DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

1. Generatie van shRNA constructen

1. Identificeer een siRNA-doelsequentie (20-23 nucleotiden) op basis van eerder gepubliceerde criteria ⁶ of gebruik een web-based algoritme server, zoals "siRNA Target Finder" van Ambion en GenScript.
2. Samenstel oligonucleotiden gebaseerd op het ontwerp van figuur 1 en voorbeeld sequenties in tabel 1. Voer PCR amplificatie met de oligonucleotiden P1 en P2 (30 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 sec, gloeien bij 60 ° C gedurende 30 sec, en verlengen bij 72 ° C gedurende 30 sec) en een plasmide dat het U6 of H1 promoter als sjabloon. Zuiver het PCR product met een PCR zuiveringssamenstel kolom. Digest door BamHI en HindIII en zuiveren het geknipte DNA met een PCR zuiveringssamenstel kolom. Gloei de oligonucleotiden P3 en P4 (2,5 pmol / ul van elke in 100 ul 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) door koken gedurende 5 minuten en langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Digest een lentivirale vector, zoals die beschreven in figuur 2A, door BamHI en EcoRI en het uitvoeren gel-zuivering.
3. Voer een drie-fragment ligatie met BamHI / EcoRI-geknipte vector, een BamHI / HindlII-geknipte PCR fragment en een paar gegloeide oligonucleotiden (die HindIII en EcoRI-plaatsen aan beide uiteinden) met een molaire verhouding 01:10:10 (Figuur 1).
4. Transformatie efficiënte competente E. coli DH5a-cellen met het geligateerde product. Scherm de kolonies met de oligonucleotiden P5 (in de vector) en P6 (in de H1 of U6 promoter). ⁷
5. Bereid plasmide DNA van de positieve kolonies met een commerciële kit en bevestigen van de aanwezigheid van het inzetstuk BamHI / EcoRI digestie en agarose-electroforese DNA. Sequence het gebied dat de promoter en shRNA met oligonucleotide P5.
6. Gebruik plasmide DNA Midi-of Maxi-voorbereiding kits (endotoxine-free heeft de voorkeur) om de lentivirus DNA-dragen van de shRNA uitdrukking voor te bereidencassette. Bepaal de DNA-concentratie door het meten van de absorptie bij 260 nm. Controleer de DNA zuiverheid met behulp van de 260 nm/280 nm-verhouding en zorg ervoor dat valt in de range van 1,8 tot 2,0. Controleer de lentivirus plasmide integriteit met behulp van agarose gel elektroforese. DNA voor transfectie moet super-opgerold.

2. Lentivirus Transfectie

Voorzorgsmaatregelen: Lentivirale vectoren zijn afgeleid van het humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1) genoom en de replicatie incompetent. Zij zijn veel gebruikt in gentherapie door de mogelijkheid te infecteren zowel delen en niet-delende cellen. Echter, twee grote risico's bestaan ​​in de studies met behulp van lentivirus. (1) De mogelijkheden voor productie van replicatie-competent lentivirus. Dit risico kan sterk worden verminderd als de derde generatie lentivirale systeem wordt gebruikt. (2) Het potentieel voor oncogenese. Dit risico kan worden versterkt als de uitgevoerde inserts zijn oncogene of onderdrukken tumorsuppressoren.Onderzoeksactiviteiten die betrokken zijn bij HIV-based lentivirus moeten volgen het "Biosafety Overwegingen voor Onderzoek met lentivirale vectoren" van de NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) en vereisen een goedkeuring van de bioveiligheid Comite van een onderzoeker van de instelling. In het algemeen verbeterde bioveiligheidsniveau-2 (BSL-2) insluiting is vereist voor het laboratorium instelling als lentivirale vectoren worden gebruikt.

