DNA Vector-baserte RNA interferens for å studere gen-funksjon hos Cancer

1. Generering av shRNA konstruksjoner

1. Identifisere en siRNA-mål sekvens (20-23 nukleotider) basert på tidligere publiserte kriterier ⁶ eller bruke en web-basert algoritme server, for eksempel "siRNA Target Finder" fra Ambion og GenScript.
2. Syntetisere oligonukleotider basert på design av Figur 1 og eksempel sekvenser i tabell 1. Utfør PCR amplifikasjon bruker oligonucleotides P1 og P2 (30 sykluser av denaturering ved 94 ° C i 30 sek, avspenning ved 60 ° C i 30 sek, og elongating ved 72 ° C i 30 sek) og en plasmid som bærer U6 eller H1 Arrangøren som en mal. Renser PCR produktet ved hjelp av en PCR rensing kolonne. Fordøye det ved BamHI og HindIII og rense fordøyd DNA ved hjelp av en PCR rensing kolonne. Anneal den oligonucleotides P3 og P4 (2,5 pmol / mL av hver i 100 mL av 50 mM Tris • HCl, 8,0 pH) ved å koke i 5 min og sakte avkjøles til romtemperatur. Fordøye en lentiviral VECTor, slik som den er beskrevet i figur 2A, ved BamHI og EcoRI, og utføre gel-rensing.
3. Gjennomføre en tre-fragment ligation med BamHI / EcoRI-fordøyd vektor, en BamHI / HindIII-fordøyd PCR fragment og ett par glødet oligonukleotider (forming HindIII og EcoRI nettsteder på de to endene) på en 1:10:10 molar ratio (Figur 1).
4. Transform svært effektiv kompetent E. coli DH5α celler ved hjelp av ligated produktet. Skjerme koloniene hjelp av oligonukleotider P5 (i vektoren) og P6 (i H1 eller U6 promoter). ⁷
5. Forbered plasmid DNA fra de positive kolonier med en kommersiell kit og bekrefter tilstedeværelsen av innsatsen ved BamHI / EcoRI fordøyelse og DNA agarose elektroforese. Sequence regionen inneholder arrangøren og shRNA hjelp oligonukleotid P5.
6. Bruk plasmid DNA Midi-eller Maxi-forberedelse Kits (endotoksin-free foretrekkes) for å forberede lentivirus DNA bærer shRNA uttrykketkassett. Bestem DNA konsentrasjonen ved å måle absorpsjon ved 260 nm. Sjekk DNA renhet ved hjelp av 260 nm/280 nm forholdet og sørge for at den faller i området 1,8 til 2,0. Sjekk lentivirus plasmidet integritet ved hjelp av agarose gel elektroforese. DNA for transfeksjon skal være super-coiled.

2. Lentivirus Transfeksjon

Forholdsregler: Lentiviral vektorer er utledet fra humant immunsviktvirus-1 (HIV-1) genom og replikering inkompetent. De har blitt mye brukt i genet levering på grunn av evnen til å infisere både å dele og ikke-delende celler. Men to store risikoer eksisterer i studier med lentivirus. (1) Potensialet for generering av replikering-kompetent lentivirus. Denne risikoen kan bli sterkt redusert dersom tredje generasjon lentiviral systemet brukes. (2) Potensialet for oncogenesis. Denne risikoen kan bli forverret dersom gjennomførte setter er onkogent eller bekjempe tumor suppressors.Forskningsaktiviteter involvert i HIV-baserte lentivirus bør følge "biologisk Hensyn for forskning med Lentiviral Vektorer" av NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) og krever en godkjenning fra biosikkerhet komiteen av en forskers institusjon. Vanligvis forbedret biologisk nivå-2 (BSL-2) oppdemming er nødvendig for laboratoriet innstillingen hvis lentiviral vektorer brukes.

1. Plate 4 × 10 ⁶ hek 293T celler med komplett DMEM medium (DMEM leveres med 10% fosterets storfe serum (FBS), 2 mm L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 mikrogram / ​​ml streptomycin) i 10 cm retter og kultur over natten ved 37 ° C i 5% CO ₂ inkubator. Erstatt medium med 5 ml forvarmes Opti-MEM jeg Redusert Serum Media (Invitrogen).
2. Forbered Løsning A: 10 mikrogram shRNA som inneholder lentiviral vektor, 5 mikrogram hver tredje geneasjon lentivirus emballasje plasmider (tilberedt med høy renhet, de tre emballasje plasmider inkludere VSV-G: for en konvolutt protein, pRSV-Rev: for rev, og pMDLg / pRRE: for gag / pol, som er avgjørende for lentivirus emballasje), 36 mL av 2M ₂ CaCl, og 300 mL sterilt vann.
3. Forbered Løsning B: 300 mL av 2 × Hepes saltløsning (281 mM NaCl, 100 mm HEPES, 1,5 mM Na _{2 4} HPO, pH justert til 7,12 med 0,5 N NaOH og steriliseres ved 0,22 mikrometer filter).
4. Sakte slipper Solution A inn Solution B mens boblende luft gjennom Solution B med en pipette. La røret ved romtemperatur i 30 min.
5. Sakte slipper blandet løsningene A / B i HEK 293T cellekultur parabolen forberedt på trinn 2,1 og inkuber ved 37 ° C i 5% CO ₂ inkubator for 4-6 timer.
6. Erstatt medium med 7 ml komplett DMEM medium. Etter 24 h, legger ytterligere 5 ml av den komplette DMEM medium. Høste medium fortsaining den lentivirus etter en 24 timers kultur.
7. Spinn medium på 1500 rpm, romtemperatur i 10 min. Filtrer supernatanten ved hjelp av en 0,45 mikrometer filter og spinne gjennomstrømning medium som inneholder lentivirus ved ultracentrifugation ved 25.000 rpm (tilsvarer 125 000 × g med en SW28 svingende bøtte rotor, Beckman Ultrasentrifuger XL-90), 4 ° C i 90 min. Dekanter supernatanten til en container med 5% blekemiddel (endelig konsentrasjon).
8. Resuspender den lentivirus pellet i 0,5 til 1,0 ml kald PBS og gjøre lentivirus alikvoter til 50-100 mL per rør. Oppbevar dem ved -80 ° C.
9. Den titer av lentivirus kan bestemmes av kommersielle kits (som QuickTiter lentivirus Kvantitering Kit fra Cell Biolabs, Inc.), etter en real-time PCR ⁸ protokoll, eller ved å bestemme co-uttrykkes fluoriserende fargestoff bruker fluorescens mikroskopi eller flowcytometri . Vanligvis kan en 10-cm kultur parabolen produsere ca 0,5 til 1,0 × 10 ⁸ infekambisiøse enheter (IE).

3. Infeksjon og karakterisering av infiserte celler

1. Seed cellene til å være infisert i 2 ml komplett medium i en seks-brønns plate med 30-40% confluency (ca 5-8 × 10 ⁵ celler, avhengig cellestørrelser). Kultur cellene over natten ved 37 ° C i 5% CO ₂ inkubator.
2. Erstatt medium med 1 ml av frisk medium med 8 mikrogram / ml polybrene (Sigma, Cat # H9268) eller 5 mikrogram / ml av protamin (Sigma, Cat # P4020).
3. Bestem en passende mangfold av infeksjon (MOI) område ⁹ for en bestemt cellelinje med lentivirus med fluoriserende fargestoff. Beregne eller empirisk bestemme mengden av lentivirus som skal brukes til å infisere cellelinje. Sakte slipper lentivirus inn på platen og rist den forsiktig i 10 sek.
4. Inkuber platen ved 37 ° C i 5% CO ₂ inkubator for 6 timer og deretter erstatte medium med normal komplett medium.
5. Minst to daYS etter smitte, sjekk celler ved hjelp av fluorescens mikroskopi for lentivirus uttrykke fluorescerende markører og / eller legge den tilsvarende antibiotika til medium for lentiviral vektorer som uttrykker antibiotikaresistensgener. For en induserbar vektor, for eksempel en Tet-On-systemet (figur 2), kultur cellene i medium forberedt med tetracyclin uten FBS. Split cellene 2-3 dager etter smitte. Ta en del av cellene til å teste induserbar genet knockdown ved dyrkning dem i medium leveres med og uten 1,5 mikrogram / ml doxycycline (Dox) i ≥ 2 dager.
6. Sjekk genet knockdown ved Western blot, Real-Time PCR eller farging ≥ 2 dager etter smitte, 2 dager etter antibiotika valg, eller (for en Tet-On induserbar system) ≥ 2 dager etter Dox tillegg.
7. Benytte ulike tilnærminger (som celleproliferasjon analyser, myke agar kulturstudier, migrasjon analyser, invasjon analyser og tumordannelse studier) for å bestemme effekten av målet genet knockdown på malignitet av cellene.

