Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

1. ShRNA Oluşumlar üretimi

1. Daha önce yayınlanan kriterlere ⁶ veya Ambion ve GenScript gelen "siRNA Hedef Bulucu" olarak web tabanlı bir algoritma sunucu kullanmak dayalı bir siRNA hedef dizisi (20-23 nükleotid) tanımlayın.
2. Tablo 1, Şekil 1 ve Örnek dizilerinin tasarımına bağlı oligonükleotidler sentezlenir. Oligonükleotidler P1 ve P2 (30 at 94 denatürasyon döngüleri ° C'de 30 saniye süreyle, 60 ° tavlama 30 sn için C ve 30 saniye için 72 ° C'da uzatılması) ve U6 veya H1 taşıyan plazmid kullanılarak PCR yapılması Bir şablon olarak promotör. Bir PCR saflaştırma kolonu kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. BamHI ve HindIII bunu sindirmek ve bir PCR saflaştırma kolonu kullanılarak sindirilir DNA arındırmak. Oligonükleotidler P3 ve P4 (2,5 50 mM Tris 100 ul içinde pmol / ul her birinin • HCI, pH 8.0) 5 dakika ve oda sıcaklığına kadar yavaşça serin için kaynatılarak. Tavlama Bir lentiviral vec sindirmekBöyle BamHI ve EcoRI ile, Şekil 2A açıklanan ve jel saflaştırma gerçekleştirmek biri olarak tor,.
3. Bir 01:10:10 molar oranlarında BamHI / EcoRI-sindirilmiş vektör, bir BamHI / HindIII-sindirilmiş PCR parçası ve tavlanmış oligonükleotidler bir çift (HindIII ve iki ucunda EcoRI siteleri oluşturan) ile bir 3-fragmanı ligasyon yürütmek (Şekil 1).
4. Yüksek verimli yetkili E. Transform bağlanan ürünle kullanarak coli DH5α hücreleri. Oligonükleotidler P5 (vektör içinde) ve P6 (H1 veya U6 yükselticisinde). ⁷ ile koloniler taranması
5. Ticari kit ile pozitif kolonilerden plazmid DNA hazırlayın ve BamHI / EcoRI sindirim ve DNA agaroz elektroforezi ucun varlığını doğrulamaktadır. Oligonükleotid P5 kullanarak organizatörü ve shRNA içeren Sıra bölge.
6. ShRNA ifadesi taşıyan lentivirüs DNA hazırlamak için plazmid DNA Midi-veya Maxi-hazırlık setleri (endotoksin ücretsiz tercih edilir) kullanınkaset. 260 nm'de absorpsiyon olarak ölçülmesiyle DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. 260 nm/280 nm oranı kullanılarak DNA'nın saflık kontrol edin ve 1,8-2,0 aralığında düşüyor emin olun. Agaroz jel elektroforez ile lentivirüs plazmid bütünlüğünü kontrol edin. Transfeksiyon için DNA süper sarılmış olmalıdır.

2. Lentivirüs Transfeksiyon

Önlemler: lentiviral vektörler (HIV-1) genomu ve replikasyonu beceriksiz virüs-1 insan bağışıklık elde edilmektedir. Bunlar yaygın hücre bölünmesi ve non-bölünmesi hem bulaştırmaktan özelliği nedeniyle gen aktarımının kullanılmıştır. Bununla birlikte, iki ana riskleri lentivirüs kullanılarak çalışmalarda bulunmaktadır. Replikasyon-yetkin lentivirüs üretilmesi için (1) potansiyel. Üçüncü nesil lentiviral sistemi kullanılması halinde, bu riskini büyük ölçüde azaltılabilir. Onkojenezi için (2) potansiyel. Yapılan ekler onkojenik ya da tümör bastırıcılarının bastırmak, bu riski daha da şiddetlenir.HIV tabanlı lentivirüs katılan araştırma faaliyetleri NIH (ve "lentiviral Vektörler ile Araştırma Biyogüvenlik Önlemleri" takip etmelidir http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) ve Biyogüvenlik Komitesi bir onay gerektiren Bir araştırmacının kurumu. Lentiviral vektörleri kullanıldığı takdirde, genellikle, geliştirilmiş Biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) çevreleme laboratuar ayarı için gereklidir.

