DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

1. Generazione di costrutti shRNA

1. Identificare un siRNA sequenza-target (20-23 nucleotidi) sulla base di criteri precedentemente pubblicati ⁶ o utilizzare un web server basato su algoritmo, ad esempio "Finder siRNA Target" da Ambion e GenScript.
2. Sintetizzare oligonucleotidi basato sul disegno della Figura 1 e sequenze esempio in Tabella 1. Effettuare amplificazione PCR utilizzando oligonucleotidi P1 e P2 (30 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 sec, ricottura a 60 ° C per 30 sec, e allungamento a 72 ° C per 30 sec) e un plasmide trasportante il U6 o H1 promotore come modello. Purificare il prodotto di PCR utilizzando una colonna di purificazione PCR. Digerire con BamHI e HindIII e purificare il DNA digerito con una colonna di purificazione PCR. Ricuocere il oligonucleotidi P3 e P4 (2,5 pmol / pl di ciascun in 100 pl di 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) mediante bollitura per 5 minuti e lentamente raffreddare a temperatura ambiente. Digerire un lentivirale vector, come quello descritto nella figura 2A, con BamHI e EcoRI, ed eseguire gel-purificazione.
3. Effettuare un 3-ligazione con il frammento BamHI / EcoRI digerito-vettore, un BamHI / HindIII-digerito frammento PCR e una coppia di oligonucleotidi ricotto (formando HindIII e siti EcoRI alle due estremità) ad un rapporto molare 1:10:10 (Figura 1).
4. Trasforma altamente efficiente competente E. coli DH5a utilizzando il prodotto ligato. Schermare le colonie utilizzando gli oligonucleotidi P5 (nel vettore) e P6 (nel promotore H1 o U6). ⁷
5. Preparare DNA plasmidico dalle colonie positive con un kit commerciale e confermare la presenza dell'inserto da BamHI / EcoRI digestione e DNA elettroforesi su agarosio. Sequenza la regione contenente il promotore e shRNA utilizzando oligonucleotide P5.
6. Utilizzare plasmide DNA Midi o Maxi-kit di preparazione (privo di endotossine è preferito) per preparare il DNA lentivirus portando l'espressione shRNAcassetta. Determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbimento a 260 nm. Controllare la purezza del DNA utilizzando il rapporto di 260 nm/280 nm e assicurarsi che rientra nella gamma compresa tra 1,8 e 2.0. Controllare l'integrità lentivirus plasmide mediante elettroforesi su gel di agarosio. DNA per la trasfezione dovrebbe essere super-spirale.

2. Lentivirus Transfection

Precauzioni: vettori lentivirali sono derivati ​​dal virus dell'immunodeficienza umana-1 (HIV-1) e la replicazione del genoma incompetente. Essi sono stati ampiamente utilizzati in gene delivery a causa della capacità di infettare sia divisione e non-divisione delle cellule. Tuttavia, due gravi rischi esistono negli studi che utilizzano lentivirus. (1) Il potenziale per la generazione di replicazione-competenti lentivirus. Questo rischio può essere notevolmente ridotto se il sistema di terza generazione lentivirale viene utilizzato. (2) Il potenziale di oncogenesi. Questo rischio può essere aggravato se gli inserti trasportate sono oncogeno o reprimere soppressori tumorali.Le attività di ricerca coinvolte nel lentivirus HIV-based dovrebbero seguire le "Considerazioni sulla biosicurezza per la ricerca con vettori lentivirali" del NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) e richiedono l'approvazione da parte del Comitato Biosicurezza di istituzione di un ricercatore. Generalmente, maggiore livello di biosicurezza-2 (BSL-2) di contenimento è richiesto per l'impostazione laboratorio se si utilizzano vettori lentivirali.

