶDNAを調製するためにプラスミドDNAミディまたはマキシ準備キット（エンドトキシンフリーが好ましい）を使用してカセット。 260 nmにおける吸収を測定することによって、DNA濃度を決定します。 260 nm/280 nmの比を用いたDNAの純度を確認し、それが1.8から2.0の範囲であることを確認してください。アガロースゲル電気泳動を用いてレンチウイルスプラスミドの整合性をチェックしてください。トランスフェクション用のDNAはスーパーコイルでなければなりません。

2。レンチウイルスのトランスフェクション

注意事項 ：レンチウイルスベクターはヒト免疫不全ウイルス1無能な（HIV-1）ゲノムの複製から派生しています。彼らは広く分割し、非分裂細胞の両方に感染する能力に起因する遺伝子デリバリーに使用されている。しかし、二つの主要なリスクは、レンチウイルスを用いた研究が存在します。 （1）複製コンピテントレンチウイルスの発生の可能性。第三世代のレンチウイルスシステムを使用している場合は、このリスクを大幅に削減することができます。 （2）発ガンの可能性。運ば挿入が発癌性であるか、または腫瘍抑制因子を抑制する場合は、このリスクはさらに悪化することができます。HIVベースのレンチウイルスに関わる研究活動は、NIHの（ "レンチウイルスベクターで研究のためのバイオセーフティに関する考慮事項"に従ってくださいhttp://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ）とバイオセーフティ委員会の承認を必要とする研究者の機関。レンチウイルスベクターが使用されている場合、一般的に、強化されたバイオセーフティレベル2（BSL-2）封じ込めは、実験室の設定が必要です。

1. プレート4×10cmの皿と一晩培養し、完全なDMEM培地（DMEM、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMのL-グルタミン、100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンに付属）10 ⁶ HEK 293T細胞5％CO ₂インキュベーター内で37℃。私は血清培地（Invitrogen）を削減予め温めておいたのOpti-MEM 5mlの培地を置き換えます。
2. shRNAを含むレンチウイルスベクターを10μg、5μgの第三GENERの各解決策：準備ationのレンチウイルスのパッケージングプラスミド（高純度で調製した。3パッケージングプラスミドは、VSV-Gのとおりです。 回転 、およびpMDLg / pRRE：エンベロープタンパク質、PRSV-REVのをギャグ/レンチウイルスパッケージングに必須であるPOL用）、36 2MのCaCl _2、および滅菌水300μlのμlの。
3. 緩衝生理食塩水2×Hepes緩衝液300μl（281 mM塩化ナトリウム、100mMのHEPES、1.5mMののNa ₂ HPO _4、0.5 N NaOHで7.12に調整し、0.22μmのフィルターで滅菌したpH値）：B液を準備します。
4. ピペットで溶液Bを介して空気をバブリングしながらゆっくりと溶液Bにソリューションをドロップします。 30分間常温でチューブのままにしておきます。
5. 徐々にステップ2.1で調製したHEK 293T細胞の培養皿に混合溶液にA / Bを削除して、4〜6時間、5％CO ₂インキュベーター中で37℃でインキュベートする。
6. 完全DMEM培地7mlので培地を交換してください。 24時間後、完全DMEM培地のさらに5 mlを加える。培地contを収穫文化のもう一つの24時間後にレンチウイルスをaining。
7. 1,500 rpmで、10分間常温で媒体をスピン。 0.45μmのフィルターを使用して上清をフィルタ処理し、フロースルースピン25000 rpmで遠心分離によってレンチウイルスを含む培地（SW28スイングバケットローターで125000×gに等しい、ベックマン超遠心XL-90）、4℃で90分間。 5％の漂白剤（最終濃度）を容器に上清をデカント。
8. 冷PBSの0.5〜1.0ミリリットルでレンチウイルスペレットを再懸濁し、チューブあたり50から100μLにレンチウイルスのアリコートを行います。 -80それら℃で保存してください。
9. レンチウイルスの力価は、リアルタイムPCRプロトコール^8分 、または蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを用いた共発現して蛍光マーカーを決定することにより、市販のキット（例えば、セルバイオラボからQuickTiterのレンチウイルス定量キットとして、Inc。）によって決定することができ。通常は、1つの10-cmの培養皿は、0.5から1.0×10 ⁸感染について生成することができますtious単位（IU）。