1. Levha 4 x 10 cm tabaklar ve bir gece kültüre tam eden DMEM ortamı (DMEM% 10 fetal bovin serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ile birlikte) ile birlikte 10 ⁶ HEK 293T hücreleri 37 azından% 5 _CO2 inkübatöründe ° C. I Serum Media (Invitrogen) İndirgenmiş önceden ısıtılmış Opti-MEM 5 ml ortamı yerini alır.
2. ShRNA içeren lentiviral vektör 10 mg, 5 mg üçüncü homo her: Çözüm A hazırlayıntirme lentivirüs ambalaj plazmid (yüksek saflıkta ile hazırlanan; üç ambalaj plazmid VSV-G şunlardır: rev için ve pMDLg / pRRE: bir zarf proteini, pRSV-Rev gag / lentivirüs paketleme için gerekli olan, pol için), 36 2M _CaCI2 ve steril su ile 300 ul'lik ul.
3. Salin Tamponlu 2 × 300 ul Hepes (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 0.5 N NaOH ile 7.12 'e ayarlanır ve 0.22 um bir filtreden ile sterilize pH): Çözelti B hazırlayın.
4. Bir pipetle Çözüm B ile hava kabardığını yavas Bir Çözüm B içine Çözüm bırakın. 30 dk çevre sıcaklığında tüpü bırakın.
5. Yavaşça adım 2,1 hazırlanan HEK 293T hücre kültürü çanağı içine karıştırılmış çözümler A / B açılan ve 4-6 saat boyunca bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edilir.
6. Komple DMEM ortam 7 ml ortamı yerini alır. 24 saat sonra, tam DMEM ortamı ek bir 5 ml ilave edilir. Orta devam hasatkültür başka bir 24 saat sonra lentivirüs aining.
7. 10 dk için 1500 rpm, ortam sıcaklığında, orta dönerler. Bir 0.45 um bir filtreden kullanılarak Süpernatan filtre ve akış boyunca dönmeye 25.000 rpm'de ultra-santrifüj ile lentivirüs içeren ortam (a SW28 rotor sallanan kova ile 125,000 x g eşittir Beckman ultrasantrifüjdeki XL-90), 4 ° C'de 90 dakika süreyle. % 5 ağartıcı (nihai konsantrasyon) ile bir kap için supernatant boşaltacaktır.
8. Soğuk PBS 0.5-1.0 ml lentivirüs pelletini ve tüp başına 50-100 ul içine lentivirüs alikotları olun. -80 Onları saklayın ° C
9. Lentivirüs ve titresi bir real-time PCR protokolü ⁸ ile ticari kitler (örneğin Hücre Biolabs gelen QuickTiter lentivirüs kantitasyonu Takımı, Inc gibi) veya floresan mikroskobu veya akım sitometri kullanılarak eş-ifade floresan işaretleyici belirleyerek tespit edilebilir . Tipik olarak, bir 10 cm kültür çanak 0.5-1.0 hakkında üretebilir × 10 ⁸ enfeksiyontious birim (IU).

3. Enfekte Hücre Enfeksiyon ve Karakterizasyonu

1. Tohum hücreleri% 30-40 konfluent (yaklaşık 5-8 x 10 ⁵ hücreler, hücre boyutuna bağlı olarak) bir 6-kuyulu plakalı içinde tam medyum 2 ml enfekte edilmesi. 37 'de bir gece kültüre hücreleri% 5 _CO2 inkübatöründe ° C.
2. Taze aracı madde 1 ml 8 polybrene arasında ug / ml (Sigma, Katalog # H9268) ya da 5 mg / ml protamin (Sigma, Katalog # P4020) içeren ortam yerini alır.
3. Enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı) floresan işaretleyici ile lentivirüs kullanarak belirli bir hücre hattı için aralık ⁹ uygun bir çokluğu belirleyin. Hesaplamak ve ampirik olarak hücre hattı enfekte etme kullanılmak üzere lentivirüs miktarını belirler. Yavaşça plakasına lentivirüs bırakın ve yavaşça 10 saniye boyunca sallayın.
4. 6 saat boyunca bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edilir ve daha sonra plaka normal bir tam medyum ile orta yerini alır.
5. En az iki dekarys enfeksiyondan sonra, floresan işaretleri ve / ifade lentivirüs için floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin kontrol ve antibiyotik direnç genleri ifade lentiviral vektörler için orta ilgili antibiyotik ekleyin. Bir vektör indüklenebilen için, böyle bir sistemin Tet-on (Şekil 2), kültür ortamı içinde hücreleri tetrasiklin serbest FBS ile hazırlanır. Hücreleri 2-3 gün, enfeksiyondan sonraki ayrıldı. ≥ 2 gün süre ile 1,5 mg / ml doksisiklin (Dox) ve olmadan temin ortamda kültüre onlar tarafından indüklenen geni test etmek için portatif bir hücre kısmı alır.
6. ≥ 2 gün Dox eklenmesinden sonra Western Blot, Real-Time PCR veya immun ≥ 2 gün sonra enfeksiyon, antibiyotik seçimine 2 gün sonra, veya (Tet-On indüklenebilir sistemi için) tarafından gen devirme kontrol edin.
7. Hedef gen kn etkilerini belirlemek için farklı yaklaşımlar (örn. hücre çoğalması deneyleri, yumuşak agar kültür çalışmaları, göç deneyleri, istila testleri ve tümör oluşumu çalışmaları gibi) yararlanınhücrelerin Malignitede ockdown.