4. Xenograft mus modell Study

1. Rengjør alle overflater for mus anesthetization og injeksjon med 70% etanol for å hindre smitte av mus. Anesthetize athymic nakenmus (NCI-Frederick) med 2% isofluran blandet med oksygen i en anestesi induksjon kammer 10 min før celle inokulasjon. Opprettholde anestesi med 1% isofluran blandet med oksygen gjennom en nese kjegle. Utfør dette trinnet i et rom med god ventilasjon og fest isofluran scavenger filtrene til induksjon kammeret.
2. Forplante cellene bærer shRNAs. Bruk tetracyklin-free medium for Tet-On induserbar vektorer. Trypsinize cellene og resuspender dem i fullstendig medium som inneholder 50% Matrigel. Plasser nakenmus på en varmepute (30 ° C) og injisere 200 mL av cellene (1-10 × 10 ^6, avhengig av malignitet av cellene) inn i mus med 1-2 injeksjonssteder per mus. Bruk sprøyter med 25.5-måle nåler for subkutane injeksjoner, og 28-30 måle nåler for orthotopic injeksjoner.
3. For konstitutive shRNA vektorer, utnytte 2 grupper av mus injisert med cellene som uttrykker målet genet shRNA og en forvrengt shRNA. For Tet-On induserbar shRNA vektorer, utnytte 4 grupper av mus injisert med celler som frakter målet genet shRNA og en eggerøre shRNA, leveres med vanlig vann og Dox (1,5 mg / ml) inneholder vann (2 shRNAs × 2 behandlinger = 4 grupper) . Bytt Dox-holdig vann to ganger i uken.
4. Overvåk lengden og bredden av svulstene ukentlig eller annenhver uke med en digital Vernier caliper og beregne tumor volum (V) ved formelen V = 1/2 (lengde × bredde ^{2) 10.} Sørg for at tumor volum ikke overstiger retningslinjene i den institusjonelle ACUC (som 10% av kroppsvekten). Avlive noen mus bruker en protokoll som er godkjent av institusjonelle ACUC hvis den viser tegn på omfattende sårdannelse eller nekrose, åpenbare infection, ukontrollert blødning eller sluttstadiet sykdom.
5. Tumorvekst og metastasering kan overvåkes for de inokulerte kreftceller uttrykker en Bioluminescent ¹¹ markør, slik som Firefly luciferase. Rengjør alle overflater for mus anesthetization og bildebehandling med 70% etanol for å hindre smitte av mus. Anesthetize musene som beskrevet i trinn 4.1. Injiser luciferin (150 mg / kg) intraperitonealt. Plasser mus inn i en desinfisert avbildning kammer av en kommersiell bildebehandling system, for eksempel en IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Inc.). Slå på anestesi spaken for å opprettholde anestesi ved 1% isofluran blandet med oksygen. Opptreden dette trinnet i et rom med god ventilasjon.
6. Ta det første bildet ved å utsette 5 min og sjekke signal intensitet. Juster eksponeringen tid til å ta bilder med optimal signal versus bakgrunn. Bestem bildebehandling tid empirisk, er som regel 1-5 min for subkutane svulster.
7. Avlive mus ved en protokoll godkjentav den institusjonelle ACUC når tumor størrelser nå om 1000 mm ^3, eller som beskrevet i ACUC retningslinjene. Avgiftsdirektoratet den xenograft svulster, veie dem og ta bilder. Behandle tumorprøver for ulike studier, som patologiske analyser for å bestemme svulst celle morfologi, og Western blot og Real-Time PCR-studier for å teste genuttrykk.

