Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

1, 1,2, 3

1Department of Cell and Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Pharmacology, Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University Medical Center, 3Vanderbilt University Medical Center

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Neuroscience. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.224.75.101, User IP: 54.224.75.101, User IP Hex: 920669029

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

Abstract: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

Den embryonala neurallisten (NC) är en multipotent progenitorcell population som har sitt ursprung vid den dorsala aspekten av neuralröret, undergår en epitelial till mesenkymala övergång (EMT) och migrerar genom hela embryot, vilket ger upphov till olika celltyper 1-3. NC har också en unik förmåga att påverka differentiering och mognad av målorgan 4-6. När explanterade in vitro, NC föregångare genomgår självförnyelse, migrera och differentiera till olika vävnadstyper, inklusive neuroner, Glia, glatta muskelceller, brosk och ben.

NC multipotens beskrevs först från explantat av aviär neuralröret 7-9. In vitro isolering av NC cellerna underlättar studiet av NC dynamik, inklusive spridning, migration och multipotens. Fortsatt arbete i fågel-och råtta-system visade att explanterade NC cellerna behåller sin NC potential när transplanteras tillbaka till embryot 10-13. Eftersom dessa inneboende cellulära egenskaper bevaras i explanterade NC stamfäder ger neuralröret explantatet analys ett attraktivt alternativ för att studera NC in vitro.

För att uppnå en bättre förståelse av däggdjurs NC, har många metoder för att isolera NC populationer. NC-härledda stamceller kan odlas från post-flyttande platser i både embryot och vuxna för att studera dynamiken i post-flyttande NC föregångare 11,14-20, men isolering av NC föregångare när de utvandrar från neuralröret ger optimal bevara NC cell potential och flyttande egenskaper 13,21,22. Vissa protokoll utnyttjar fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera en population NC anrikad på speciella progenitorer 11,13,14,17. Men när man startar med tidig embryon, cellantalen tillräckliga för analyser är svårt att få med FACS, vilket komplicerar isolering av tidiga NC populations från enskilda embryon. Här beskriver vi ett förhållningssätt som inte är beroende av FACS och resulterar i en cirka 96% ren NC befolkningen baserad på en Wnt1-Cre aktiverad härkomst reporter 23.

Metoden som presenteras här är anpassad från protokoll optimerade för odling av rått NC 11,13. Fördelarna med detta protokoll jämfört med tidigare metoder är att 1) ​​cellerna inte odlas på en feeder lager, 2) inte krävs för att få en relativt ren NC befolkning, 3) premigratory NC cellerna isoleras och 4 FACS) resultat är lätt kvantifieras. Vidare kan detta protokoll kan användas för isolering av NC från varje mutant mus-modell, som underlättar undersökning av NC egenskaper med olika genetiska manipulationer. Begränsningen med denna metod är att den NC avlägsnas från ramen av embryot, som är känd för att påverka överlevnaden, migreringen och differentiering av NC 2,24-28.

Protocol: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

1. Förbereder Plattor

  1. Använd steril teknik vid alla tillfällen.
  2. Framställ fibronektin (FN) genom spädning av 100 | il humant plasma FN lager i en slutlig volym av 3,3 ml i Dulbeccos PBS (DPBS). Slutlig koncentration är 30 | ig / ml och denna kan lagras vid 4 ° C under 1 vecka.
  3. Täck botten av varje brunn i en steril vävnadsodlingsplatta fyra brunnar med FN-lösning och låt sitta i 15 minuter. Att säkerställa att hela ytan är täckt. Gör media under denna tid (steg 2 och 3).
  4. Ta FN-lösning och låt plattorna torka. Försiktigt spola brunnar med 500 pl DMEM, ta bort DMEM, och tillsätt 500 pl självförnyelse (SR) medium (se nedan). Inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5 procent CO2. Fyll i detta ungefär en timme innan dissektionen så att plattorna blir torrt före användning.