4. Xenograftlarında Fare Model Çalışması

1. Fare anesthetization ve farelerin enfeksiyonu önlemek için% 70 etanol enjeksiyonu için tüm yüzeyleri temizleyin. % 2 ile izofluran önce hücre aşılama için bir anestezi indüksiyonu odasında 10 dakika oksijen ile karıştırılır. Atimik çıplak farelerde (NCI-Frederick) uyuştur Bir burun konisi ile oksijen karışık izofluran% 1 ile anestezi koruyun. Mükemmel havalandırma ile bir odada bu adımı gerçekleştirin ve indüksiyon odasına izofluran tutucu filtreleri takın.
2. ShRNAs taşıyan hücreler yayar. Indüklenebilir vektörler Tet-On için tetrasiklin içermeyen aracı kullanın. Hücreler Trypsinize ve% 50 Matrigel içeren tam bir ortam içinde yeniden süspanse bunların. Bir ısıtma yüzeyi üzerine çıplak farelerin (30 ° C) konumlandırmak ve fare başına 1-2 enjeksiyon yerleri ile farelere hücrelerinin 200 ul (1-10 x 10 ^6, kanser hücrelerinin bağlı olarak) enjekte edilir. 25 ile şırınga kullanın.Subkutan enjeksiyonlar ve ortotopik enjeksiyonlar için 28-30 insülin iğnesi için 5 insülin iğnesi.
3. Kurucu shRNA vektörler için, hedef genin shRNA ve bir karıştırılmış shRNA eksprese eden hücrelerle enjekte farelerin 2 grupları kullanmaktadır. Tet-on indüklenebilen shRNA vektörler, hedef genin shRNA ve bir karıştırılmış shRNA, normal su ile sağlanan ve Dox (1.5 mg / ml), su (2 x 2 shRNAs tedaviler = 4 grubu) içeren taşıyan hücrelerin enjekte farelerin 4 gruplar için kullanır . Haftada iki kez Dox içeren su değiştirin.
4. Dijital kumpas, kumpas, haftalık veya iki haftada bir tümörlerin uzunluk ve genişlik izleyin ve formülü V = 1/2 (uzunluk x genişlik ^{2) 10} ile tümör hacim (V) hesaplar. Tümör hacmi kurumsal ACUC ana hatlarını (örneğin vücut ağırlığının% 10 gibi) aşmamaktadır olun. Bu kapsamlı ülserasyon veya nekroz, bariz infectio belirtisi gösterirse kurumsal ACUC tarafından onaylanmış bir protokol kullanarak herhangi bir fare Euthanizen, kontrolsüz kanama veya son evre hastalık.
5. Tümör büyümesi ve metastazı gibi Firefly lusiferaz gibi bir biyolüminesens işaretleyici ^11, ifade inoküle tümör hücreleri için izlenebilir. Fare anesthetization ve farelerin enfeksiyonu önlemek için% 70 etanol ile görüntüleme için tüm yüzeyleri temizleyin. Adım 4,1 açıklandığı gibi fare uyuşturmak. Lusiferin (150 mg / kg) intraperitoneal olarak enjekte edilir. Böyle bir IVIS Görüntüleme Sistemi (kaliper Life Sciences, Inc) gibi ticari bir görüntüleme sistemi, bir dezenfekte görüntüleme haznesine farelere yerleştirin. Oksijen ile karıştırılır izofluran% 1 anestezi korumak için anestezi kolu açın. Mükemmel havalandırma ile bir odada bu adımı gerçekleştirin.
6. 5 dakika teşhir ederek ilk görüntü alın ve sinyal yoğunluğu kontrol edin. Arka plan karşı en iyi sinyal ile görüntüler elde etmek için pozlama süresini ayarlayın. Ampirik görüntüleme zamanı belirleyin, hangi genellikle subkutan tümörler için 1-5 dk.
7. Onaylanmış bir protokol ile fareler EuthanizeTümör boyutları yaklaşık 1.000 mm ^3, ya da ACUC rehberlerinde belirtilen ulaşmak kurumsal ACUC tarafından. Tüketim xenograft tümörler, onları tartmak ve fotoğraf çekmek. Gen test etmek için tümör hücre morfolojisi belirlemek için patolojik analizleri gibi farklı çalışmalar için tümör örnekleri ve Western blot ve Real-Time PCR çalışmaları işleyin.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Atimik çıplak farelerde; Bu protokol Firefly lusiferaz eksprese MDA-MB-231 hücreler (Kaliper Yaşam Bilimleri insan meme kanseri hücresi) xenograft tümör oluşumu YY1 Knockdown etkilerini incelemek için kullanılmıştır. İnsan YY1 of shRNA hedef dizisi "AGC AGA AGC AGG TGC AGA T GGG" edilir. Bir şifreli dizisi "GGG ACT ACT KTHY TTA CGT CAT T" bir de kontrol bilinen herhangi bir transkript önemli bir benzerlik yoktu (devam) shRNA için oluşturuldu. Bir örnek olarak YY1 ile indüklenebilen shRNA yapıları Tet-on yapmak için kullanılan oligonükleotidler,, Tablo 1 'de gösterilmiştir. Sonuç olarak, iki lentiviral vektörler, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA ve PLU-Puro-Indu-devam shRNA, imal edilmiş ve Lentivirüs üretmek için kullanıldı. Bu tek tek tetrasiklin regülatörü (tetr) ve hem de ifade Firefly lusiferaz iki MDA-MB-231 hücre klonu (klon 1 ve 3) enfekte etme bu Lentivirüs kullanılır. Poliklonal hücre popülasyonlarının puromycin seçimden sonra elde edildi. Şekil 3A PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirüs bulaşmış bu MDA-MB-231 hücrelerinde Dox bağlı YY1 devirme gösterir. Daha sonra bu indüklenebilir YY1 shRNA ve devam shRNA Lentivirüs tarafından ayrı ayrı ve enfekte YY1 tükenmesi MDA-MB-231 hücreler (Şekil 3B) invaziv düştüğü görülmüştür klon 3 poliklonal hücreler kullanılmaktadır. Indu-cont shRNA içeren hücreleri (Şekil 3C) bu etki görülmemiştir ise Western blot analizleri, indu-YY1 shRNA ile MDA-MB-231 hücrelerinde Dox bağlı YY1 susturulması doğruladı. Daha sonra kullanılan xenograft fare modeli çalışması için bu hücreleri. Kontrol grupları ile karşılaştırıldığında, indu-YY1 shRNA ile MDA-MB-231 hücreler tarafından implante ve Dox içeren su ile birlikte farelerin (Şekil 4B biyolüminesans (Şekil 4A) tarafından görüntülenmiştir zaman, azaltılmış tümör oluşumunu gösterdi ve tümör ağırlıkları belirlenir ). Bu xenograft tümörlerde YY1 susturulması Şekil 4C gösterilen Western Blot çalışmaları ile doğrulandı.