5. Representative Resultater

Denne protokollen ble brukt til å studere effekter av YY1 knockdown på xenograft tumordannelse Firefly luciferase-uttrykker MDA-MB-231 celler (menneskelige brystkreft adenokarsinom celler; Caliper Life Sciences) i athymic nakne mus. Den shRNA målet sekvensen av menneskelig YY1 er "GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T". En eggerøre sekvens "GGG Lov CTA TTA CGT CAT T" ble også opprettet for en kontroll (forts) shRNA, som ikke har vesentlig likhet med noen kjente karakterutskriften. De oligonukleotider brukes til å lage Tet-On induserbar shRNA konstruksjoner, med YY1 som et eksempel, Er vist i Tabell 1. Som et resultat ble to lentiviral vektorer, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA og PLU-Puro-Indu-cont shRNA, bygget og de ble brukt til å produsere lentiviruses. Vi brukte disse lentiviruses til individuelt infisere to MDA-MB-231 celle kloner (kloner 1 og 3) som uttrykker både tetracyclin regulator (tetR) og Firefly luciferase. Polyklonale celle populasjoner ble innhentet etter puromycin utvalg. Figur 3A viser Dox-indusert YY1 knockdown i disse MDA-MB-231 celler infisert av PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Vi så brukte de polyklonale cellene klone tre smittet individuelt av disse induserbar YY1 shRNA og forts shRNA lentiviruses og observerte at YY1 uttømming redusert invasivitet av MDA-MB-231 celler (Figur 3B). Western blot analyser bekreftet Dox-indusert YY1 Silencing i MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA, mens cellene som inneholder indu-cont shRNA ikke viste denne effekten (figur 3C). Vi så brukt disse cellene for xenograft mus modell studie. Sammenlignet med kontrollgruppene, viste musene implantert av MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA og leveres med Dox-holdig vann redusert tumordannelse, da visualiseres bioluminesens (figur 4A) og bestemmes ved tumor vekter (Figur 4B ). YY1 stanse i disse xenograft svulstene ble bekreftet ved Western blot studier vist i Figur 4C.

Figur 1. Prinsippskisse for generering av en shRNA konstruksjon og shRNA transkripsjon. Primerne P1 til P6 er vist (se tabell 1 for eksempel sekvenser). Pol III: RNA polymerase III (d):. Fordøyd slutt. Tegning er ikke i målestokk. Klikk her for å se større bilde .

2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Figur 2. Skjematiske diagrammer av (A) en lentiviral vektor og (B) mekanismen av Tet-On induserbar H1 promoter brukt for genet Silencing. Den lentiviral vektor ble rekonstruert basert på pLL3.7 ^14. H1-Pr: H1 promoter; UBC-Pr: Human ubiquitin C promoter; Puro: puromycin; TRE: Tetracyclin responsive element; Dox: doksycyklin. TetR: tetracyklin regulator. 5'LTR, 3'SIN-LTR og WRE er viktige komponenter i en lentiviral vektor ^14.

Figur 3. Dox-indusert YY1 Silencing og dens effekt på invasivitet av MDA-MB-231 celler. A. YY1 nivåer i to polyklonale celle populasjoner avledet fra TetR-uttrykke kloner 1 og 3 smittet av PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus og dyrket i fravær og nærvær av Dox. B. Boyden kammer analysen av MDA-MB-231 celler med induserbar shRNAs. (* P <00,05 versus andre tre gruppene). C. Representative vestlige blotter av YY1 uttrykk i disse fire celle populasjoner.