1. Tavola 4 × 10 ⁶ cellule HEK 293T con DMEM completo (DMEM fornito con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 pg / ml di streptomicina) in 10 cm e piatti di coltura durante la notte a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore. Sostituire il mezzo con 5 ml di pre-riscaldato Opti-MEM ho ridotto siero Media (Invitrogen).
2. Preparare la soluzione A: 10 microgrammi di shRNA contenenti vettori lentivirali, 5 mg ciascuna delle gene terzozione lentivirus plasmidi imballaggio (preparato con elevata purezza, i tre plasmidi di imballaggio comprendono VSV-G: per una proteina di involucro, PRSV-Rev: per rev, e pMDLg / pRRE: per gag / pol, che sono essenziali per l'imballaggio lentivirus), 36 pl di 2M CaCl _2, e 300 pl di acqua sterile.
3. Preparare la soluzione B: 300 microlitri di 2 × Hepes Buffered Saline (281 mM NaCl, 100 mM di HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH regolato a 7,12 per 0,5 N NaOH e sterilizzato di 0,22 um filtro).
4. Lentamente goccia di soluzione A alla soluzione B, mentre bolle d'aria attraverso Soluzione B con una pipetta. Lasciare il tubo a temperatura ambiente per 30 min.
5. Lentamente cadere le soluzioni miste A / B nel piatto di coltura cellulare HEK 293T preparato nella fase 2,1 e incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore per 4-6 h.
6. Sostituire il terreno con 7 ml di terreno DMEM completo. Dopo 24 ore, aggiungere un ulteriore 5 ml di terreno DMEM completo. Raccogliere il cont mediaaining il lentivirus, dopo altre 24 h della cultura.
7. Gira il supporto a 1.500 giri, temperatura ambiente per 10 min. Filtrare il supernatante utilizzando un filtro da 0,45 um e ruotare il flusso attraverso il mezzo contenente lentivirus mediante ultracentrifugazione a 25.000 rpm (pari a 125.000 xg con un rotore SW28 secchio oscillante, ultracentrifuga Beckman XL-90), 4 ° C per 90 min. Decantare il surnatante in un contenitore con il 5% di candeggina (concentrazione finale).
8. Risospendere il pellet lentivirus in 0,5-1,0 ml di PBS freddo e fare aliquote lentivirus in 50-100 ul per provetta. Conservare a -80 ° C.
9. Il titolo del lentivirus può essere determinata kit commerciale (come kit di quantificazione Lentivirus QuickTiter da Biolabs cellulari, Inc.), da una PCR in tempo reale protocollo ^8, oppure determinando la co-espresso marcatore fluorescente mediante microscopia a fluorescenza o citometria di flusso . In genere, uno di 10 cm piatto di coltura in grado di produrre circa 0,5-1,0 × 10 ⁸ infezioniunità infettive (UI).

3. Infezione e caratterizzazione di cellule infette

1. Seme le cellule infettate da in 2 ml di mezzo completo in una piastra da 6 pozzetti con 30-40% di confluenza (circa 5-8 x 10 ⁵ cellule, a seconda delle dimensioni delle celle). Coltivare le cellule notte a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore.
2. Sostituire il mezzo con 1 ml di mezzo fresco contenente 8 ug / ml di polibrene (Sigma, Cat # H9268) o 5 pg / ml di protamina (Sigma, Cat. # P4020).
3. Determinare una molteplicità adeguato di infezione (MOI) intervallo ⁹ per una linea cellulare particolare utilizzando lentivirus con marcatore fluorescente. Calcolare empiricamente o determinare la quantità di lentivirus da utilizzare per infettare la linea cellulare. Lentamente cadere il lentivirus nella piastra e scuoterla delicatamente per 10 sec.
4. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore per 6 ore e quindi sostituire il mezzo normale con mezzo completo.
5. Almeno due days dopo l'infezione, controllare le cellule usando la microscopia a fluorescenza per i lentivirus che esprimono marcatori fluorescenti e / o aggiungere l'antibiotico corrispondente al mezzo di vettori lentivirali che esprimono geni resistenti agli antibiotici. Per un vettore inducibile, ad esempio un sistema Tet-On (figura 2), coltura le cellule a terreno preparato con tetraciclina privo FBS. Dividere le celle 2-3 giorni dopo l'infezione. Prendere una porzione delle cellule per testare knockdown gene inducibile da coltura in terreno con e senza 1,5 pg / ml doxiciclina (Dox) per ≥ 2 giorni.
6. Controllare l'atterramento gene mediante Western blot, Real-Time PCR o immunostaining ≥ 2 giorni dopo l'infezione, 2 giorni dopo la selezione antibiotica, o (per un Tet-On sistema inducibile) ≥ 2 giorni dopo l'aggiunta Dox.
7. Utilizzare approcci diversi, come saggi di proliferazione cellulare, morbide studi di coltura di agar, saggi di migrazione, saggi di invasione e studi formazione del tumore) per determinare gli effetti della kn gene bersaglioockdown sulla malignità delle cellule.

4. Xenotrapianto mouse Studio Modello

1. Pulire tutte le superfici del mouse per anestesia e iniezione di etanolo al 70% per prevenire l'infezione di topi. Anestetizzare topi nudi atimici (NCI-Frederick) usando 2% isoflurano miscelato con ossigeno in anestesia induzione camera 10 min prima della inoculazione delle cellule. Mantenere l'anestesia utilizzando 1% isoflurano misto con l'ossigeno attraverso un cono di naso. Eseguire questo passo in una stanza con un'eccellente ventilazione e montare filtri scavenger isofluorano alla camera di induzione.
2. Propagare le cellule che trasportano shRNAs. Utilizzare tetraciclina terreno privo di Tet-On vettori inducibili. Tripsinizzare le cellule e risospendere in mezzo completo contenente 50% Matrigel. Posizionare i topi nudi su un cuscinetto riscaldante (30 ° C) e iniettare 200 pl delle cellule (1-10 × 10 ^6, a seconda della malignità delle cellule) in topi con 1-2 siti di iniezione per topo. Utilizzare siringhe con 25.5-calibro aghi per iniezioni sottocutanee, e aghi di calibro 28-30 per iniezioni ortotopici.
3. Per costitutivi vettori shRNA, utilizzano 2 gruppi di topi iniettati con le cellule che esprimono il gene bersaglio shRNA e strapazzate shRNA. Per Tet-On vettori shRNA inducibili, utilizzano 4 gruppi di topi iniettati con cellule che portano il gene bersaglio shRNA e criptato shRNA, alimentato con acqua normale e Dox (1,5 mg / ml) contenente acqua (2 × 2 shRNAs trattamenti = 4 gruppi) . Sostituire il Dox acqua contenente due volte la settimana.
4. Monitorare la lunghezza e larghezza dei tumori settimanali o bisettimanali da un nonio calibro digitale e calcolare i volumi del tumore (V) con la formula V = 1/2 (lunghezza x larghezza ^{2) 10.} Assicurarsi che il volume del tumore non superi gli orientamenti del ACUC istituzionale (ad esempio, il 10% del peso corporeo). Euthanize qualsiasi mouse utilizzando un protocollo approvato dalla ACUC istituzionale se mostra segni di ulcerazione o necrosi estesa, infectio evidenten, sanguinamento incontrollato o allo stadio terminale malattia.
5. La crescita tumorale e metastasi possono essere monitorati per le cellule tumorali che esprimono un inoculate bioluminescente marcatore ^11, quale luciferasi di lucciola. Pulire tutte le superfici per anestesia del mouse e di imaging del 70% di etanolo per prevenire l'infezione di topi. Anestetizzare i topi come descritto al punto 4.1. Iniettare luciferina (150 mg / kg) per via intraperitoneale. Mettere i topi in una camera di imaging disinfettata di un sistema di imaging commerciale, come un sistema IVIS Imaging (Caliper Life Sciences, Inc.). Attivare la leva per mantenere l'anestesia anestesia dell'1% isoflurano mescolato con ossigeno. Condurre questa fase in una stanza con un'eccellente ventilazione.
6. Prendere la prima immagine esponendo 5 min e controllare l'intensità del segnale. Regolare il tempo di esposizione per ottenere immagini con segnale ottimale rispetto al fondo. Determinare il tempo di imaging empiricamente, che è generalmente 1-5 min per tumori sottocutanei.
7. Euthanize i topi da un protocollo approvatodal ACUC istituzionale quando le dimensioni del tumore raggiunge circa 1.000 mm ^3, o come specificato dalle linee guida ACUC. Excise tumori lo xenotrapianto, li pesano e scattare foto. Trattare i campioni tumorali di diversi studi, come ad esempio le analisi patologiche per determinare la morfologia delle cellule tumorali, e Western blot e Real-Time PCR per testare studi di espressione genica.

5. Risultati rappresentativi

Questo protocollo è stato utilizzato per studiare gli effetti della YY1 knockdown sul trapianto di formazione del tumore della Firefly luciferasi che esprimono MDA-MB-231 cellule (cellule di adenocarcinoma della mammella; Caliper Life Sciences) in topi nudi atimici. La sequenza bersaglio di shRNA YY1 umana è "GGG AGA AGC AGC AGG TGC AGA T". Una sequenza criptato "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T" è stato creato anche per un controllo (cont) shRNA, che non hanno una somiglianza notevole a qualsiasi trascrizione conosciuto. Gli oligonucleotidi utilizzati per rendere Tet-On costrutti shRNA inducibili, con YY1 come esempio, Sono mostrati nella Tabella 1. Come risultato, due vettori lentivirali, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA e PLU-Puro-Indu-cont shRNA, sono stati costruiti e sono stati utilizzati per la produzione di lentivirus. Abbiamo usato per infettare tali lentivirus singolarmente due MDA-MB-231 cloni cellulari (cloni 1 e 3) che esprimono sia regolatore tetraciclina (tetR) e luciferasi di lucciola. Popolazioni cellulari policlonali sono stati ottenuti dopo la selezione puromicina. Figura 3A mostra Dox indotta YY1 smontabile in questi MDA-MB-231 cellule infettate da plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Abbiamo poi utilizzato le cellule policlonali del clone 3 infettati singolarmente da questi inducibile shRNA YY1 e cont lentivirus shRNA e ha osservato che YY1 esaurimento ridotta invasività della MDA-MB-231 cellule (Figura 3B). Analisi Western Blot ha confermato Dox indotta YY1 silenziamento in MDA-MB-231 cellule con l'indu-YY1 shRNA, mentre le celle che contengono indu-cont shRNA non hanno mostrato questo effetto (Figura 3C). Abbiamo poi usato queste cellule per lo studio xenotrapianto modello murino. Rispetto ai gruppi di controllo, i topi impiantati dalle MDA-MB-231 cellule con indu-YY1 shRNA e fornito con Dox acqua contenente mostrato una ridotta formazione di tumori, quando visualizzato mediante bioluminescenza (Figura 4A) e determinata da pesi tumorali (Figura 4B ). YY1 silenziamento in questi tumori xenotrapianto è stato confermato da studi Western blot mostrato nella figura 4C.

Figura 1. Schema per la generazione di un costrutto shRNA e trascrizione shRNA. Il primer P1 a P6 sono mostrati (vedere Tabella 1 per sequenze esempio). Pol III: RNA polimerasi III (d):. End digerito. Disegno non è in scala. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Figura 2. Diagrammi di (A) un vettore lentivirale e (B) il meccanismo del Tet-On promotore inducibile H1 utilizzato per il silenziamento genico. Il vettore lentivirale stato ricostruito sulla base pLL3.7 ^14. H1-Pr: promotore H1; UBC-Pr: Human promotore di ubiquitina C; Puro: puromicina; TRE: elemento che risponde alle tetracicline; Dox: doxiciclina. TetR: regolatore di tetraciclina. 5'LTR, 3'SIN-LTR e WRE sono componenti essenziali di un ¹⁴ vettori lentivirali.

Figura 3. Dox-indotta YY1 silenzio e il suo effetto sulla invasività della MDA-MB-231 cellule. A. YY1 livelli in due popolazioni cellulari policlonali derivate da TetR-esprimere cloni 1 e 3 infettati da plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus e coltivate in assenza e presenza di Dox. B. Boyden test camera di MDA-MB-231 celle con shRNAs inducibili. (* P <00,05 rispetto agli altri tre gruppi). C. rappresentativi Western blot di YY1 espressione in queste quattro popolazioni di cellule.

Figura 4. Effetti del silenziamento indotto YY1 sulla formazione di tumori trapiantati da MDA-MB-231 cellule. A. Schema di impianto cella (a sinistra) e rappresentativi bioluminescenti immagini catturate dal sistema di imaging IVIS a 4 settimane (a destra) inoculazione delle cellule post. B. pesi tumorali xenotrapianto a 4 settimane. * P ≤ 0,05. C. occidentali blot di YY1 e β-actina di espressione in eterotrapianti di MDA-MB-231 cellule con indu-YY1 shRNA in assenza e presenza di DOX. Le etichette sulla parte superiore sono i nomi dei singoli topi.

Tabella 1. Oligonucleotidi sintetizzati utilizzati per generare costrutti shRNA. P1 e P6 sequenze per la U6 mouse e Tet-On promotori inducibili H1 umani sono forniti. Umana YY1 viene utilizzato come un esempio con una sequenza bersaglio di shRNA GGG AGC AGC AGG AGA AGA TGC T. Le sequenze specifiche di YY1 sono evidenziati. Due sequenze P2 di YY1 sono progettati per i due promotori, rispettivamente. Il costitutiva U6 / YY1 shRNA è stato descritto precedentemente erano ^15, mentre il Tet-On H1/YY1 è stato utilizzato in questo protocollo. P5 è vettoriale specifica e la sequenza di pLL3.7 ¹⁴ è mostrato. Le sequenze di enzimi di restrizione sono sottolineati, mentre le sequenze per temprare i promotori durante l'amplificazione PCR sono in corsivo.

Questo protocollo descrive un metodo per abbattere un gene utilizzando shRNA e visualizzare il suo effetto biologico utilizzando l'imaging bioluminescente di crescita di cellule tumorali in vivo. Il sito bersaglio di un shRNA non dovrebbe contenere uno qualsiasi dei tre siti di restrizione (BamHI, EcoRI e HindIII) utilizzati per subcloning. In uno scenario raro quando uno di questi siti è presente, un enzima di restrizione aggiuntivo può essere utilizzato per sostituirlo nel generare il costrutto.

Diversi passaggi chiave di questo protocollo permetterà di accelerare la costruzione di vettori lentivirali shRNA. In primo luogo, il modello di PCR contenente il plasmide U6 o promotore H1 può avere un gene differente resistenza agli antibiotici (ad esempio kanamicina) dal vettore lentivirale (tipicamente ampicillina). Questo può ridurre il fondo di trasformazione causata dal modello plasmide. In secondo luogo, è necessario utilizzare competente E. coli con elevato rendimento di trasformazione. Un protocollo utilizzando uno di potassiond ioni manganese può essere utilizzato per produrre competente E. coli con competenze estremamente elevate ^12. In terzo luogo, un marcatore selezionabile può facilitare la subclonazione 3-frammento. Ad esempio, un vettore lentivirale può essere progettato per contenere una cassetta di espressione per la β-galattosidasi (LacZ), che sarà sostituito con l'inserimento del frammento PCR e ricotto P3/P4 oligonucleotidi. In questo caso, con i plasmidi ricombinanti inserti formeranno colonie bianche, mentre questi senza gli inserti sarà blu, quando esposto a X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galatto-pyranoside) .

La qualità dei vettori lentivirali e tre i plasmidi di imballaggio è essenziale nella produzione lentivirus efficiente. Un metodo di trasfezione molto economico ed efficiente utilizzando fosfato di precipitazione di calcio è stato fornito. Reagenti di trasfezione polietilenimmina ¹³ o più commerciale può anche essere utilizzato nella produzione lentivirus. Per utilizzare un vero e proprio MOI for infezione, è importante determinare i titoli di lentivirus prodotto.

I topi di tutti i gruppi sperimentali dovrebbero essere alloggiati nella stessa stanza per eliminare la loro differenza del ritmo circadiano che possono causare variazioni della bioluminescenza durante l'imaging del tumore xenotrapianto. Approcci di eutanasia del mouse comprendono CO ₂ asfissia e overdose da isofluorano e dovrebbe essere approvato dal ACUC istituzionale.