1. Plaat 4 x 10 ⁶ HEK 293T-cellen volledig DMEM medium (DMEM geleverd met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine) in 10 cm schalen en overnacht cultuur bij 37 ° C in een _5% CO2 incubator. Vervang het medium met 5 ml voorverwarmde Opti-MEM Ik gereduceerd serum medium (Invitrogen).
2. Bereid Oplossing A: 10 ug shRNA bevattende lentivirale, 5 pg elk van de derde Generatie lentivirus verpakking plasmiden (bereid met een hoge zuiverheid, de drie verpakkingen plasmiden bevatten VSV-G: voor een envelop eiwit, pRSV-Rev: voor rev en pMDLg / pRRE: voor gag / pol, die essentieel zijn voor lentivirus verpakking), 36 il 2M _CaCl2 en 300 ul steriel water.
3. Bereid Oplossing B: 300 ul van 2 x Hepes gebufferde fysiologische zoutoplossing (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH ingesteld op 7,12 met 0,5 N NaOH en gesteriliseerd door 0,22 pm filter).
4. Langzaam vallen oplossing A bij oplossing B, terwijl borrelen lucht door Oplossing B met een pipet. Laat de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
5. Druppelend de gemengde oplossingen A / B in de HEK 293T celkweek schotel bereid in stap 2.1 en incuberen bij 37 ° C in een _5% CO2 incubator gedurende 4-6 uur.
6. Plaats het medium met 7 ml compleet DMEM medium. Na 24 uur een extra 5 ml van het volledige DMEM medium. Oogst het medium containing de lentivirus na nog eens 24 uur van de cultuur.
7. Draai het medium bij 1.500 tpm, de omgevingstemperatuur gedurende 10 minuten. Filter de supernatant met een 0,45 pm filter en de doorstroming draaien medium dat de lentivirus door ultracentrifugatie bij 25.000 rpm (gelijk aan 125.000 x g met een SW28 rotor zwaaiende emmer, Beckman Ultracentrifuge XL-90), 4 ° C gedurende 90 minuten. Giet het supernatant een houder met 5% bleekmiddel (eindconcentratie).
8. Resuspendeer de lentivirus pellet in 0.5-1.0 ml koud PBS en maak lentivirus aliquots in 50-100 ul per buis. Bewaar ze bij -80 ° C.
9. De titer van het lentivirus kan worden bepaald door commerciële kit (zoals QuickTiter lentivirus Kwantificering Kit Cell Biolabs, Inc) door een real-time PCR-protocol ⁸ of door bepaling van de co-expressie fluorescerende merker met fluorescentiemicroscopie of flow-cytometrie . Meestal kan een 10-cm cultuur schotel te produceren ongeveer 0,5-1,0 × 10 ⁸ infectiesambitieuze eenheden (IE).

3. Infectie en Karakterisering van geïnfecteerde cellen

1. Start de cellen geïnfecteerd in 2 ml compleet medium in een 6-wells plaat met 30-40% confluentie (5-8 x 10 ⁵ cellen, afhankelijk van celgrootte). Culture de cellen overnacht bij 37 ° C in een _5% CO2 incubator.
2. Plaats het medium met 1 ml vers medium met 8 ng / ml polybreen (Sigma, # Cat H9268) of 5 ug / ml protamine (Sigma, Cat # P4020).
3. Bepaal een geschikte multipliciteit van infectie (MOI) van ⁹ voor een bepaalde cellijn door het gebruik lentivirus met fluorescente marker. Berekenen of empirisch bepaald hoeveel lentivirus worden gebruikt om de cellijn infecteren. Langzaam vallen de lentivirus in de plaat en zachtjes schudden gedurende 10 sec.
4. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een _5% CO2 incubator gedurende 6 uur en vervolgens vervangen medium met gewone volledig medium.
5. Ten minste twee days na infectie, controleert u de cellen met behulp van fluorescentie microscopie voor lentivirus uiten fluorescerende merkers en / of aan de overeenkomstige antibiotica aan het medium voor lentivirale vectoren die antibiotica-resistentie genen. Voor een induceerbare vector, zoals een Tet-On (figuur 2), cultuur de cellen in medium bereid met tetracycline vrij FBS. Splits de cellen 2-3 dagen na de infectie. Neem een ​​deel van de cellen induceerbare gen knockdown testen door kweken in medium te voorzien zonder 1,5 ug / ml doxycycline (DOX) voor ≥ 2 dagen.
6. Controleer het gen knock-down door Western blot, Real-Time PCR of immunokleuring ≥ 2 dagen na infectie, 2 dagen na de antibiotica-selectie, of (voor een Tet-On induceerbaar systeem) ≥ 2 dagen na Dox toevoeging.
7. Maak gebruik van verschillende benaderingen (zoals mobiele proliferatie-assays, zachte agar cultuur studies, migratie assays, invasie assays en tumorvorming studies) om de effecten van de target-gen te bepalen knockdown de kwaadaardigheid van de cellen.

