ADN vecteur basé sur l'interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

1. Génération de constructions shRNA

1. Identifier une séquence siRNA-cible (20-23 nucléotides) sur la base de critères préalablement publiés ⁶ ou utiliser un serveur algorithme basé sur le Web, tels que "Finder cible siARN" de Ambion et GenScript.
2. Synthétiser des oligonucléotides basés sur la conception de séquences Figure 1 et par exemple dans le tableau 1. Effectuer l'amplification par PCR en utilisant le P1 et P2 oligonucléotides (30 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 secondes, un recuit à 60 ° C pendant 30 sec, et élongation à 72 ° C pendant 30 secondes) et un plasmide portant le U6 ou H1 promoteur en tant que modèle. Purifier le produit PCR en utilisant une colonne de purification PCR. Digérer par BamHI et HindIII et purifier l'ADN digéré en utilisant une colonne de purification de PCR. Recuire le P3 et P4 oligonucléotides (2,5 pmol / ul de chaque dans 100 ul de 50 mM Tris HCl •, pH 8,0) en faisant bouillir pendant 5 minutes et refroidir lentement à température ambiante. Soumettre une lentiviral vecteur, tel que celui décrit dans la figure 2A, par BamHI et EcoRI, et effectuer un gel de purification.
3. Effectuer une ligature 3-fragment avec le fragment BamHI / vecteur digéré par EcoRI, un fragment BamHI / HindIII-digéré par PCR et une paire d'oligonucléotides recuit (former sites HindIII et EcoRI aux deux extrémités) à un rapport molaire 01:10:10 (Figure 1).
4. Transformez très efficace compétente E. des cellules de E. DH5a utilisant le produit ligaturé. Cribler les colonies en utilisant les oligonucléotides P5 dans le vecteur () et P6 (dans le promoteur H1 ou U6). ⁷
5. Préparer l'ADN plasmidique des colonies positives avec un kit commercial et de confirmer la présence de l'insert par BamHI / EcoRI la digestion et l'ADN d'agarose électrophorèse. Séquence la région contenant le promoteur et shRNA utilisant l'oligonucléotide P5.
6. Utilisez le plasmide d'ADN ou de Midi-Maxi-préparation des kits (sans endotoxine est préférable) pour préparer l'ADN lentivirus portant l'expression shRNACassette. Déterminer la concentration en ADN en mesurant l'absorption à 260 nm. Vérifiez la pureté de l'ADN en utilisant le ratio 260 nm/280 nm et assurez-vous qu'il tombe dans la gamme de 1,8 à 2,0. Vérifier l'intégrité des lentivirus plasmide par électrophorèse sur gel d'agarose. ADN pour la transfection doit être super-enroulé.

2. La transfection lentivirus

Précautions: Les vecteurs lentiviraux sont tirées de l'immunodéficience humaine virus-1 (VIH-1) et la réplication du génome incompétent. Ils ont été largement utilisés dans la prestation de gène à cause de la capacité d'infecter à la fois la division et non la division des cellules. Cependant, deux risques majeurs existent dans les études utilisant des lentivirus. (1) Le potentiel de génération de compétent pour la réplication des lentivirus. Ce risque peut être considérablement réduit si le système de troisième génération lentiviral est utilisé. (2) Le potentiel de l'oncogenèse. Ce risque peut être aggravé si les inserts sont transportés, sont oncogènes ou de réprimer des suppresseurs de tumeurs.Les activités de recherche impliqués dans le VIH basé sur des lentivirus doivent suivre les "Considérations en matière de biosécurité pour la recherche avec des vecteurs lentiviraux" du NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) et nécessitent l'approbation du comité de biosécurité de l'établissement d'un chercheur. En règle générale, le renforcement de la biosécurité de niveau 2 (BSL-2) de confinement est nécessaire pour la mise en laboratoire si des vecteurs lentiviraux sont utilisés.