Figur 4. Effekter av indusert YY1 stanse på xenograft tumordannelse av MDA-MB-231 celler. A. Skjematisk diagram av celle implantasjon (til venstre) og representative Bioluminescent bilder tatt av IVIS Imaging System på 4 uker (til høyre) etter celle inokulasjon. B. xenograft tumor vekter på 4 uker. * P ≤ 0,05. C. vestlige blotter av YY1 og β-actin uttrykk i xenografts av MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA i fravær og nærvær av Dox. Etiketter på toppen er navnene på enkelte mus.

Tabell 1. Syntetisert oligonukleotider brukes i generering shRNA konstruksjoner. P1 og P6 sekvenser for mus U6 og Tet-On induserbar menneskelige H1 arrangører tilbys. Menneskelig YY1 brukes som et eksempel med en shRNA mål sekvens av GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. Sekvensene er spesifikke for YY1 er uthevet. To P2 sekvenser av YY1 er designet for de to arrangører, henholdsvis. Den konstituerende U6 / YY1 shRNA ble beskrevet tidligere ^15, mens Tet-On H1/YY1 ble brukt i denne protokollen. P5 er vektor-spesifikk og sekvensen for pLL3.7 ¹⁴ vises. Sekvenser av restriksjonsenzymer er understreket, mens sekvenser til anneal til arrangører under PCR amplifikasjon er kursiv.

Denne protokollen beskriver en metode for å slå ned et gen ved hjelp shRNA og visualisere sin biologiske effekten ved hjelp Bioluminescent avbildning av svulst celle vekst in vivo. Målet stedet av en shRNA bør ikke inneholde noen av de tre restriksjonsenzymer nettstedene (BamHI, HindIII og EcoRI) benyttet for subcloning. I et sjeldent scenario når noen av disse nettstedene er til stede, kan en ytterligere begrensning enzym brukes til å erstatte den i å generere konstruktet.

Flere viktige skritt i denne protokollen vil fremskynde byggingen av shRNA lentiviral vektorer. Først kan PCR malen plasmid som inneholder U6 eller H1 arrangøren har en annen antibiotikaresistens genet (som kanamycin) fra lentiviral vektor (typisk Ampicillin). Dette kan redusere bakgrunn av transformasjon forårsaket av malen plasmidet. For det andre er det nødvendig å bruke kompetente E. coli-celler med høye effektiviteten av transformasjon. En protokoll med kalium ennd mangan ioner kan brukes til å produsere kompetente E. coli-celler med ekstremt høy kompetanse ^12. Det tredje kan en valgbar markør lette tre-fragment subcloning. For eksempel kan en lentiviral vektor være konstruert for å inneholde et uttrykk kassett for β-galaktosidase (LacZ) som vil bli erstattet av innsetting av PCR fragment og glødet P3/P4 oligonukleotider. I dette tilfellet vil rekombinante plasmider med inserts danner hvite kolonier, mens disse uten skivene vil være blå, når den utsettes for X-gal (5-Bromo-4-klor-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside) .

Kvaliteten på lentiviral vektorer og de tre emballasje plasmider er viktig for effektiv lentivirus produksjon. En meget økonomisk og effektiv transfeksjon metode med kalsiumfosfat nedbør har blitt gitt. Polyethylenimine ¹³ eller mest kommersielle transfeksjon reagenser kan også brukes i lentivirus produksjon. For å bruke en skikkelig MOI FOr infeksjon, er det viktig å bestemme titere av produsert lentivirus.

Mus i alle eksperimentelle grupper bør bli plassert i samme rom for å eliminere sin døgnrytme forskjell som kan forårsake variasjon av bioluminesens under xenograft tumor bildebehandling. Tilnærminger av mus dødshjelp inkludere CO ₂ kvelning og overdoser av isofluorane og bør godkjennes av institusjonelle ACUC.