4. Xenograft Mouse Model Study

1. Reinig alle oppervlakken voor muis verdoving en injectie met 70% ethanol om infectie van de muizen te voorkomen. Verdoof athymische naakt muizen (NCI-Frederick) met behulp van 2% isofluraan gemengd met zuurstof in een anesthesie inductie kamer 10 minuten voorafgaand aan de cel enten. Handhaving van de anesthesie met 1% isofluraan gemengd met zuurstof door middel van een neuskegel. Voer deze stap in een kamer met uitstekende ventilatie en bevestig isofluraan aaseter filters om de inductie kamer.
2. Het uitdragen van het cellen die shRNAs. Gebruik tetracycline-vrij medium voor Tet-On induceerbare vectoren. Trypsinize de cellen en hun resuspenderen in compleet medium met 50% Matrigel. Plaats de naakt muizen een verwarmingselement (30 ° C) en injecteer 200 pi van de cellen (1-10 x 10 ^6, afhankelijk van de kwaadaardigheid van de cellen) in de muizen met 1-2 injectieplaatsen per muis. Gebruik spuiten met 25.5-gauge naalden voor subcutane injecties, en van 28-30 gauge naalden voor orthotope injecties.
3. Voor constitutieve shRNA vectoren, maken gebruik van 2 groepen van muizen ingespoten met de cellen die de target-gen shRNA en een gecodeerd shRNA. Voor Tet-On induceerbare shRNA vectoren gebruik 4 groepen van muizen geïnjecteerd met cellen die het doelwitgen shRNA en gecodeerd shRNA, voorzien gewoon water en Dox (1,5 mg / ml) met water (2 x 2 shRNAs behandelingen = 4 groepen) . Vervang de Dox-bevattende water twee keer per week.
4. Controleer de lengte en breedte van de tumoren wekelijks of tweewekelijks een digitale schuifmaat en berekenen tumorvolumes (V) volgens de formule V = 1/2 (lengte x breedte ^{2) 10.} Zorg ervoor dat de tumor volume niet de richtlijnen van de institutionele ACUC (zoals 10% van het lichaamsgewicht) overschrijden. Euthanaseren een muis met behulp van een protocol is goedgekeurd door de institutionele ACUC als het toont geen teken van een uitgebreide ulceratie of necrose, voor de hand liggende infection, ongecontroleerde bloedingen of terminale ziekte.
5. Tumorgroei en metastase kunnen worden gevolgd voor de geënte tumor cellen die een lichtgevende marker ^11, zoals Firefly luciferase. Reinig alle oppervlakken voor muis verdoving en imaging met 70% ethanol om infectie van de muizen te voorkomen. Verdoof de muizen zoals beschreven in stap 4.1. Injecteer luciferine (150 mg / kg) intraperitoneaal. Plaats de muizen in een gedesinfecteerde beeldvorming kamer van een commerciële imaging systeem, zoals een IVIS Imaging System (Remklauw Life Sciences, Inc.) Zet de anesthesie hendel om de anesthesie te onderhouden met 1% isofluraan gemengd met zuurstof. Voer deze stap in een kamer met een uitstekende ventilatie.
6. Maak de eerste opname door het blootstellen van 5 minuten en controleer de intensiteit van het signaal. Stel de belichting in de tijd om beelden te verkrijgen met een optimale signaal versus achtergrond. Empirisch Bepaal de beeldvorming tijd, die over het algemeen 1-5 min voor subcutane tumoren.
7. Euthanaseren de muizen door goedkeuring gehecht aan een protocoldoor de institutionele ACUC wanneer tumor maten ongeveer 1.000 mm ^3, of zoals aangegeven door de ACUC richtlijnen te bereiken. Accijnzen de xenograft tumoren, wegen en foto's maken. Verwerk de tumor monsters voor verschillende onderzoeken, zoals pathologische analyses van de tumor cel morfologie bepalen, en Western blot en real-time PCR-studies om genexpressie te testen.