2. Förbereda SR Medium

  1. För odling av vagala och bål NCfrån tio embryon (ca en kull, beroende på genetisk bakgrund av musen linje), framställa 25 ml av SR-medium. Kombinera 12,5 ml låg glukos DMEM, 7,5 ml Neurobasal-medium, 25 | il retinsyra (117 ^ iM slutlig koncentration), och 25 pl 2-merkaptoetanol (50 mM slutlig koncentration). Blanda väl.
  2. Tillsätt 3,75 ml extrakt Chick Embryo, 250 | il N 2 salt komplement, 500 | il B27 supplement och 250 | il penicillin-streptomycin (1% slutlig koncentration). Filtrera det medium genom ett 0,22 pm filter.
  3. Tillsätt 10 pl sterilt IGF1 (20 | ig / ml slutlig koncentration) och 20 | il sterilt bFGF (20 ng / ml slutlig koncentration). Blanda genom att vända. Lagra vid 4 ° C.

3. Förbereda Wash Medium

  1. För cirka 10 embryon förbereder 50 ml tvätt medium. Kombinera 50 mg BSA med 35 ml lågt glukos DMEM, 15 ml Neurobasal-medium, och 500 | il penicillin-streptomycin (1% slutlig koncentration). Sterila filtret med en 0,22im filter.

4. Framställning kollagenas / dispas

  1. Tillsätt 50 pl av 100 mg / ml kollagenas / dispas till 5 ml DPBS. Blanda väl.
  2. Sprutfilter med ett 0,2 pm filter och tillsätt 1,5 ml i vardera av tre brunnar i en tolv brunnar. Pipetten approximativt 1 ml tvättmedium i de återstående brunnarna. Lagra hela plattan på is tills den ska smälta dissekeras vävnad.
  3. Skär tips av en P20 och P1000 pipett filter spets med en steril rakblad. Skära precis nedanför den avfasade kanten på spetsen. Det avklippta P1000 kommer att användas för att överföra hela embryot medan p20 kommer att användas för att överföra delar av isolerad vävnad.

5. Isolera vagala och Trunk neuralröret från 9,5 DPC embryon

  1. För tidsbestämda graviditeter är dammar med en vaginal plugg övervägas 0,5 DPC vid middagstid på morgonen kontakten observeras. Offra och avlägsna livmodern vid 9,5 DPC.
  2. Ta bort decidua från livmodern och försiktigt rEFlytta embryot från decidua. Gång upplevt detta protokoll, isolera 3-4 9,5 DPC embryon vid en tidpunkt i sterila DPBS. Använd steril teknik och steriliserade instrument dissektion. Instrument kan steriliseras genom autoklavering, värmesterilisering eller genom inkubation i etanol.
  3. För främre vagala NC: använder insulin nålar, skär det neurala röret vid mitten av örat placode. Skära igen vid den bakre kanten av den 4: e somit. Trimma vävnad ventral till neuralröret att ta bort faryngeala valv och hjärta.
  4. För trunk NC: använder insulin nålar, ta bort den del av neuralröret mellan somiter 16-22 (eller det senaste somit om embryon är utvecklingsmässigt tidigare än 22 somit scenen).
  5. Hålla gulsäcken och eventuellt kvarvarande embryonal vävnad för genotypning.

6. Avlägsnande av icke-neural Ektoderm och mesoderm

  1. Placera neuralröret innehållande segment i kollagenas / dispas vid rumstemperatur under 10 minuters. Omedelbart tvätta i tvätt medium.
  2. Återgå vävnad sterila DPBS. Användning av sterila insulin nålar, försiktigt bort den icke-neural ektoderm från vävnaden och separera somiter bort från neuralröret. De sista delarna av mesoderm från somit vävnad kan tas bort genom triturering försiktigt med en cut-down P20 spets. Var noga med att inte skada neuralröret. Följa denna noggrant under rivning.
  3. Placera den isolerade neurala röret genom en andra och tredje 30 andra tvättningen av tvättmedium.
  4. Tvätta en gång i SR-medium, och placera den isolerade neurala röret i mitten av en Fn-belagda brunnen som framställdes ovan (Steg 1.3). Fukta hypoxi kammaren med ett fat med sterilt vatten. Placeras skålen in i kammaren hypoxi och spola kammaren med blandad gas till 3% O2 (använd en tank innehållande en blandning av 1% O2, 6% CO2, 93% N2).
  5. Hantera alltid kammaren väldigt noga för att säkerställa that explantat är ostörda och förblir i mitten av brunnarna.
  6. Inkubera vid 37 ° C. Sammanfattning av stegen 5-6 visas i figur 1.