1. Planche 4 × 10 ⁶ cellules 293T avec HEK DMEM complet (DMEM fourni avec 10% de sérum bovin foetal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine) dans 10 cm plats et de la culture du jour au lendemain à 37 ° C dans une 5% incubateur à CO _2. Remplacez le support avec 5 ml de la pré-chauffée Opti-MEM I Réduction Sérum médias (Invitrogen).
2. Préparer la solution A: 10 ug de shRNA contenant un vecteur lentiviral, 5 ug chacun des géné troisièmeplasmides ation lentivirus emballage (préparé avec une grande pureté; les trois plasmides d'emballage comprennent VSV-G: pour une protéine d'enveloppe, pRSV-Rev: rev, et pMDLg / pRRE: pour gag / pol, qui sont essentiels pour l'emballage de lentivirus), 36 ul de CaCl ₂ 2M, et 300 ul d'eau stérile.
3. Préparer la solution B: 300 pi de 2 × Hepes une solution saline tamponnée (281 mM NaCl, 100 mM d'HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH ajusté à 7,12 par NaOH 0,5 N et stérilisé par filtre de 0,22 um).
4. Lentement goutte de solution A dans la solution B tout en faisant barboter de l'air grâce à la solution B avec une pipette. Laisser le tube à température ambiante pendant 30 min.
5. Baissez lentement les solutions mixtes A / B dans le plat HEK 293T culture cellulaire préparée à l'étape 2.1 et incuber à 37 ° C dans un 5% de CO ₂ incubateur pendant 4-6 h.
6. Remplacez le support avec 7 ml de milieu DMEM complet. Après 24 h, ajouter 5 ml de milieu DMEM complet. Récolter les cont moyennesAining le lentivirus après l'autre les 24 h de la culture.
7. Faites tourner la moyenne à 1.500 tours par minute, la température ambiante pendant 10 min. Filtrer le surnageant à l'aide d'un filtre de 0,45 um et tourner la accréditives milieu contenant le lentivirus par ultracentrifugation à 25,000 rpm (égal à 125.000 × g avec un rotor SW28 seau balancer, Ultracentrifugeuse Beckman XL-90), 4 ° C pendant 90 min. Décanter le surnageant dans un récipient avec l'eau de Javel à 5% (concentration finale).
8. Reprendre le culot lentivirus dans 0,5-1,0 ml de PBS froid et faire des aliquots lentivirus dans 50-100 ul par tube. Rangez-les à -80 ° C.
9. Le titre de la lentivirus peuvent être déterminées par les kits commerciaux (tels que Kit QuickTiter quantification Lentivirus de Biolabs cellulaires, Inc), par un protocole PCR en temps réel ^8, ou par la détermination du marqueur fluorescent co-exprimé par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux . Typiquement, une boîte de culture de 10 cm peut produire environ 0,5-1,0 × 10 ⁸ infectionsunités infectieuses (UI).

3. Maladies infectieuses et la caractérisation des cellules infectées

1. Ensemencer les cellules d'être infectées dans 2 ml de milieu complet dans une plaque à 6 puits avec une confluence de 30-40% (environ 5-8 × 10 ⁵ cellules, en fonction de la taille des cellules). Culture des cellules pendant la nuit à 37 ° C dans un 5% de CO ₂ incubateur.
2. Remplacez le support avec 1 ml de milieu frais contenant 8 pg / ml de polybrène (Sigma, Cat # H9268) ou 5 ug / ml de protamine (Sigma, Cat # P4020).
3. Déterminer une multiplicité convient d'infection (MOI) compris entre ^{9 et} pour une lignée cellulaire particulière à l'aide de lentivirus avec marqueur fluorescent. Calculer ou déterminer empiriquement la quantité de lentivirus à être utilisé pour infecter la lignée cellulaire. Baissez lentement le lentivirus dans la plaque et secouez-la délicatement pendant 10 secondes.
4. Incuber la plaque à 37 ° C dans un 5% de CO ₂ incubateur pendant 6 h, puis remplacer le milieu par du milieu complet normal.
5. Au moins deux days après l'infection, vérifier les cellules en utilisant la microscopie à fluorescence pour lentivirus exprimant des marqueurs fluorescents et / ou ajouter l'antibiotique correspondant à la moyenne des vecteurs lentiviraux exprimant des gènes de résistance aux antibiotiques. Pour un vecteur inductible, tel qu'un Tet-Le système (figure 2), la culture des cellules dans un milieu préparé avec de la tétracycline sans FBS. Fractionner les cellules 2-3 jours après l'infection. Prendre une partie des cellules à tester inactivation génique inductible par les cultiver dans un milieu alimenté avec et sans 1,5 ug / ml de doxycycline (Dox) pendant au moins 2 jours.
6. Vérifiez la inactivation génique par transfert de Western, Real-Time PCR ou immunohistochimie ≥ 2 jours après l'infection, 2 jours après le choix des antibiotiques, ou (pour un système inductible Tet-On) ≥ 2 jours après l'addition Dox.
7. Utiliser des approches différentes (telles que des tests de prolifération cellulaire, mous études de la culture sur gélose, des tests de migration, des tests d'invasion et d'études de formation de tumeurs) afin de déterminer les effets de la kn gène cibleockdown sur la malignité des cellules.