Şekil 1.. Bir shRNA yapı ve shRNA transkripsiyon nesil için şematik diyagramı. Primerler P1 P6 için (örneğin dizileri için bkz. Tablo 1) gösterilmiştir. Pol III: RNA polimeraz III (d):. Sindirilmiş sonu. Çizim ölçekli değildir. büyük resim görmek için buraya tıklayın .

2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Şekil 2. (A) 'a lentiviral vektör ve (B) mekanizması Tet-on gen suskunluğu için kullanılan promotör indüklenebilen H1. Şematik diyagramı Lentiviral vektör pLL3.7 ¹⁴ dayanan yeniden inşa edildi. H1-Pr: H1 organizatörü; UBC-Pr: İnsan ubikuitin C promoter; Puro: puromycin; TRE: Tetrasiklin duyarlı elementi; Dox: doksisiklin. Tetr: tetrasiklin regülatörü. 5'LTR, 3'SIN-LTR ve WRE bir lentiviral vektör ¹⁴ temel bileşenleridir.

Şekil 3. Dox bağlı YY1 suskunluğu ve MDA-MB-231 hücrelerin invaziv üzerindeki etkisi. Elde edilen iki poliklonal hücre popülasyonlarının A. YY1 seviyeleri tetr-ifade PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirüs bulaşmış ve Dox yokluğunda ve varlığında kültüre klonlar 1 ve 3. Indüklenebilir shRNAs ile MDA-MB-231 hücre B. Boyden odası testi. (* P <0Diğer üç gruba karşı .05). Bu dört hücre popülasyonlarında YY1 ifade C. Temsilcisi Western blot.