7. Borttagning av neuralröret

  1. Efter 24 timmars inkubation, avlägsna det neurala röret genom att försiktigt retas kanten av det neurala röret bort från migrerande celler med användning av en steril nål insulin. Ta bort och kasta neuralröret från mediet med en steril P20 snitt som i steg 6,2 och ersätta mediet med färskt SR medium (Figur 2). Detta görs enklast att använda ett inverterat mikroskop.

8. Representativa resultat

Efter 24 timmars inkubation vid 37 ° C i hypoxiska betingelser, har NC celler migrerat bort från den neurala röret i en nästan ren population (figur 3a). Ibland kommer mindre än ideala kulturer inte ge robusta utväxter. Till exempel är det möjligt att efter 24 timmar tHan neuralröret kommer att ha hopkrupen på sig själv och NC kommer inte att migrera bort från det neurala röret (figur 3b). Ibland neuralröret inte fäster vid de fibronektinbelagda plattorna.

Enligt vår erfarenhet kan suboptimal NC migration eller problem med fastsättning av neuralröret påverkas negativt av normoxi tillstånd eller koncentrationen av fibronektin, respektive. Enzymatiska aktiviteten hos kollagenas / dispas varierar något från batch och koktiden måste justeras på lämpligt sätt, dock inte smälta inte vävnaden längre än femton minuter. Overdigestion av neuralröret som innehåller vävnad i kollagenas / dispas kommer också att resultera i brist utväxter. Om somit vävnad inte avlägsnas lätt från den neurala röret efter inkubation i kollagenas / dispas, kan det neurala röret inkuberades under längre än tio minuter. Ibland neuralröret inte kommer att fästa vid substratet. Om så är fallet, dubbelkolla fibronectenn koncentration och hypoxi villkoren.

Medan normoxiska förhållanden kan användas för att odla vildtyp NC, hypoxiska betingelser närmare efterlikna miljön in vivo 29,30. Enligt vår erfarenhet blev hypoxiska förhållanden kritisk när odling mutant NC. Till exempel, när Foxd3 mutanten NC odlades i normoxiska förhållanden, hade stammen NC en mycket reducerad cellutväxt jämfört med kontroller. Denna skillnad i utväxten storlek togs bort när explantaten odlades under hypoxiska förhållanden (Figur 4). Vidare, när vildtyp neuralröret explantat odlades i normoxi var antalet av kaspas-positiva celler större än den hos liknande explantat som odlats i hypoxi (data ej visade). Genom att upprätthålla alla NC kultur i hypoxi, kan jämförelser lättare kan göras mellan dynamiken i kontroll och muterade kulturer.

Figur 1
3% O2 hypoxiska betingelser.

Figur 2
Figur 2. Stegvis avlägsnande av neuralröret från explantatet. Neuralröret ska tas bort efter 24-48 timmar för att förhindra kontaminering med icke-NC celler. A) Lägg märke till gränsen mellan den neurala röret och NC utväxt (heldragen linje). B) skär utmed kanten av det neurala röret med en insulin nål. C) Kassera neurala röret och ersätta mediet med färskt självförnyelse medium. Streckad linje anger omfattningen av utväxt. Förkortning: NT, neuralröret.


Figur 3. Exempel på representativa resultat. A) Typisk explantatet utväxt efter 24 timmars inkubation i självförnyelse medium i hypoxiska betingelser (streckad linje anger omfattningen av utväxt). B) Förstoring av NC utväxt efter 48 timmar i kultur. C) mindre perfekt kultur med lågt utväxt avkastning. A och C odlades under samma betingelser. Bilder visar naturliga utbredningsområde i kultur robusthet. Denna kan påverkas av effektiviteten av neuralröret isolering, koncentrationen av F, hypoxiska betingelser, och tid i kollagenas / dispas digereringar.