5. Representatieve resultaten

Dit protocol werd gebruikt om de effecten van YY1 knockdown bestuderen op xenograft tumor vorming van Firefly luciferase-expressie MDA-MB-231 cellen (menselijke borst adenocarcinoom cellen; Caliper Life Sciences) in athymische naakt muizen. De shRNA doelsequentie van de menselijke YY1 is "GGG AGC AGA AGC TGC AGG AGA T". Een gecodeerde sequentie "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T" werd ook gemaakt voor een controle (vervolg) shRNA, die geen significante gelijkenis met alle bekende transcript. De oligonucleotiden gebruikt om Tet-On induceerbare shRNA constructen met YY1 als voorbeeld, Worden in tabel 1. Als gevolg hiervan werden twee lentivirale vectoren, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA en PLU-Puro-Indu-cont shRNA, gebouwd en ze werden gebruikt om lentivirussen te produceren. We gebruikten deze lentivirussen individueel te infecteren twee MDA-MB-231-cel klonen (klonen 1 en 3) te drukken zowel tetracycline regulator (tetR) en Firefly luciferase. Polyklonale celpopulaties werden verkregen na puromycineselectie. Figuur 3A toont Dox-geïnduceerde YY1 knockdown in deze MDA-MB-231 cellen die besmet zijn met plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Vervolgens hebben we de gebruikte polyklonale cellen van kloon 3 afzonderlijk geïnfecteerd door deze induceerbare YY1 shRNA en cont shRNA lentivirussen en merkte op dat YY1 uitputting invasiviteit van MDA-MB-231-cellen (Figuur 3B) verminderd. Western blot analyses bevestigden Dox-geïnduceerde YY1 silencing in MDA-MB-231 cellen met de indu-YY1 shRNA, terwijl de cellen die indu-cont shRNA niet tonen dit effect (Figuur 3C). We gebruikten deze cellen voor de xenograft muismodel studie. Vergeleken met de controlegroep, de muizen ingeplant de MDA MB-231-cellen met indu-YY1 shRNA en voorzien Dox bevattende water vertoonden verminderde tumorvorming als gevisualiseerd door bioluminescentie (Figuur 4A) en waar tumor gewicht (Figuur 4B ). YY1 silencing in deze xenograft tumoren werd bevestigd door Western blot studies figuur 4C.

Figuur 1. Schema voor het genereren van een shRNA construct en shRNA transcriptie. De primers P1 P6 wordt (zie tabel 1 bijvoorbeeld sequenties). Pol III: RNA polymerase III (d). Geknipt einde. Tekenen is niet op schaal. Klik hier om een grotere foto te bekijken .

2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Figuur 2. Schema's van (A) een lentivirale vector en (B) het mechanisme van de Tet-On induceerbare promoter H1 voor gen-silencing. De lentivirale vector werd gereconstrueerd op basis van pLL3.7 ^14. H1-Pr: H1 promotor; UBC-Pr: Human ubiquitine C promotor; Puro: puromycine; TRE: Tetracycline responsief element; Dox: doxycycline. TetR: tetracycline regulator. 5'LTR, 3'SIN-LTR en WRE zijn essentiële onderdelen van een lentivirale vector ^14.

Figuur 3. Dox-geïnduceerde YY1 silencing en het effect ervan op de invasiviteit van MDA-MB-231 cellen. A. YY1 niveaus in twee polyklonale celpopulaties afgeleid van TetR-expressie klonen 1 en 3 besmet met plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus en gekweekt in de afwezigheid en aanwezigheid van Dox. B. Boyden kamer bepaling van MDA-MB-231 cellen met induceerbare shRNAs. (* P <00,05 versus andere drie groepen). C. vertegenwoordiger Western blots van YY1 expressie in deze vier celpopulaties.

Figuur 4. Effecten van geïnduceerde YY1 silencing op xenograft tumorvorming door MDA-MB-231 cellen. A. Schematische weergave van de cel implantatie (links) en vertegenwoordiger van bioluminescente beelden die door de IVIS Imaging System van 4 weken (rechts) na de cel inenting. B. Xenograft tumor gewicht na 4 weken. * P ≤ 0,05. C. Western blots van YY1 en β-actine-expressie in xenotransplantaten van MDA-MB-231 cellen met indu-YY1 shRNA in de afwezigheid en aanwezigheid van Dox. Etiketten op de top zijn de namen van de individuele muizen.

Tabel 1. Gesynthetiseerde oligonucleotiden gebruikt genereren shRNA constructen. P1 en P6 sequenties van de muis U6 en Tet-On induceerbare promoters humane H1 voorzien. Human YY1 is als voorbeeld met een shRNA doelsequentie van GGG AGA AGC AGC TGC AGG AGA T. De sequenties specifieke YY1 worden gemarkeerd. Twee P2 sequenties van YY1 zijn ontworpen voor de twee promoters, respectievelijk. De constitutieve U6 / YY1 shRNA werd eerder ¹⁵ beschreven, terwijl het Tet-On H1/YY1 werd gebruikt in dit protocol. P5 is vector-specifieke en de sequentie voor pLL3.7 ¹⁴ is. De sequenties van restrictie-enzymen zijn onderstreept, terwijl de sequenties van de promoters gloeien gedurende PCR amplificatie cursief.

Dit protocol beschrijft een methode te kloppen in een gen met behulp van shRNA en visualisering van haar biologisch effect met behulp van lichtgevende beeldvorming van de groei van tumorcellen in vivo. Het doel site van een shRNA mag niet een van de drie restrictieplaatsen bevatten (BamHI, Hindlll en EcoRI) die worden gebruikt voor subklonering. In een zeldzaam scenario wanneer een van deze sites aanwezig is, kan een extra restrictie-enzym worden gebruikt om hem te vervangen in het genereren van het construct.

Een aantal belangrijke stappen in dit protocol zal versnellen van de bouw van shRNA lentivirale vectoren. Ten eerste kunnen de PCR-template plasmide dat het U6 of H1 promoter een andere antibioticumresistentiegen (zoals kanamycine) van de lentivirale (meestal ampicilline). Dit kan de achtergrond van transformatie door de sjabloon plasmide. Ten tweede is het nodig om competente E. coli-cellen met hoge rendement van transformatie. Een protocol met behulp van kalium eennd mangaanionen kan worden gebruikt om competente E. produceren coli-cellen met zeer hoge vaardigheden ^12. Ten derde kan een selecteerbare marker gemakkelijker 3-fragment subkloneren. Bijvoorbeeld kan een lentivirale vector worden gemanipuleerd om een ​​expressiecassette voor β-galactosidase (LacZ) die worden vervangen door het inbrengen van het PCR fragment en gegloeid P3/P4 oligonucleotiden bevatten. In dit geval recombinant plasmiden met inserts vormen witte kolonies, terwijl deze zonder inzetstukken wordt blauw wanneer blootgesteld aan X-gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-ß-D-galacto-pyranoside) .

De kwaliteit van lentivirale vectoren en de drie plasmiden verpakking is noodzakelijk om efficiënte productie lentivirus. Een zeer economische en efficiënte transfectie methode met behulp van calciumfosfaat precipitatie is gesteld. Polyethyleenimine ¹³ of de meeste commerciële transfectie reagentia kunnen eveneens worden gebruikt in lentivirus productie. Om een ​​goede MOI fo gebruikenr-infectie is van belang vast te titers geproduceerde lentivirus.

Muizen van alle experimentele groepen moeten worden gehuisvest in dezelfde ruimte om hun circadiane ritme verschil dat de variatie van bioluminescentie kan veroorzaken tijdens xenograft beeldvorming van tumoren te elimineren. Benaderingen van de muis euthanasie onder meer CO ₂ stikken en overdosering door isofluorane en dient te worden goedgekeurd door de institutionele ACUC.