DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

1. Geração de Construções shRNA

1. Identificar uma seqüência de siRNA-alvo (20-23 nucleotídeos) com base em critérios previamente publicados, ⁶ ou usar um servidor de algoritmo baseado na web, como o "Finder alvo siRNA" de Ambion e GenScript.
2. Sintetizar oligonucleótidos com base no desenho da Figura 1 e exemplo sequências na Tabela 1. Efectuar a amplificação por PCR usando o P1 e P2 oligonucleótidos (30 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 seg, anelamento a 60 ° C durante 30 seg, e alongamento a 72 ° C durante 30 seg) e um plasmídeo portador do U6 ou H1 promotor como um modelo. Purifica-se o produto de PCR utilizando uma coluna de purificação de PCR. Digerir por BamHI e HindIII e purificar o ADN digerido usando uma coluna de purificação de PCR. Recozer o P3 e P4 oligonucleótidos (2,5 pmol / uL de cada uma em 100 uL de 50 mM de Tris • HCl, pH 8,0) por ebulição durante 5 min e arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. Digerir um vec lentiviralTor, tal como o descrito na Figura 2A, por BamHI e EcoRI, e executar gel purificação.
3. Efectuar uma ligação de 3-fragmento com o BamHI / EcoRI-vector digerido, uma BamHI / HindIII digerido com fragmento de PCR e um par de oligonucleótidos hibridados (formando HindIII e locais EcoRI nas duas extremidades) a uma razão molar 1:10:10 (Figura 1).
4. Transforme altamente eficiente E. competente células de Escherichia DH5a utilizando o produto ligado. Rastreio das colónias, usando os oligonucleótidos P5 (no vector) e P6 (no promotor H1 ou U6). ⁷
5. Preparar DNA de plasmídeo a partir das colónias positivas com um kit comercial e confirmar a presença da inserção por BamHI / EcoRI e electroforese digestão de DNA de agarose. Região a sequência contendo o promotor e shRNA usando P5 oligonucleótido.
6. Use plasmídeo de DNA ou Midi-Maxi preparação de kits (-endotoxina livre é preferido) para preparar o DNA lentivírus carregando a expressão shRNAcassete. Determinar a concentração de DNA medindo a absorção a 260 nm. Verificar a pureza de ADN, utilizando o rácio 260 nm nm/280 e certificar-se que cai no intervalo de 1,8 a 2,0. Verifique a integridade lentivírus plasmídeo usando eletroforese em gel de agarose. ADN para transfecção deve ser super-enrolada.

2. Transfection Lentivirus

Precauções: lentivirais são derivadas do vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) do genoma e replicação incompetente. Eles têm sido amplamente utilizados na entrega de genes, devido à capacidade de infectar tanto dividindo e não-células em divisão. No entanto, dois grandes riscos existem nos estudos utilizando lentivírus. (1) O potencial de geração de replicação competente lentivírus. Este risco pode ser muito reduzido se o sistema de geração de terceira lentiviral é usado. (2) O potencial para oncogênese. Este risco pode ser agravado se as inserções realizadas são oncogênicos ou reprimir supressores de tumor.As actividades de investigação envolvidos em HIV baseada lentivírus deve seguir as "considerações de Biossegurança para Pesquisa com lentivirais" do NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) e exigem uma aprovação do Comitê de Biossegurança de instituição de um investigador. Geralmente, reforçada Biossegurança nível-2 (BSL-2) de contenção é necessária para o ambiente de laboratório se lentivirais são utilizados.