3。感染細胞の感染とキャラクタリゼーション

1. シードは、細胞30〜40％コンフルエント（約5から8×10 ⁵細胞、セルサイズに依存）を6ウェルプレートに完全培地2mlに感染する。 37℃で一晩培養細胞を5％CO ₂インキュベーター内°C。
2. ポリブレン（シグマ社、カタログ番号H9268）またはプロタミンの5μg/ mlの（シグマ社、カタログ番号P4020）の8μg/ mlを含有する新鮮培地1mlの培地を置き換えます。
3. 感染症の適切な多重度（MOI）は、蛍光マーカーでレンチを使用して、特定の細胞株の範囲^9を決定します。計算したり、経験的に細胞株を感染させるために使用するレンチウイルスの量を決定します。ゆっくりプレートにレンチウイルスを削除して、穏やかに10秒のためにそれを振る。
4. 6時間5％CO ₂インキュベーターで37℃でプレートをインキュベートし、その後、通常の完全培地で培地を交換してください。
5. 少なくとも二つのダ感染後のYS、蛍光マーカーを発現するレンチウイルスのために蛍光顕微鏡を用いて細胞を確認し、および/または抗生物質耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクターのために媒体に対応する抗生物質を追加します。誘導ベクター、そのようなテトオンシステム（ 図2）、文化として培地中の細胞は、テトラサイクリンフリーのFBSを用意しました。細胞を2〜3日後の感染を分割します。 ≥2日間で1.5μg/ mlのドキシサイクリン（DOX）ととせずに付属の培地で培養することによって、それらを誘導性遺伝子のノックダウンをテストするために細胞の一部を取る。
6. ≥2日間のドキシサイクリン添加後のウエスタンブロット法、リアルタイムPCRや免疫染色≥2日、感染後、抗生物質選択後、2日、または（TETオン誘導システム）による遺伝子ノックダウンを確認してください。
7. 標的遺伝子のKNの効果を決定するために異なるアプローチを（例えば、細胞増殖アッセイ、軟寒天培養の研究、遊走アッセイ、浸潤アッセイおよび腫瘍形成の研究など）を利用する細胞の悪性腫瘍でockdown。

4。異種移植片マウスモデルの研究

1. マウスの感染を防ぐために70％エタノールによるマウスの麻酔と注射のための全ての表面をクリーニングします。細胞接種前に麻酔導入室10分で酸素と混合したイソフルラン2パーセントを使用してヌードマウス（NCI-フレデリック）を麻酔。ノーズコーンを介して酸素と混合したイソフルラン1％を使用して麻酔を維持します。通気性に優れた部屋には、この手順を行うと誘導室にイソフルランスカベンジャーフィルタを取り付けます。
2. shRNAを有する細胞を伝播します。テトオン誘導ベクターにテトラサイクリンを含まない培地を使用しています。細胞をトリプシン処理し、50％のマトリゲルを含む完全培地で再懸濁します。加熱パッド（30°C）にヌードマウスを置き、マウスあたり1-2注射部位をマウスに細胞を200μl（1-10×10 ⁶細胞の悪性度に応じて）を注入します。 25とシリンジを使用しています。同所注射用皮下注射し、28〜30ゲージの針の5ゲージの針。
3. 構成的shRNAベクターの場合は、ターゲット遺伝子shRNAおよびスクランブルshRNAを発現する細胞を注射したマウスの2つのグループを利用しています。 TETはオン誘導shRNAベクター、標的遺伝子shRNAおよび通常の水とDox（1.5 mg / ml）を含む水（2 shRNAの×2の治療= 4グループ）に付属してスクランブルshRNAを、運んで細胞を注射したマウスの4つのグループを利用するための。週二回ドキシサイクリン含有水を交換してください。
4. デジタルノギスによって毎週または隔週腫瘍の長さと幅を監視し、式V = 1/2（長さ×幅^2）10腫瘍体積（V）を計算します。その腫瘍体積は、機関ACUCのガイドライン（例えば、体重の10％、など）を超えないことを確認してください。それは広範潰瘍または壊死、明らかinfectioの兆候を示している場合、機関ACUCによって承認プロトコルを使用して、任意のマウスを安楽死させるnは、制御されていない出血や末期の病気。
5. 腫瘍の増殖および転移のようなホタルルシフェラーゼなどの発光マーカー^11を発現して接種し腫瘍細胞を監視することができます。マウスの感染を防ぐために70％エタノールによるマウスの麻酔とイメージングのための全ての表面をクリーニングします。ステップ4.1で説明されるようにマウスを麻酔。ルシフェリン（150 mg / kg）を腹腔内に注入します。そのようなIVISイメージングシステム（キャリパーライフサイエンス社製）などの商業イメージングシステムの消毒イメージングチャンバーにマウスを置きます。酸素と混合し、イソフルラン1％の麻酔を維持するために麻酔レバーをオンにします。通気性に優れた部屋には、この手順を実施しています。
6. 5分を公開することにより、1枚目の画像を撮影し、その信号強度を確認してください。最適な信号対バックグラウンドで画像を取得するために露光時間を調整します。一般的に皮下腫瘍1-5分で経験的に撮像時間を決定します。
7. 承認されたプロトコルでマウスを安楽死させる腫瘍の大きさは約1,000 mm ^3に 、またはACUCガイドラインで指定された到達機関ACUCによって。消費税​​異種移植腫瘍は、それらの重量を量ると写真を撮る。遺伝子発現をテストするためにそのような腫瘍細胞の形態を決定するための病理学的な分析、ウェスタンブロット法とリアルタイムPCRの研究など、さまざまな研究のための腫瘍のサンプルを処理します。