4. Xénogreffes Étude modèle de souris

1. Nettoyez toutes les surfaces pour l'anesthésie de la souris et d'injection par l'éthanol à 70% pour prévenir l'infection des souris. Anesthésier souris nues athymiques (NCI-Frederick) en utilisant 2% d'isoflurane mélangé avec l'oxygène dans une chambre de l'induction d'anesthésie 10 min avant l'inoculation des cellules. Maintenir l'anesthésie en utilisant 1% d'isoflurane mixte avec de l'oxygène à travers un cône de nez. Effectuer cette étape dans une chambre avec une excellente ventilation et fixer des filtres au trésor isoflurane à la chambre d'induction.
2. Propager les cellules porteuses de shRNA. Utilisez la tétracycline milieu sans pour Tet-On vecteurs inductibles. Trypsiniser les cellules et les remettre en suspension dans un milieu complet contenant 50% de Matrigel. Placez les souris nude sur un coussin chauffant (30 ° C) et d'injecter 200 pi des cellules (1-10 × 10 ^6, en fonction de la malignité des cellules) dans les souris avec 1-2 points d'injection par la souris. Utiliser des seringues avec 25.5-aiguilles de calibre pour injections sous-cutanées, et des aiguilles de calibre 28-30 pour les injections orthotopique.
3. Pour les vecteurs shRNA constitutifs, utiliser 2 groupes de souris injectées avec des cellules exprimant le gène cible et un shRNA brouillés shRNA. Pour Tet-On vecteurs inductibles shRNA, utiliser 4 groupes de souris injectées avec des cellules porteuses du gène cible et un shRNA brouillés shRNA, fourni avec de l'eau normale et Dox (1,5 mg / ml) contenant de l'eau (2 × 2 shRNA traitements = 4 groupes) . Remplacer l'eau Dox contenant deux fois par semaine.
4. Surveiller la longueur et la largeur des tumeurs hebdomadaires ou bihebdomadaires par un pied à coulisse numérique vernier et calculer les volumes tumoraux (V) par la formule V = 1/2 (longueur x largeur ^{2) 10.} Assurez-vous que le volume tumoral ne dépasse pas les lignes directrices de l'ACUC institutionnels (tels que, 10% du poids du corps). Euthanasier tout de la souris en utilisant un protocole approuvé par l'ACUC institutionnelle si elle montre quelque signe d'ulcération ou de nécrose extensive, Infectio évidenten, un saignement incontrôlé ou en phase terminale de maladie.
5. La croissance tumorale et les métastases peuvent être surveillés pour les cellules tumorales exprimant une inoculés bioluminescente marqueur ^11, tel que la luciférase Firefly. Nettoyez toutes les surfaces pour l'anesthésie de la souris et l'imagerie par l'éthanol à 70% pour prévenir l'infection des souris. Anesthésier les souris, comme décrit à l'étape 4.1. Injecter luciférine (150 mg / kg) par voie intrapéritonéale. Placez la souris dans une chambre d'imagerie désinfectés d'un système d'imagerie commerciale, comme un système d'imagerie IVIS (Caliper Life Sciences, Inc.) Mettez le levier de l'anesthésie pour maintenir l'anesthésie par isoflurane 1% mélangé avec l'oxygène. Effectuer cette étape dans une chambre avec une excellente ventilation.
6. Prendre la première image en exposant 5 min et vérifier son intensité de signal. Réglez le temps d'exposition pour obtenir des images avec un signal optimal par rapport au fond. Déterminer le temps d'imagerie empiriquement, qui est généralement 1-5 min pour les tumeurs sous-cutanées.
7. Euthanasier les souris par un protocole approuvépar le ACUC institutionnelle lorsque les tailles tumorales atteindre environ 1.000 mm ^3, ou comme spécifié par les directives ACUC. Accise tumeurs de la xénogreffe, les peser et de prendre des photos. Traiter les échantillons de tumeurs pour différentes études, telles que les analyses pathologiques afin de déterminer la morphologie des cellules tumorales, et Western blot et Real-Time PCR études pour tester l'expression des gènes.

5. Les résultats représentatifs

Ce protocole a été utilisé pour étudier les effets de YY1 knockdown sur la formation de tumeurs de xénogreffe de la luciférase de luciole-exprimant MDA-MB-231 cellules (cellules humaines d'adénocarcinome du sein; Caliper Life Sciences) dans des souris nues athymiques. La séquence cible shRNA de la YY1 humain est «GGG AGC AGG AGA AGC TGC AGA T". Une séquence brouillés "GGG ACT LOI SUR LES CTA CGT TTA CAT T" a également été créé pour un contrôle (suite) shRNA, qui n'avait pas une similarité significative à toute transcription connu. Les oligonucléotides utilisés pour fabriquer Tet-On constructions shRNA inductibles, avec YY1 comme un exemple, Sont indiqués dans le tableau 1. En conséquence, deux vecteurs lentiviraux, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA et PLU-Puro-Indu-cont shRNA, ont été construits et ils ont été utilisés pour produire des lentivirus. Nous avons utilisé ces lentivirus individuellement infecter deux clones de cellules MDA-MB-231 (clones 1 et 3) exprimant à la fois régulateur de la tétracycline (TetR) et la luciférase Firefly. Populations cellulaires polyclonaux ont été obtenus après sélection à la puromycine. Figure 3A montre Dox induite par effet de choc dans ces YY1 MDA-MB-231 cellules infectées par plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Nous avons ensuite utilisé les cellules polyclonaux de clone 3 infectés individuellement par ces inductible YY1 shRNA et cont lentivirus shRNA et a observé que l'appauvrissement de YY1 réduite caractère invasif de cellules MDA-MB-231 cellules (figure 3B). Western Blot a confirmé Dox-induite YY1 silence dans MDA-MB-231 cellules avec le shRNA indu-YY1, tandis que les cellules contenant indu-cont shRNA ne présentent pas cette caractéristique (figure 3C). Nous avons ensuite utilisé ces cellules pour l'étude du modèle de la souris de xénogreffe. Par rapport aux groupes témoins, les souris implantées par les cellules MDA-MB-231 avec indu-YY1 shRNA et fourni avec Dox contenant de l'eau a montré réduit la formation de tumeurs, quand visualisées par bioluminescence (figure 4A) et déterminé par des poids tumorales (figure 4B ). YY1 silence dans ces tumeurs de xénogreffe a été confirmé par des études de Western blot présentés dans la figure 4C.

Figure 1. Schéma pour la génération d'une construction shRNA et la transcription shRNA. Le P1 à P6 amorces sont indiquées (voir le tableau 1 pour les séquences, par exemple). Pol III: l'ARN polymérase III (d):. Fin digéré. Le dessin n'est pas à l'échelle. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 2. Schémas de (A) un vecteur lentiviral et (B) le mécanisme de la Tet-On promoteur H1 inductible utilisé pour le silençage génique. Le vecteur lentiviral a été reconstruit sur ​​la base de pLL3.7 ^14. H1-Pr: promoteur H1; Ubc-Pr: Human promoteur de l'ubiquitine C; Puro: puromycine; TRE: élément de réponse à la tétracycline; Dox: la doxycycline. TetR: régulateur de tétracycline. 5'LTR, 3'SIN-LTR et WRE sont des composantes essentielles d'un vecteur lentiviral ^14.

Figure 3. Dox-induite silence YY1 et son effet sur ​​envahissant du MDA-MB-231 cellules. A. YY1 niveaux dans deux populations de cellules polyclonaux dérivés de TetR exprimant clones 1 et 3 infectées par plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus et cultivées en l'absence et la présence de Dox. B. chambre de Boyden dosage de MDA-MB-231 cellules avec shRNA inductibles. (* P <00,05 par rapport aux autres groupes de trois). C. Représentant Western blots de YY1 expression dans ces populations de cellules. Quatre

Figure 4. Effets de la YY1 induite silence sur la formation de tumeurs par xénogreffe MDA-MB-231 cellules. A. Schéma de principe d'implantation de cellules (à gauche) et représentatives images bioluminescentes capturées par le système d'imagerie IVIS moins 4 semaines (à droite) inoculation cellule post. Poids B. tumorales xénogreffe moins 4 semaines. * P ≤ 0,05. C. occidentaux taches de YY1 et β-actine expression dans des xénogreffes de cellules MDA-MB-231 cellules avec indu-YY1 shRNA en l'absence et la présence de Dox. Les étiquettes apposées sur la partie supérieure sont les noms de chaque souris.

Tableau 1. Oligonucléotides synthétisés utilisés pour générer des constructions shRNA. P1 et P6 séquences pour le U6 souris et Tet-On promoteurs inductibles H1 de l'homme sont fournis. Human YY1 est utilisé comme un exemple avec une séquence cible de shRNA GGG AGC AGG AGA AGC TGC T. AGA Les séquences spécifiques à YY1 sont mis en évidence. Deux séquences de P2 YY1 sont conçus pour les deux promoteurs, respectivement. Le constitutive U6 / YY1 shRNA a été décrit précédemment ^15, tandis que le Tet-On H1/YY1 a été utilisé dans ce protocole. P5 est un vecteur-spécifique et la séquence d'pLL3.7 ¹⁴ est représenté. Les séquences d'enzymes de restriction sont soulignés, tandis que les séquences de recuire les promoteurs pendant l'amplification par PCR sont en italique.

Ce protocole décrit une méthode pour abattre un gène à l'aide shRNA et de visualiser son effet biologique en utilisant l'imagerie bioluminescente de la croissance des cellules tumorales in vivo. Le site cible d'un shRNA ne doit contenir aucun des trois sites de restriction (BamHI, HindIII et EcoRI) utilisé pour sous-clonage. Dans un scénario rare lorsque l'un quelconque de ces sites est présent, une enzyme de restriction supplémentaire peut être utilisée pour la remplacer dans la génération de la construction.

Plusieurs étapes clés de ce protocole permettra d'accélérer la construction de vecteurs lentiviraux shRNA. La première, la PCR matrice de plasmide contenant l'U6 ou promoteur H1 peut avoir un gène de résistance antibiotique différent (par exemple la kanamycine) à partir du vecteur lentiviral (typiquement ampicilline). Cela peut réduire le fond de la transformation provoquée par le modèle de plasmide. Deuxièmement, il est nécessaire d'utiliser compétente E. des cellules de E. avec des rendements élevés de transformation. Un protocole utilisant une de potassiumdes ions manganèse nd peut être utilisé pour produire compétente E. des cellules de E. ayant des compétences très élevé ^12. Troisièmement, un marqueur de sélection peut faciliter la sous-clonage 3-fragment. Par exemple, un vecteur lentiviral peut être modifié pour contenir une cassette d'expression pour β-galactosidase (LacZ) qui sera remplacé par l'insertion du fragment PCR et recuit P3/P4 oligonucléotides. Dans ce cas, plasmides recombinants avec des inserts formeront des colonies blanches, tandis que ceux-ci sans les inserts sera bleu, lorsqu'ils sont exposés à X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside) .

La qualité de vecteurs lentiviraux et les trois plasmides d'emballage est essentielle à la production de lentivirus efficace. Une méthode de transfection très économique et efficace en utilisant la précipitation au phosphate de calcium a été fourni. Réactifs de transfection polyéthylèneimine ¹³ ou plus commerciale peut également être utilisé dans la production de lentivirus. Pour utiliser un bon MOI fol'infection r, il est important de déterminer les titres de lentivirus produit.

Des souris de tous les groupes expérimentaux devraient être logés dans la même pièce pour éliminer leur différence rythme circadien qui peut provoquer une variation de la bioluminescence lors de l'imagerie des tumeurs de xénogreffe. Approches de l'euthanasie de la souris comprennent le CO ₂ asphyxie et de surdose par isofluorane et doit être approuvé par l'ACUC institutionnelle.