1. Placa de 4 × 10 ⁶ HEK 293T células com DMEM completo (DMEM fornecido com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina), em 10 pratos de cultura durante a noite cm e a 37 ° C em um 5% de CO ₂ incubadora. Substituir o meio com 5 ml de pré-aquecida Opti-MEM I reduzido Soro Media (Invitrogen).
2. Preparar Solução A: 10 ug de shRNA contendo vector lentiviral, 5 ug cada um dos Gener terceiroation plasmídeos lentivírus de embalagem (preparado com elevado grau de pureza; os três plasmídeos de empacotamento incluem VSV-G: para uma proteína de envelope, pRSV-Rev: para rev, e pMDLg / pRRE: para gag / pol, que são essenciais para a embalagem lentivírus), 36 ul de 2M _de CaCl2, e 300 uL de água estéril.
3. Preparar Solução B: 300 uL de 2 × Hepes salino tamponado (281 mM de NaCl, 100 mM de HEPES, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4, pH ajustado para 7,12 por NaOH 0,5 N e esterilizado por filtro de 0,22 um).
4. Cair lentamente a solução A na solução B enquanto borbulhar ar através da solução B com uma pipeta. Deixar o tubo à temperatura ambiente durante 30 min.
5. Lentamente deixar cair as soluções mistas A / B para o prato de cultura de células HEK 293T, preparado no passo 2,1 e incubar a 37 ° C em um 5% de CO ₂ incubadora para 4-6 h.
6. Substituir o meio com 7 ml de meio DMEM completo. Após 24 h, adicionar uma 5 ml adicionais de meio DMEM completo. Colha o cont médioaining do lentivírus após a outra 24 h de cultura.
7. Girar o meio a 1.500 rpm, temperatura ambiente durante 10 min. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de 0,45 uM e girar o fluxo através meio contendo o lentivírus por ultracentrifugação a 25.000 rpm (igual a 125.000 x g com um rotor SW28 balde oscilante, ultracentrífuga Beckman XL-90), 4 ° C durante 90 min. Decantar o sobrenadante para um recipiente com lixívia a 5% (concentração final).
8. Ressuspender o sedimento em lentivírus 0,5-1,0 ml de PBS frio e fazer alíquotas lentivírus em 50-100 ul por tubo. Armazená-los a -80 ° C.
9. O título do lentivírus pode ser determinada por kits comerciais (tais como QuickTiter Kit Quantificação Lentivirus a partir de células Biolabs, Inc.), por uma PCR em tempo real protocolo ^8, ou por determinação do marcador co-expressa fluorescente utilizando microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo . Normalmente, um prato de cultura 10 centímetros, pode produzir cerca de 0,5-1,0 × 10 ⁸ infecçãounidades infecciosas (IU).

3. Infecção e Caracterização de células infectadas

1. De sementes as células a serem infectadas em 2 ml de meio completo em uma placa de 6 poços com confluência de 30-40% (cerca de 5-8 x 10 ⁵ células, dependendo tamanhos de células). Cultura das células durante a noite a 37 ° C em um 5% de CO ₂ incubadora.
2. Substituir o meio com 1 ml de meio fresco contendo 8 ug / ml de polibreno (Sigma, Cat # H9268) ou 5 ug / ml de protamina (Sigma, Cat # P4020).
3. Determinar uma multiplicidade adequada de infecção (MOI) Gama de ⁹ para uma linha de células particular usando lentivírus com marcador fluorescente. Calcular ou determinar empiricamente a quantidade de lentivírus a ser utilizado para infectar a linha celular. Lentamente solte o lentivírus na placa e agite-o levemente para 10 seg.
4. Incubar a placa a 37 ° C em um 5% de CO ₂ incubadora durante 6 horas e depois substituir o meio com meio completo normal.
5. Pelo menos duas days após a infecção, verificar as células por microscopia de fluorescência para lentivírus que expressam marcadores fluorescentes e / ou adicionar o antibiótico correspondente ao meio para lentivirais que expressam os genes de resistência a antibióticos. Para um vector indutível, tal como um Tet-On sistema (Figura 2) cultura, as células em meio preparado com tetraciclina livre de FBS. Dividir as células 2-3 dias após a infecção. Retirar uma porção das células para testar knockdown gene induzível por cultura em meio de lhes fornecido com e sem 1,5 ug / ml doxiciclina (DOX) para igual ou superior a 2 dias.
6. Verifique o knockdown do gene por Western blot, PCR em Tempo Real ou imunomarcação ≥ 2 dias após a infecção, 2 dias após a seleção de antibióticos, ou (para um sistema induzível Tet-On) igual ou superior a 2 dias após a adição Dox.
7. Utilizar abordagens diferentes (tais como ensaios de proliferação celular, estudos de cultura de agar mole, ensaios de migração, ensaios de invasão e estudos formação de tumor) para determinar os efeitos do gene alvo knockdown sobre a malignidade das células.

