DNA Vector-baseret RNA-interferens til Studieinformationen genfunktion i Cancer

1. Generering af shRNA konstruktioner

1. Identificer et siRNA-målsekvens (20-23 nukleotider) baseret på tidligere offentliggjorte kriterier ⁶ eller bruge en web-baseret algoritme server, såsom "siRNA Target Finder" fra Ambion og GenScript.
2. Syntetisere oligonukleotider baseret på udformning i figur 1 og eksempel sekvenserne i tabel 1. Udføre PCR-opformering ved anvendelse af oligonukleotider P1 og P2 (30 cyklusser af denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sek, og forlængende ved 72 ° C i 30 sek) og et plasmid, der bærer U6 eller H1 promotor som skabelon. Oprense PCR-produktet ved anvendelse af en PCR oprensningssøjle. Fordøje det med BamHI og HindIII og oprense det fordøjede DNA under anvendelse af en PCR oprensningssøjle. Annelere oligonukleotider P3 og P4 (2,5 pmol / ul af hver i 100 ul 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) ved kogning i 5 minutter og afkøles langsomt til omgivelsestemperatur. Fordøje en lentiviral VECtor, såsom den beskrevet i figur 2A, med BamHI og EcoRI, og udføre gel-oprensning.
3. Udføre en tre-fragment-ligering med BamHI / EcoRI-fordøjet vektor, en BamHI / HindIII-spaltet PCR-fragment og et par af annealede oligonukleotider (dannelse HindIII og EcoRI-steder ved begge ender) ved en 01:10:10 molforhold (Figur 1).
4. Omdanne højeffektive kompetente E. coli DH5a celler under anvendelse af ligerede produkt. Screene kolonier under anvendelse af oligonukleotiderne P5 (i vektoren) og P6 (i H1 eller U6 promotor). ⁷
5. Fremstilling af plasmid DNA fra de positive kolonier med et kommercielt kit og bekræfte tilstedeværelsen af ​​insertionen af ​​BamHI / EcoRI-fordøjelse og DNA agaroseelektroforese. Sekvens i regionen indeholdende promotoren og shRNA anvendelse af oligonukleotid P5.
6. Anvendes plasmid-DNA Midi-eller Maxi-forberedelsesmateriale (endotoxinfrit foretrækkes) til fremstilling af lentivirus DNA, der bærer shRNA udtrykketkassetten. Bestemmelse af DNA-koncentration ved at måle absorptionen ved 260 nm. Se DNA'et renhed under anvendelse af 260 nm/280 nm forholdet og sikre, at det falder inden for intervallet fra 1,8 til 2,0. Kontroller lentivirus plasmidet integritet under anvendelse af agarosegelelektroforese. DNA til transfektion være super-coiled.

2. Lentivirus Transfection

Forholdsregler: Lentivirale vektorer er afledt af det humane immundefektvirus-1 (HIV-1) genom og replikationsinkompetent. De har været udbredt anvendt i genafgivelse grund af evnen til at inficere både delende og ikke-delende celler. Men to store risici findes i de studier med lentivirus. (1) Potentialet for generering af replikationskompetente lentivirus. Denne risiko kan reduceres betydeligt, hvis den tredje generation lentiviral systemet anvendes. (2) risikoen for onkogenese. Denne risiko kan blive forstærket, hvis de transporteres skær er onkogene eller undertrykke tumorsuppressorer.Forskningsaktiviteterne er involveret i HIV-baserede lentivirus bør følge de "Biosafety Overvejelser for forskning med lentivirusvektorer" af NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) og kræver en godkendelse fra biosikkerhed udvalget af en forskers institution. Generelt forbedret biosikkerhedsniveau-2 (BSL-2) indeslutning er nødvendig for laboratoriet hvis lentivirale vektorer anvendes.

1. Pladen 4 x 10 ⁶ HEK 293T-celler med komplet DMEM medium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) i 10 cm skåle og kultur natten over ved 37 ° C i en 5% _{CO2-inkubator.} Erstatte mediet med 5 ml forvarmet Opti-MEM I reduceret serum Media (Invitrogen).
2. Fremstil en opløsning A: 10 ug shRNA indeholdende lentiviral vektor, 5 ug af hver af den tredje geneation lentivirusinfektioner emballering plasmider (fremstillet med høj renhed, tre emballager plasmider indbefatter VSV-G: for et kappeprotein, pRSV-Rev: for rev, og pMDLg / pRRE: for gag / pol, som er afgørende for lentivirus emballage), 36 pi af 2M _CaCl2 og 300 ul sterilt vand.
3. Forbered Opløsning B: 300 pi 2 x HEPES-bufret saltvand (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM _{Na2 HPO4,} pH justeret til 7,12 med 0,5 N NaOH og steriliseret ved 0,22 um filter).
4. Langsomt dråbeopløsning A i opløsning B, medens boble luft gennem Opløsning B med en pipette. Forlader røret ved omgivelsernes temperatur i 30 min.
5. Langsomt falde de blandede opløsninger A / B i HEK 293T celledyrkningsskål fremstillet i trin 2.1 og inkuber ved 37 ° C i en _5% CO2-inkubator i 4-6 timer.
6. Erstatte mediet med 7 ml komplet DMEM-medium. Efter 24 timer tilsættes yderligere 5 ml af komplet DMEM-medium. Harvest mediet containing lentivirus efter yderligere 24 timer i kultur.
7. Dreje medium ved 1.500 rpm, stuetemperatur i 10 min. Filtreres supernatanten under anvendelse af en 0,45 um filter og dreje gennemstrømning medium indeholdende lentivirus ved ultracentrifugering ved 25.000 rpm (svarende til 125.000 x g med en SW28 svingende spand rotor, Beckman Ultracentrifuge XL-90), 4 ° C i 90 min. Supernatanten dekanteres til en beholder med 5% blegemiddel (slutkoncentration).
8. Resuspender lentivirus pelleten i 0,5-1,0 ml kold PBS og gøre lentivirusinfektioner alikvoter i 50 til 100 pi pr rør. Opbevares ved -80 ° C.
9. Titeren af lentivirus kan bestemmes ved kommercielle kits (såsom QuickTiter lentivirus Kvantificering Kit fra Cell Biolabs, Inc.), ved en real-time PCR-protokol ^8, eller ved at bestemme co-udtrykte fluorescerende markør ved hjælp af fluorescens-mikroskopi eller flowcytometri . Typisk kan en 10-cm dyrkningsskålens producerer omkring 0,5-1,0 × 10 ⁸ infektiontiøse enheder (IE).

3. Infektion oq karakteriserinq af inficerede celler

1. Frø cellerne for at være inficeret i 2 ml komplet medium i en 6-brønds plade med 30-40% konfluens (ca. 5-8 x 10 ⁵ celler, afhængigt cellestørrelser). Dyrkning af cellerne natten over ved 37 ° C i en 5% _{CO2-inkubator.}
2. Erstatte mediet med 1 ml frisk medium indeholdende 8 ug / ml polybren (Sigma, Kat # H9268) eller 5 ug / ml protamin (Sigma, katalog # P4020).
3. Bestemme en egnet multiplicitet af infektion (MOI) på mellem ⁹ for en bestemt cellelinie med lentivirus med fluorescerende markør. Beregning eller empirisk bestemme mængden af ​​lentivirus, der skal anvendes til at inficere cellelinjen. Langsomt slip lentivirus i pladen og ryst den forsigtigt i 10 sek.
4. Inkubér pladen ved 37 ° C i en _5% CO2-inkubator i 6 timer og derefter erstatte mediet med normal komplet medium.
5. Mindst to days efter infektion, se cellerne under anvendelse af fluorescensmikroskopi for lentivirus, der udtrykker fluorescerende markører og / eller tilføje det tilsvarende antibiotikum til mediet for lentivirale vektorer, der udtrykker antibiotiske resistensgener. For en inducerbar vektor, cellerne i medium, såsom en Tet-On-systemet (figur 2), kultur fremstillet med tetracyclin-fri FBS. Opdele cellerne 2-3 dage efter infektion. Tage en del af cellerne til at teste inducerbart gen knockdown ved dyrkning deraf i medium forsynes med og uden 1,5 ug / ml doxycyclin (Dox) i ≥ 2 dage.
6. Kontroller genet Knockdown ved Western blot, Real-Time PCR eller immunfarvning ≥ 2 dage efter infektion, 2 dage efter antibiotisk selektion, eller (for en Tet-On inducerbare system) ≥ 2 dage efter Dox tilsætning.
7. Anvender forskellige fremgangsmåder (såsom celleproliferation assays, bløde agarkultur undersøgelser, migration assays, invasion assays og tumordannelse undersøgelser) for at bestemme virkningerne af målgenet kNockdown på malignitet af cellerne.