Şekil 4. MDA-MB-231 hücreler tarafından xenograft tümör oluşumuna neden olduğu YY1 susturulması Etkileri. Hücre implantasyonu (solda) ve 4 hafta (sağ) yazılan hücre aşılama az IVIS Görüntüleme Sistemi tarafından yakalanan temsilcisi bioluminescent görüntüleri A. şematik. 4 hafta B. Xenograftlarında tümör ağırlıkları. * P ≤ 0.05. C. Batı YY1 ve lekeler ve Dox yokluğunda ve varlığında indu-YY1 shRNA ile MDA-MB-231 hücre xenogreftler içinde β-aktin ifade. Üstüne Etiketler bireysel farelerin isimleridir.

Tablo 1. ShRNA yapıları oluşturmak için kullanılan sentezlenmiş oligonükleotidler. P1 ve fare U6 ve Tet-On indüklenebilir insan H1 sahipleri için P6 dizileri sağlanmaktadır. İnsan YY1 GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. YY1 özgü dizileri vurgulanır bir shRNA hedef sırası ile bir örnek olarak kullanılır. YY1 iki P2 sekansları, sırasıyla iki arttırıcılar için tasarlanmıştır. Bünye U6 / YTet-On H1/YY1 Bu protokolde kullanılan iken Y1 shRNA, daha önce ¹⁵ tanımlanmıştır. P5 vektör spesifik ve pLL3.7 için ¹⁴ gösterilmektedir sekansıdır. Restriksiyon enzim dizileri dizileri PCR amplifikasyon sırasında sahiplerine tavlama için ise, altı çizili italik edilir.

Bu protokol kullanılarak bir gen shRNA sökülebilen ve in vivo olarak tümör hücresi büyümesinin bioluminescent görüntüleme kullanılarak biyolojik etkisini canlandırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir shRNA hedef sitesi (BamHI, HindIII ve EcoRI) kullanılan üç sınırlandırma bölgeleri herhangi bir içermemelidir on klonlama sonrasında için. Nadir bir senaryo bu siteleri arasında herhangi bir mevcut olduğu zaman, ilave bir kısıtlama enzimiyle yapı üreten yerini almak üzere kullanılır.

Bu protokol bazı kilit adımları shRNA lentiviral vektörlerin inşaatı hızlandırmak olacaktır. İlk olarak, U6 veya H1 promotör plazmid içeren PCR şablon lentiviral vektörü (tipik olarak ampisilin) ​​farklı bir antibiyotiğe direnç geninden (örneğin kanamisin gibi) sahip olabilir. Bu plazmid şablon neden dönüşümün arka azaltabilir. İkincisi, bu yetkin E. kullanılması gereklidir dönüşüm yüksek verime sahip coli hücreleri. Potasyum ile bir protokolnd mangan iyonları yetkin E. üretmek için kullanılabilir son derece yüksek yetkinlikleri ¹² ile coli hücreleri. Üçüncü olarak, seçilebilir bir belirteç 3-parçası on klonlama sonrasında kolaylaştırabilir. Örneğin, bir lentiviral vektörü PCR parçası yerleştirilmesi ile değiştirilir ve P3/P4 oligonükleotidler tavlanmış edilecektir β-galaktosidaz için bir ifade kaseti (lacZ) içerecek şekilde planlanabilmektedir. Uçlar olmadan bu mavi olacak ise X-Gal maruz kaldığında bu durumda, uçlar ile rekombinant plazmidleri (5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-galakto-pyranoside), beyaz koloniler oluşturacak .

Lentiviral vektörler ve üç ambalaj plasmidlerin kalitesi etkin lentivirüs üretimi için gereklidir. Kalsiyum fosfat kullanarak çok ekonomik ve verimli transfeksiyon yöntemi sağlanmıştır. Polietilenimin ¹³ ya da en ticari transfeksiyon reaktifler lentivirüs üretiminde de kullanılabilir. Fo MOI uygun kullanmak içinr enfeksiyon, ürettiği lentivirüs ve titreleri belirlemek önemlidir.

Tüm deney grupları Fareler xenograft tümör görüntüleme sırasında biyolüminesans değişimi neden kendi sirkadiyen ritim farkı ortadan kaldırmak için aynı odada muhafaza edilmelidir. Fare ötanazi Yaklaşımları isofluorane CO ₂ boğulma ve aşırı doz içerir ve kurumsal ACUC tarafından onaylanması gerekmektedir.