4. Estudo de Modelo xenoenxerto Rato

1. Limpe todas as superfícies de estetização do mouse e injeção de etanol a 70% para prevenir a infecção de camundongos. Anestesiar ratinhos nus atímicos (NCI-Frederick) usando 2% de isoflurano misturado com oxigénio em uma câmara de indução de anestesia 10 min antes da inoculação das células. Manter a anestesia com isoflurano a 1% misturado com oxigénio através de um cone de nariz. Realizar esta etapa em uma sala com excelente ventilação e anexar filtros de catadores isoflurano para a câmara de indução.
2. Propagar as células que carregam shRNAs. Use tetraciclina meio livre para Tet-On vetores induzíveis. Trypsinize as células e ressuspender-los em meio completo contendo 50% de Matrigel. Posicionar os ratinhos nus sobre uma almofada de aquecimento (30 ° C) e injectar 200 uL das células (1-10 × 10 ^6, dependendo da malignidade das células) para os ratinhos com 1-2 locais de injecção por rato. Usar seringas com 25.5-gauge agulhas para injecções subcutâneas, e agulhas de calibre 28-30 para injeções ortotópico.
3. Para vectores constitutivos Lentivirus, utilizar 2 grupos de ratinhos injectados com as células que expressam o gene alvo e uma shRNA shRNA mexidos. Para Tet-On vectores Lentivirus indutíveis, utilizam 4 grupos de ratinhos injectados com células que transportam o gene alvo e uma shRNA shRNA mexidos, fornecido com água normal e Dox (1,5 mg / ml) contendo água (2 × 2 shRNAs tratamentos = 4 grupos) . Substitua a água Dox contendo duas vezes por semana.
4. Monitorar o comprimento e largura dos tumores semanais ou quinzenais por um vernier paquímetro digital e calcular os volumes tumorais (V) por fórmula V = 1/2 (comprimento x largura ^{2) 10.} Assegure-se que o volume do tumor não exceda as orientações do ACUC institucional (tais como, 10% do peso do corpo). Euthanize qualquer rato usando um protocolo aprovado pelo ACUC institucional se mostra qualquer sinal de ulceração ou necrose extensa, Infectio óbvion, sangramento descontrolado ou em estágio final da doença.
5. O crescimento tumoral e metástases podem ser monitorizados para as células tumorais que expressam inoculados um marcador bioluminescente ^11, tal como luciferase de pirilampo. Limpe todas as superfícies de estetização do mouse e imagem por etanol 70% para prevenir a infecção de camundongos. Anestesiar os ratos tal como descrito no passo 4.1. Injectar luciferina (150 mg / kg) por via intraperitoneal. Colocar os ratos em uma câmara de imagem desinfectados de um sistema de imagem comercial, tal como um sistema de imagem IVIS (Caliper Life Sciences, Inc.). Ligue o alavanca anestesia para manter a anestesia por 1% de isoflurano misturado com oxigénio. Realizar este passo em uma sala com excelente ventilação.
6. Tome a primeira imagem, expondo 5 min e verificar a intensidade do sinal. Ajustar o tempo de exposição para obtenção de imagens com o sinal óptima contra fundo. Determinar o tempo de imagiologia empiricamente, que é geralmente 1-5 min para os tumores subcutâneos.
7. Euthanize os ratos por um protocolo aprovadopelo ACUC institucional quando os tamanhos dos tumores atingem cerca de 1.000 mm ^3, ou conforme especificado nas orientações ACUC. Ressecção de tumores do xenoenxerto, pesá-los e tirar fotos. Processar as amostras tumorais para estudos diferentes, tais como as análises patológicas para determinar a morfologia das células do tumor, e por Western Blot e estudos PCR em tempo real para testar a expressão do gene.

5. Os resultados representativos

Este protocolo foi utilizado para estudar os efeitos de YY1 knockdown sobre a formação de tumor xenoenxerto de que expressam a luciferase do pirilampo-MDA-MB-231 células (células de adenocarcinoma de mama humano; Caliper Life Sciences) em ratinhos nus atímicos. A sequência alvo shRNA de YY1 humano é "GGG AGA AGC AGC AGG TGC AGA T". Uma seqüência embaralhada "GGG ACT ACT CTA ATT CGT CAT T" também foi criado para um controle (cont) shRNA, que não tem similaridade significativa para qualquer transcrição conhecido. Os oligonucleótidos usados ​​para fazer Tet-On construções Lentivirus indutíveis, com YY1 como um exemplo, São apresentados na Tabela 1. Como resultado, dois lentivirais e PLU-Puro-Indu-YY1 Lentivirus e PLU-Puro-Indu-cont shRNA, foram construídos e eles foram usados ​​para produzir lentivírus. Utilizou-se estes lentivírus para infectar individualmente dois clones MDA-MB-231 de células (clones 1 e 3) que expressam tanto regulador tetraciclina (tetR) e luciferase do pirilampo. Populações de células policlonais foram obtidos após a selecção de puromicina. 3A Figura mostra Dox induzida knockdown YY1 nestes MDA-MB-231 células infectadas por lentivírus shRNA PLU-Puro-Indu-YY1. Utilizou-se as células do clone 3 policlonais infectadas individualmente por estes induzível YY1 shRNA e lentivírus cont Lentivirus e observaram que a depleção YY1 reduzida invasividade de MDA-MB-231 células (Figura 3B). As análises de Western blot confirmou Dox induzida silenciamento YY1 em MDA-MB-231 células com o shRNA indu-YY1, enquanto que as células que contêm indu-cont shRNA não mostraram este efeito (Figura 3C). Em seguida, utilizado estas células para o estudo do rato modelo xenoenxerto. Em comparação com os grupos de controlo, os ratinhos implantados pelas células MDA-MB-231 com indu-YY1 shRNA e fornecido com Dox contendo água mostrou reduzida formação de tumores, quando visualizada por bioluminescência (Figura 4A) e determinado por pesos tumorais (Figura 4B ). YY1 silenciamento nestes tumores xenograft foi confirmada por estudos de Western blot mostrados na Figura 4C.

Figura 1. Diagrama esquemático para a geração de um construto shRNA e transcrição shRNA. O P1 iniciadores para P6 são mostradas (ver Tabela 1 para sequências, por exemplo). Pol III: RNA polimerase III (d):. Final digerido. O desenho não está em escala. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Figura 2. Diagramas esquemáticos de (A) um vector lentiviral e (B) o mecanismo do Tet-On promotor indutível H1 utilizado para silenciamento do gene. O vector lentiviral foi reconstruída com base em pLL3.7 ^14. H1-Pr: H1 promotor; Ubc-Pr: Human promotor da ubiquitina C; Puro: puromicina; TRE: Tetraciclina elemento sensível; Dox: doxiciclina. TetR: regulador de tetraciclina. 5'LTR, 3'SIN-LTR e WRE são componentes essenciais de um vetor de ¹⁴ lentiviral.

Figura 3. Dox induzida silenciamento YY1 e seu efeito sobre a capacidade de invasão de MDA-MB-231 células. A. YY1 níveis em duas populações de células policlonais derivados de tetR-expressando os clones 1 e 3 infectados por lentivírus shRNA PLU-Puro-Indu-YY1 e cultivadas na ausência e na presença de Dox. B. Boyden ensaio câmara de MDA-MB-231 células com shRNAs induzíveis. (* P <00,05 versus outros três grupos). C. Representante Western blot de YY1 expressão nestes quatro populações de células.

Figura 4. Efeitos de silenciamento YY1 induzida sobre a formação de tumor xenoenxerto pelo MDA-MB-231 células. A. Diagrama esquemático de implante de células (esquerda) e imagens representativas bioluminescentes capturadas pelo sistema de imagem IVIS menos 4 semanas (à direita) inoculação de células post. B. xenoenxerto pesos tumorais menos 4 semanas. * P ≤ 0,05. C. ocidentais blots de YY1 e β-actina de expressão em xenoenxertos de MDA-MB-231 células com indu-YY1 shRNA na ausência e na presença de DOX. Etiquetas na parte superior são os nomes dos ratos individuais.

Tabela 1. Oligonucleotídeos sintetizados usados ​​na geração de construções de shRNA. P1 e P6 seqüências para o U6 mouse e Tet-On induzíveis promotores H1 humanos são fornecidos. YY1 humano é usado como um exemplo, com uma sequência alvo de shRNA GGG ACG AGA AGC AGG TGC AGA T. As sequências específicas para YY1 são realçados. Duas sequências de P2 do YY1 são concebidos para os dois promotores, respectivamente. O U6 constitutivo / YY1 shRNA foi descrito anteriormente ^15, enquanto que o Tet-On H1/YY1 foi utilizado neste protocolo. P5 é vetor específico e da seqüência de pLL3.7 ¹⁴ é mostrado. As sequências de enzimas de restrição estão sublinhados, enquanto que as sequências de recozimento para os promotores durante a amplificação por PCR estão em itálico.

Este protocolo descreve um método para derrubar um gene usando shRNA e visualizar o seu efeito biológico utilizando imagiologia bioluminescente de crescimento de células tumorais in vivo. O local de destino de um shRNA não deve conter qualquer um dos três locais de restrição (BamHI, HindIII e EcoRI) utilizado para subclonagem. Num cenário raro quando qualquer destes sítios está presente, uma enzima de restrição adicional pode ser utilizada para a substituir na geração do construto.

Vários passos importantes neste protocolo irá acelerar a construção de vetores de Lentivirus shRNA. Em primeiro lugar, o modelo de PCR plasmídeo contendo o promotor U6 ou H1 pode ter um gene de resistência a antibiótico diferente (tais como canamicina) a partir do vector lentiviral (tipicamente ampicilina). Isso pode reduzir o fundo da transformação causada pelo modelo de plasmídeo. Em segundo lugar, é necessário utilizar E. competente células de Escherichia com alta eficiência de transformação. Um protocolo de potássio utilizando umiões nd de manganês pode ser usado para produzir E. competente células de Escherichia com competências extremamente elevadas ^12. Em terceiro lugar, um marcador seleccionável pode facilitar a subclonagem 3-fragmento. Por exemplo, um vector lentiviral pode ser modificado para conter uma cassete de expressão para β-galactosidase (LacZ), que vai ser substituído pela inserção do fragmento de PCR e recozidas P3/P4 oligonucleótidos. Neste caso, os plasmídeos recombinantes com as inserções irá formar colónias brancas, ao passo que estes sem as inserções será azul, quando expostos a X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galacto-piranósido) .

A qualidade da lentivirais e os três plasmídeos de empacotamento é essencial para a produção de lentivírus eficiente. Um método de transfecção muito económico e eficiente utilizando precipitação com fosfato de cálcio foi fornecido. Reagentes de transfecção polietilenimina ¹³ ou mais comercial também pode ser utilizado na produção de lentivírus. Para usar um bom MOI for infecção, é importante para determinar os títulos de lentivírus produzido.

Ratos de todos os grupos experimentais devem ser alojados no mesmo quarto para eliminar a diferença do ritmo circadiano que pode causar variação de bioluminescência durante o exame tumor xenoenxerto. Abordagens de eutanásia mouse incluem asfixia CO ₂ e overdose por isofluorano e deve ser aprovado pelo ACUC institucional.