Figur 4
Figur 4. In vitro-analyser av NC explantatodlingarna i normoxi kontra hypoxi. Kontroll (vildtyp) NC cellerna migrerat från neuralrörsdefekter explantat efter 48 timmar i normoxiska odlingsbetingelser. I motsats härtill Foxd3 mutantenNC har minskat kraftigt cell utväxter i normoxi (röda konturer markerar kanterna på NC utväxter). När jämförbara explantat odlades under hypoxiska förhållanden växte Foxd3 muterade NC explantaten jämförbart med kontroller, så att efterföljande analyser. Observera detta beteende korrelerade väl med hur Foxd3 mutant NC in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt utvecklingsstadium embryo för att säkerställa framgång i detta tillvägagångssätt. Räkna somiter av tidiga musembryon är avgörande både för scen matcha embryon inom en kull och bestämma rätt regionerna neuralröret för isolering. En variant av en eller två somiter mellan embryon är inom ett rimligt antal utvecklings timing, beroende på upplösningen av genomfört experimentet. Ett embryo mellan 9 och 9,5 DPC kommer att ha mellan 17 och 25 somiter. Om embryot har mer än 25 somiter är NC ytterligare framsteg i utvecklings-tid, och NC utväxter kommer att vara mindre robust i kulturen. Staging embryon baserade på somit antalet underlättar precision i experiment då utvecklingsstadium av embryot, och därför NC, kan påverka resultatet av experimenten. I en 9,5 DPC embryo vandrar vagala NC från den dorsala neuralröret i definierade anterior-posterior gränser: från mitten av örat placode till somit 7.På samma sätt vandrar trunk NC från neuralröret på nivåer somit 8 till somit 24. För att isolera distinkta populationer av NC föregångare som beskrivs i detta protokoll är diskreta sub-regioner inom vart och ett av dessa domäner isolerad. Regionen av neuralröret som används kommer att variera baserat på utformningen av experimentet och den främre-bakre regionen av NC som studeras.

De odlingsbetingelser som beskrivits ovan, innefattande mediet och inkubationsbetingelser, är särskilt anpassad för odling av murin NC. Liknande SR medium användes först för odling av rått NC 11. I våra händer, ger detta råtta medium med tillsats av Neurobasal Medium, en robust utväxt av murina NC stamfäder. Vidare, till skillnad från tidigare arbete avian odling NC celler, är ett matarskikt onödig för odling av däggdjurs-NC med denna metod 11,13,21,22. Även om det finns många protokoll detalj beskriver både fågelinfluensa och däggdjur NC kultur i normoxisk conditi ons 9,22, vi 23 (Figur 4), tillsammans med andra i området 20, har funnit att odla murina NC celler i hypoxiska förhållanden som beskrivs här mycket hjälpmedel överlevnad och självförnyelse, förmodligen på grund hypoxi närmare efterliknar fysiologiska syrehalter inom embryot 20,29,30.

Utvärdering av uttrycket av molekylmarkörer underlättar i hög grad identifiering av NC-celler och deras differentierade derivat. Dessa innefattar expression av Foxd3, p75, och Sox10 för NC stamceller. Markörer av differentierad NC innefattar glattmuskel a-aktin (SMA) för myofibroblaster, gliafibrillärt surt protein (GFAP) för glia, mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor (MITF) för melanocyter, och beta-III-tubulin, protein-genprodukten 9,5 (PGP9.5 ) och periferin för nervceller. Dessa markörer kan användas för att bestämma effektiviteten explantatet och differentiering av ursprungsceller NC.

innehåll "> När denna teknik behärskar, kan odlas NC användas i en mängd olika analyser, inklusive kvantifiering av proliferation, celldöd, migration dynamik och / eller differentiering status. NC kan också vara klonalt odlas för att undersöka självförnyelse eller multipotens av individuella NC progenitorer 23. Efter det neurala röret avlägsnas från kulturerna, dissocierar NC-celler i 100 pl trypsin-EDTA (0,25%) i exakt 5 minuter vid 37 ° C. Reaktionen avbröts trypsin-EDTA i överskott tvättmedium (8-10 mLs) genom tillsats av 800 pl per brunn och överförs till individuella 15 ml rör innehållande tvättmedium. centrifugera försiktigt cellerna vid 150 x g under 3 minuter, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml SR-medium. Räkna celler med användning av en hemocytometer och plattan dem vid en densitet av 25 celler / cm 2. Dessa kolonier seriellt kan passera för att analysera självförnyelse. att analysera multipotens, hålla NC cellerna vid klonal densitet i SR medium under 6 dagar och sedan byta till differentieringmedium (10 ng / ml bFGF och 1% kycklingembryo extrakt). Kultur cellerna i differentiering medium under hypoxi för 8 dagar före analysera kolonin komposition med molekylära markörer som ovan 11.