5。代表的な結果

無胸腺ヌードマウスで、このプロトコルは、ホタルルシフェラーゼを発現するMDA-MB-231細胞（キャリパーライフサイエンスヒト乳癌癌細胞）の異種移植腫瘍形成にYY1ノックダウンの効果を研究するために使用された。人間のYY1のshRNAの標的配列は、 "AGC AGA AGC AGG TGC AGA TをGGG"されています。スクランブルシーケンス "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T"も、任意の既知の転写産物に有意な類似性を持っていませんでしたコントロール（続き）shRNAを、のために作成されました。例としてYY1と、誘導性shRNAコンストラクトテトオンするために使用したオリゴヌクレオチド、 表1に示す。結果として、二つのレンチウイルスベクター、PLU-ピューロ-Indu-YY1 shRNAおよびPLU-ピューロ-Indu-CONT shRNAは、建設され、それらはレンチウイルスを生産するために使用されました。我々は個別にテトラサイクリンレギュレータ（tetR）とホタルルシフェラーゼの両方を発現する2 MDA-MB-231細胞クローン（クローン1と3）を感染させるためにこれらのレンチを使用していました。ポリクローナルな細胞集団は、ピューロマイシン選択後に得られた。 図3Aは、PLU-ピューロ-Indu-YY1のshRNAレンチウイルスに感染したこれらのMDA-MB-231細胞におけるドキシサイクリン誘導性YY1ノックダウンを示しています。我々は、これらの誘導YY1 shRNAおよびCONTのshRNAレンチウイルスによって個別に感染したクローン3のポリクローナル細胞を使用し、YY1枯渇はMDA-MB-231細胞（ 図3B）の侵襲性を減少させることを観察した。 indu-CONT shRNAを含む細胞（ 図3C）、この効果を示さなかった間、ウェスタンブロット分析は、indu-YY1のshRNAとMDA-MB-231細胞におけるドキシサイクリン誘導性YY1サイレンシングを確認した。我々は、使用される異種移植片マウスモデル研究のためのこれらの細胞。対照群に比べ、indu-YY1のshRNAとMDA-MB-231細胞に移植し、Dox非含有水に付属のマウスは（ 図4B生物発光（ 図4A）によって可視化したときに減少し、腫瘍形成を示し、腫瘍重量によって決定される。）これらの異種移植腫瘍におけるYY1サイレンシングは、 図4Cに示すように、ウェスタンブロット研究によって確認された。

図1。 shRNAをコンストラクトおよびshRNAの転写を生成するための模式図。プライマーP1、P6には、（例えば、シーケンスについては表1を参照）が表示されます。ポルIII：RNAポリメラーゼIII（D）：消化終了。図面は縮尺することではありません。 拡大画像を表示するには、ここをクリック 。

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図2。 （A）レンチウイルスベクターと遺伝子サイレンシングのために使用テトオン誘導H1プロモーターの（B）のメカニズムの模式図を示します 。レンチウイルスベクターは、pLL3.7 ¹⁴に基づいて再建された。 H1-PR：H1プロモーター; UBC-PR：ヒトユビキチンCプロモーター;ピューロ：ピューロ、TRE：テトラサイクリン応答エレメント、ドキシサイクリン：ドキシサイクリン。 TetR：テトラサイクリンレギュレータ。 5'LTR、3'SIN-LTRとWREは、レンチウイルスベクター¹⁴の不可欠なコンポーネントです。

図3。ドキシサイクリン誘導性サイレンシングYY1とMDA-MB-231細胞の侵襲性に及ぼす影響 。 tetra-の異形発現するクローン1と3のPLU-ピューロ-Indu-YY1のshRNAレンチウイルスによって感染し、Doxの非存在下および存在下で培養由来の2つのポリクローナルな細胞集団では、A. YY1レベル。誘導性のshRNAとMDA-MB-231細胞のB.ボイデンチャンバーアッセイ。 （* P <0他の3つのグループ対0.05）。これら4つの細胞集団でYY1の発現C.描写ウェスタンブロット。

図4。 MDA-MB-231細胞による異種移植腫瘍形成の誘導YY1サイレンシングの効果 。細胞移植（左）と4週（右）後の細胞接種でIVISイメージングシステムによってキャプチャされた代表的な生物発光画像のA.模式図。 B. 4週間で異種移植腫瘍の重み。 * P≤0.05。 C.ウェスタンブロットおよびYY1のDoxの非存在下および存在下でindu-YY1のshRNAとMDA-MB-231細胞の異種移植片におけるβ-アクチン発現。上のラベルは、個々のマウスの名前です。

表1。 shRNAコンストラクトを生成する際に使用される合成オリゴヌクレオチド。マウスU6とTet-Onの誘導ヒトH1プロモーターのP1とP6のシーケンスが用意されています。人間のYY1はGGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T.のshRNAの標的配列とYY1に特異的な配列がハイライトされている例として使用されます。 YY1の2枚のP2配列は、それぞれ、2つのプロモーターに設計されています。構成U6 / YテトオンH1/YY1は、このプロトコルで使用されていながら、Y1 shRNAは、以前は¹⁵記述されていた。 P5は、ベクトル固有であり、pLL3.7 ¹⁴のシーケンスが表示されます。制限酵素の配列は、配列がPCR増幅中にプロモーターにアニールしながら、下線が引かれてイタリックされています。

このプロトコルは、shRNAを用いて遺伝子をノックダウンし、in vivoでの腫瘍細胞増殖の生物発光イメージングを使用して、その生物学的効果を可視化する方法について説明します。shRNAのターゲットサイトが使用される3つの制限部位のいずれか（をBamHI、HindIII及びEcoRI）を含めるべきではありませんサブクローニングのために。以下のいずれのサイトが存在するときにまれなシナリオでは、追加の制限酵素は、コンストラクトを生成する際にそれを置き換えるために使用することができます。

このプロトコルのいくつかの重要なステップは、shRNAレンチウイルスベクターの構築をスピードアップします。最初に、U6またはH1プロモーターを含むプラスミドのPCRテンプレートがレンチウイルスベクター（典型的にはアンピシリン）とは異なる抗生物質耐性遺伝子（カナマイシンなど）があります。これはプラスミドテンプレートによって引き起こされる転換の背景を減らすことができます。第二に、 大腸菌コンピを使用する必要がある変換の高効率を持つ大腸菌細胞。カリウムを使用するプロトコルNDマンガンイオンは大腸菌コンピを生成するために使用することができます非常に高い能力¹²と大腸菌細胞。第三に、選択マーカーは、3断片のサブクローニングを容易にすることができます。例えば、レンチウイルスベクターは、PCR断片を挿入することによって置き換えられ、P3/P4のオリゴヌクレオチドを​​アニールされるβ-ガラクトシダーゼの発現カセット（LacZ遺伝子）を含むように設計することができます。 X-galを（5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル-β-D-ガラクト - ピラノシド）にさらされたときに挿入せずに、これらは、青になりながら、このケースでは、挿入した組換えプラスミドは、白色コロニーを形成します。

レンチウイルスベクターと3パッケ​​ージングプラスミドの品質は、効率的なレンチウイルスの生産に不可欠である。リン酸カルシウム沈殿を使用して非常に経済的かつ効率的なトランスフェクション法が提供されています。ポリエチレンイミン¹³またはほとんどの市販のトランスフェクション試薬は、レンチウイルスの生産に使用することもできます。適切なMOI FOを使用するにはRの感染は、それが生産レンチウイルスの力価を決定することが重要です。

すべての実験群のマウスは、異種移植片腫瘍イメージングの間に生物発光の変化を引き起こす可能性があり、その概日リズムの違いを排除するために同じ部屋に収容する必要があります。マウスの安楽死のアプローチは、イソフルランによるCO ₂窒息と過剰摂取を含め、制度のACUCによって承認されるべきである。