4. Xenotransplantat mus modelundersøgelse

1. Rengøre alle overflader til mus bedøvelse og injektion med 70% ethanol for at forhindre infektion af mus. Bedøve athymiske nøgne mus (NCI-Frederick) under anvendelse af 2% isofluran blandet med oxygen i en narkosemiddel kammer 10 min før celleinokulering. Opretholde anæstesi under anvendelse af 1% isofluran blandet med oxygen via en næsekegle. Udfør dette trin i et rum med god ventilation og vedhæft isofluran scavenger filtre til induktion kammeret.
2. Udbreder de celler, der bærer shRNAs. Anvende tetracyclin-frit medium til Tet-On inducerbare vektorer. Trypsinisér cellerne, og resuspender dem i komplet medium indeholdende 50% Matrigel. Placer de nøgne mus på en varmepude (30 ° C) og injiceres 200 pi af cellerne (1-10 x 10 ^6, afhængigt af malignitet af cellerne) i musene med 1-2 injektionssteder pr mus. Brug sprøjter med 25.5-gauge nåle for subkutane injektioner, og 28-30 gauge nåle til ortotopisk injektioner.
3. For konstitutive shRNA vektorer, anvender 2 grupper af mus injiceret med celler, der udtrykker målgenet shRNA og en kodet shRNA. For Tet-On inducerbare shRNA vektorer, anvender 4 grupper af mus injiceret med celler, der bærer målgenet shRNA og en kodet shRNA, forsynes med normalt vand og DOX (1,5 mg / ml) indeholdende vand (2 shRNAs × 2 behandlinger = 4 grupper) . Udskift Dox-holdige vand to gange om ugen.
4. Overvåge længden og bredden af tumorerne ugentlige eller hver anden uge ved en digital skydelære og beregne tumorvolumener (V) med formlen V = 1/2 (længde x ^{bredde2) 10.} Sørg for, at tumor volumen ikke overstiger retningslinjerne i den institutionelle ACUC (som f.eks, 10% af kropsvægten). Afliv alle mus ved hjælp af en protokol godkendt af institutionelle ACUC hvis det viser tegn på omfattende ulceration eller nekrose, indlysende infection, ukontrolleret blødning eller slutstadium sygdom.
5. Tumorvækst og metastase, kan overvåges for inokulerede tumorceller, der udtrykker en bioluminescerende markør ^11, såsom ildflueluciferase. Rengør alle overflader for mus bedøvelse og billedbehandling med 70% ethanol for at forhindre infektion af mus. Bedøve musene som beskrevet i trin 4.1. Injicere luciferin (150 mg / kg) intraperitonealt. Placer musene i en desinficeret billeddannelse kammer i et kommercielt imaging system, såsom en IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Inc.). Tænd for anæstesi håndtaget for at vedligeholde anæstesien med 1% isofluran blandet med ilt. Gennemføre dette trin i et rum med god ventilation.
6. Tag det første billede ved at udsætte 5 minutter og kontrollere dens signal intensitet. Juster eksponeringen tid til at få billeder med optimal signal versus baggrund. Bestemme afbildningstiden empirisk, som generelt er 1-5 min for subkutane tumorer.
7. Aflive musene ved en godkendt protokolaf den institutionelle ACUC når tumorstørrelser nå op på omkring 1.000 mm ^3, eller som angivet af ACUC retningslinjer. Excise den xenotransplantattumorer, vejer dem og tage billeder. Behandle tumorprøver til forskellige undersøgelser, såsom patologiske analyser for at afgøre tumor celle morfologi, og Western Blot og Real-Time PCR undersøgelser for at teste genekspression.

5. Repræsentative resultater

Denne protokol blev anvendt til at undersøge virkningerne af YY1 knockdown af xenograft tumordannelse af ildflue-luciferase-udtrykkende MDA-MB-231-celler (humane brystadenokarcinomceller; Caliper Life Sciences) i athymiske nøgne mus. Den shRNA målsekvens af human YY1 er "GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T". En forvrænget sekvens "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T" blev også skabt for en kontrol (fortsat) shRNA, som ikke har betydelig lighed med nogen kendt udskrift. Oligonucleotiderne anvendt til at Tet-On inducerbare shRNA konstruktioner med YY1 som et eksempel, Er vist i tabel 1. Som et resultat blev to lentivirale vektorer, plu-puro-Indu-YY1 shRNA og plu-puro-Indu-cont shRNA, fremstillet og de blev anvendt til at fremstille lentivira. Vi anvendte disse lentivira individuelt inficere to MDA-MB-231-cellekloner (kloner 1 og 3), der udtrykker både tetracyklin regulator (tetR) og ildflueluciferase. Polyklonale cellepopulationer blev opnået efter puromycin selektion. Figur 3A viser Dox-induceret YY1 knockdown i disse MDA-MB-231-celler inficeret med plu-puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Vi derefter anvendt de polyklonale celler af klon 3 inficeret individuelt ved disse inducerbar YY1 shRNA og CONT shRNA lentivira og observerede, at YY1 depletering reduceret invasivitet af MDA-MB-231-celler (fig. 3B). Western blot-analyser bekræftede Dox-induceret YY1 inaktivering i MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA, medens celler, der indeholder indu-cont shRNA ikke viser denne virkning (figur 3C). Vi derefter anvendes disse celler til xenotransplantat musemodel undersøgelse. Sammenlignet med kontrolgrupperne, musene implanteret ved MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA og forsynet med Dox-holdigt vand udviste reduceret tumordannelse, når visualiseret ved bioluminescens (figur 4A) og bestemmes ved tumorvægte (figur 4B ). YY1 inaktivering i disse xenotransplantattumorer blev bekræftet ved Western blot-forsøg er vist i figur 4C.

Figur 1. Skematisk diagram til generering af en shRNA konstruktion og shRNA transkription. Den primerne P1 til P6 er vist (se tabel 1 for eksempel sekvenser). Pol III: RNA-polymerase III (d). Fordøjet ende. Tegning er ikke målestok. Klik her for at se et større billede .

2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Figur 2. Skematiske diagrammer af (A) en lentiviral vektor, og (B) mekanismen af Tet-On inducerbar H1 promotor anvendes til gen-nedregulering. Den lentivirale vektor blev rekonstrueret ud fra pLL3.7 ^14. H1-Pr: H1 promotor; UBC-Pr: human ubiquitin C promotor; Puro: puromycin, TRE: tetracyclin responsive element; Dox: doxycyclin. TetR: tetracyclin regulator. 5'LTR, 3'SIN-LTR og WRE er væsentlige elementer i en lentiviral vektor ^14.

Figur 3. DOX-induceret YY1 nedregulering og dens virkning på invasivitet af MDA-MB-231 celler. A. YY1 niveauer i to polyklonale cellepopulationer afledt TetR-udtrykkende kloner 1 og 3 er inficeret med plu-puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus og dyrket i fravær og nærvær af Dox. B. Boyden kammer assay af MDA-MB-231 celler med inducerbare shRNAs. (* P <00,05 versus andre tre grupper). C. Repræsentative Western blots af YY1 ekspression i disse fire cellepopulationer.

Figur 4. Virkninger induceret YY1 silencing på xenotransplantat tumordannelse ved MDA-MB-231 celler. A. Skematisk diagram af celle implantation (venstre) og repræsentative bioluminiscerende billeder taget af den IVIS Imaging System på 4 uger (til højre) efter celleinokulering. B. xenograft tumorvægte efter 4 uger. * P ≤ 0,05. C. Western blots af YY1 og β-actinekspression i transplantater af MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA i fravær og nærvær af DOX. Etiketter på toppen er navnene på enkelte mus.

Tabel 1. Syntetiserede oligonukleotider anvendt til at generere shRNA konstruktioner. P1 og P6 sekvenser for mus U6 og Tet-On inducerbare humane H1 promotorer er tilvejebragt. Human YY1 anvendes som et eksempel med en shRNA målsekvens af GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. sekvenser specifikke for YY1 fremhæves. To P2 sekvenser af YY1 er konstrueret til de to promotorer, hhv. Den konstitutive U6 / YY1 shRNA blev beskrevet tidligere ^15, medens Tet-On H1/YY1 blev anvendt i denne protokol. P5 er vektor-specifik og sekvens for pLL3.7 ¹⁴ er vist. Sekvenserne af restriktionsenzymer er understreget, og de sekvenser, der annealer til de promotorer under PCR-amplifikation er kursiv.

Denne protokol beskrives en metode til at vælte et gen under anvendelse shRNA og visualisere den biologiske virkning ved hjælp af bioluminescerende billeddannelse af tumorcellevækst in vivo. Målstedet for en shRNA bør ikke indeholde nogen af de tre restriktionssteder (BamHI, HindIII og EcoRI), der anvendes til subkloning. En sjælden scenario, når som helst af disse sites er til stede, kan en yderligere restriktionsenzym anvendes til at erstatte det i generering af konstruktionen.

Adskillige vigtige skridt i denne protokol vil fremskynde opbygningen af ​​shRNA lentivirusvektorer. For det første kan PCR-skabelon plasmidet indeholdende U6 eller H1 promotor har en anden antibiotisk resistensgen (såsom kanamycin) fra lentiviral vektor (typisk ampicillin). Dette kan reducere baggrunden af ​​transformation forårsaget af skabelonen plasmidet. Sekund, er det nødvendigt at anvende kompetente E. coli-celler med høje virkningsgrader af transformation. En protokol anvendelse af kalium ennd manganioner kan anvendes til fremstilling af kompetente E. coli-celler med ekstremt høje kompetencer ^12. For det tredje kan en selekterbar markør lette 3-fragmentet subkloning. For eksempel kan en lentiviral vektor konstrueres til at indeholde en ekspressionskassette for β-galactosidase (LacZ), som vil blive erstattet ved insertion af PCR-fragmentet og annealet P3/P4 oligonukleotider. I dette tilfælde vil rekombinante plasmider med inserter danner hvide kolonier, mens disse ikke indsatsene bliver blå, når de udsættes for X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranosid) .

Kvaliteten af ​​lentivirale vektorer og de tre emballage plasmider er væsentligt for effektiv lentivirus produktion. En meget økonomisk og effektiv transfektion med anvendelse af calciumphosphat nedbør er tilvejebragt. Polyethylenimintypen ¹³ eller kommercielle transfektionsreagenser kan også anvendes i lentivirus produktionen. For at bruge en ordentlig MOI for infektion, er det vigtigt at bestemme titere af produceret lentivirus.

Mus af alle forsøgsgrupper skal anbringes i det samme rum til at fjerne deres døgnrytme forskel, som kan forårsage variationer i bioluminescens under xenograft tumorafbildning. Tilgange af muse eutanasi omfatte CO ₂ kvælning og overdosering af isofluoran og bør godkendes af den institutionelle ACUC.