Sammanfattningsvis ger denna metod för att isolera NC celler från musembryon en matare fri vidhäftande kultur av premigratory NC celler utan användning av FACS. Analys av experiment med användning av dessa celler kan lätt kvantifieras. Även om denna teknik är enkel, sina ansökningar för studier av NC egenskaper migration, självförnyelse och differentiering är stor. Vidare isolerar NC från genetiskt modifierade musembryon möjliggör direkt undersökning av speciella gener och vägar i samband med NC migrering, överlevnad och / eller differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgements: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

Vi vill tacka för Marc Wozniak för video hjälp. Vi vill också tacka för Sean Morrison vid UT Southwestern för den ursprungliga protokollet för NC odling råttceller. Detta arbete stöddes Vanderbilt University Medical Center Academic programstöd och genom bidrag från NIH (HD36720 och HD036720-11S109) och AHA 11GRNT7690040 till PAL, predoctoral stipendier från AHA (0615209B) och NIH (NS065604) till NAM och ERP var stöds av en NIH utbildningsbidrag T32HD007502.

Materials: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (low glucose) GIBCO, by Life Technologies 11885
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103
BSA Sigma-Aldrich A3912-10G
dPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-144
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots
Fibronectin GIBCO, by Life Technologies 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625 Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich D-5637
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Steriflip 0.22 µm filters EMD Millipore SCGP00525
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
0.20 µm filters Corning 431219
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604
Four well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 176740
Collagenase/Dispase Roche Group 269 638 Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots.
Insulin needles (29 ½ gage) BD Biosciences 309306
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg, Inc.
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg, Inc.
Forceps #5 Fine Science Tools For removing uterus and decidua.

References: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

  1. Le Douarin, N. & Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn, Cambridge University Press, (1999).
  2. Kulesa, P.M. & Gammill, L.S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568, doi:10.1016/j.ydbio.2010.05.005 (2010).
  3. Saint-Jeannet, J.-P. Neural crest induction and differentiation. Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com, (2006).
  4. Plank, J.L., et al. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330, doi:10.1016/j.ydbio.2010.11.013 (2011).
  5. Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., & German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160, doi:10.1242/dev.015859 (2008).
  6. Freem, L J., et al. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664, doi:10.1111/j.1469-7580.2010.01295.x (2010).
  7. Cohen, A.M. & Konigsberg, I.R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
  8. Sieber-Blum, M. & Cohen, A.M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
  9. Baroffio, A., Dupin, E., & Le Douarin, N.M. Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
  10. White, P.M., et al. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
  11. Morrison, S.J., White, P.M., Zock, C., & Anderson, D.J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  12. Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., & Cohen, A.M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434, doi:10.1002/cne.901930209 (1980).
  13. Stemple, D.L. & Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  14. Corpening, J.C., et al. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618, doi:10.1002/dvg.20748 (2011).
  15. Biernaskie, J.A., McKenzie, I.A., Toma, J.G., & Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812, doi:10.1038/nprot.2006.422 (2006).
  16. Chung, I.H., et al. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877, doi:10.1002/stem.2 (2009).
  17. Biernaskie, J., et al. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623, doi:10.1016/j.stem.2009.10.019 (2009).
  18. Hagedorn, L., Suter, U., & Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. 126, 3781-3794 (1999).
  19. Heanue, T.A. & Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140, doi:10.1002/stem.557 (2011).
  20. Morrison, S.J., et al. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
  21. Ito, K., Morita, T., & Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525, doi:10.1006/dbio.1993.1154 (1993).
  22. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577, doi:10.1038/nprot.2011.398 (2011).
  23. Mundell, N.A. & Labosky, P.A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652, doi: 10.1242/dev.054718 [pii] dev.054718 (2011).
  24. Gammill, L.S., Gonzalez, C., Gu, C., & Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106, doi:10.1242/dev.02187 (2006).
  25. Gammill, L.S., Gonzalez, C., & Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56, doi:10.1002/dneu.20326 (2007).
  26. Kasemeier-Kulesa, J.C., Bradley, R., Pasquale, E.B., Lefcort, F., & Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847, doi:10.1242/dev.02662 (2006).
  27. Osborne, N.J., Begbie, J., Chilton, J.K., Schmidt, H., & Eickholt, B.J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949, doi:10.1002/dvdy.20258 (2005).
  28. Schwarz, Q., Maden, C.H., Vieira, J.M., & Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169, doi:10.1073/pnas.0811521106 (2009).
  29. Simon, M.C. & Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296, doi:10.1038/nrm2354 (2008).
  30. Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275, doi:10.1002/jcp.21690 (2009).

Ask the Author: Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter