Genetisk studie av Axon Regeneration med odlade Vuxna Mjukstrålar neuroner rotganglion

1. Framställning av Täckglas, odlingsmedium och enzymer Matsmältning

1. Den 12-mm rund # 1 täckglas av glas används för den neuronala kulturen. Täckglasen rengörs med 10% HCl över natten, följt av ultraljud tvätt med destillerat och avjoniserat vatten under 3 gånger (20 min / tid). De rengjorda täckglasen lagras i 70% etanol för framtida användning. Före varje experiment, täckglasen är lufttorkades och placerades i odlingsplattan.
2. Att belägga de torkade täckglasen, 100 | il av beläggningslösning innehållande 100 | ig / ml poly-D-lysin och 10 | ig / ml laminin arbetslösning tillsätts till varje täckglas och odlingsplattan överförs till en 37 ° C inkubator. Efter 1-2 h, är beläggningen avlägsnades lösningen och täckglasen tvättas 3 gånger med steril 1 x PBS.
3. För att framställa den odlingsmediet, den Minimum Essential Medium (MEM) är kompletterad med 5% fetalt bovint serum (FBS), 1 x penicillin-streptomycin-lösning (500 enheter av penicillin och 500 pg streptomycin), 1X GlutaMAX-I tillägg, och de reagens antimitotiska innehållande 20 | iM 5-fluor-2-deoxyuridin och 20 pM uridin (FDU / R). För det serumfria mediet är FBS ersattes med tillägget B27.
4. Kollagenas En lösning framställs genom upplösning av kollagenas Ett pulver med MEM för att få en arbetskoncentration av 1 mg / ml. För trypsin är 1X TrypLE Express användas.

2. Dissektion och skörd av vuxen mus DRG-neuroner

1. Efter euthanizing 6 - till 10-veckor gamla vuxen mus, ta bort rygghuden och avbröt det hela ryggraden. Tvätta bort ryggraden med 1 x PBS 2-3 gånger.
2. Nåla fast bort ryggraden till dissekera plattan med ventrala sidan uppåt och försiktigt avlägsnar muskler att exponera de sensoriska nerverna under ett dissektionsmikroskop. Nerverna är anslutna till DRG på virket nivå är den tjockaste och lätta att hitta. Därför, för de flesta experiment endast den lumbalaDRG skördas.
3. Skär igenom varje kota längs mittlinjen med små saxar och försiktigt ta bort diskarna. Användning av pincett för att dela upp varje kota att exponera ryggmärgen.
4. Att dissekera ut timmer DRG, lyft upp varje virke nerv med pincett och spåra mot ryggmärgen att hitta tillhörande ländryggen DRG (från L1 till L6).
5. Skär av varje DRG från bifogade perifer nerv, dorsala och ventrala rötter med fjäder sax och förvara den i mikrofugrör med MEM-medium placerades på is. Mer DRG vid olika spinala nivåer (t.ex. bröst-DRG) kan dissekeras ut på ett liknande sätt vid behov.

3. Spjälkning och Dissociation av vuxen mus DRG-neuroner

1. Efter uppsamling alla de dissekerade DRG, ersätta MEM-medium med 1 ml kollagenas A-lösning och inkubera mikrofugrör vid 37 ° C under 90 minuter.
2. Ersätta kollagenas En lösning med 500 | il 1 X TrypLE Express såföroreningarna och inkubera vid 37 ° C under 15-20 min.
3. Avlägsna TrypLE Express lösningen och tvätta DRG med 1 ml beredd odlingsmedium (innehållande 5% FBS) under 3 gånger.
4. Lägg 600 xl odlingsmedium och försiktigt pipettera upp och ner för mal sönder vävnaderna i 20-30 gånger med en 1 ml blå, graderad pipett spets.
5. Efter triturering, tillåter de icke-dissocierade vävnader att sedimentera till botten av den mikrofug och överföra cellsuspensionen till en 10 ml sterilt rör. Lägg till ytterligare 600 ul odlingsmedium och upprepa pulverisering steg tills de flesta vävnader är dissocierade. Den erhållna cell-suspensionen innehåller både neuroner och icke-neuronala celler. I de flesta fall är celler från 6 DRG (~ 5 x 10 ⁴⁾ används för en elektroporering reaktion.

4. Genetisk manipulering av neuroner via elektroporering

1. Bereda transfektion lösning genom blandning av den Amaxa nucleofection lösning musneuroner med DNA-plasmider (~ 10 | ig) Eller siRNA oligos (~ 0,2 nmol) för att göra en slutlig volym av 100 | il för varje transfektion.
2. Centrifugera de dissocierade cellerna vid 680 rpm under 7 min vid rumstemperatur, och kasta supernatanten så mycket som möjligt. Tillsätt beredda transfektion lösningen och försiktigt pipettera upp och ner 3-4 gånger med 200 ul pipettspetsar att återsuspendera cellerna.
3. Överföra cellsuspensionen blandades med den transfektionslösning till elektroporation kyvetten och elektroporera cellerna med användning av den Amaxa Nucleofector systemprogrammet G-013.
4. Efter elektroporering, direkt tillsätt 500 pl av förvärmd (37 ° C) kulturmedium innehållande FBS till kyvetten och överföra all lösning (~ 600 | il) i den belagda odlingsplattan vid önskade celltätheterna. För experiment som kräver resuspension och åter-plating är neuroner odlas direkt på plasten odlingsskålen med hög densitet (10000-20000 celler / brunn). För experiment som direkt undersöker Axon tillväxt nervceller är pläterade Onto beskiktade täckglas vid lägre densitet (3000-5000 celler / brunn). Placera odlingsplattan i inkubatorn (37 ° C, _5% CO2).
5. Fyra timmar efter plätering när neuroner har fäst till substraten, försiktigt ersätta odlingsmediet (som innehåller den Amaxa nucleofection lösning) med 500 | il färskt och förvärmd odlingsmedium och återföra plattan till inkubatom för ytterligare odling (37 ° C , _5% CO2). Både odlingsmedium innehållande FBS eller i serumfritt medium kan användas i detta steg.

5. Odling Vuxna DRG-neuroner för Axon Tillväxtanalys

1. För neuroner som transfekterats med DNA-plasmider, kan uttrycket av genen av intresse (t.ex. EGFP) observeras så tidigt som några få timmar efter elektroporering. För nervceller transfekterade med siRNA, vänta vi oftast 3-4 dagar för att ge tillräcklig utarmning av de endogena proteiner. De odlade nervceller kan antingen direkt fastställas för axontillväxt analys vid variooss tidpunkter (1-4 dagar efter elektroporering) eller åter stängts och åter klädd för att analysera axon återväxt (se nedan).
2. För RNAi-medierade förlust av funktion studier kan de odlade nervceller åter upphävas och nytt klädd för att axoner att återföds ständigt från neuroner, i vilka riktade proteinerna redan utarmade. För att göra det, byt ut den gamla kulturen medium med hög densitet odlade nervceller med 1 ml förvärmd nytt medium och pipett försiktigt upp och ner för 6-10 gånger för att återsuspendera bifogade nervceller från odlingsplattan. Eftersom icke-neuronala celler (t.ex. Schwann celler) fäster mycket snävare till kulturen skålen än nervceller, de re-suspenderade cellerna är mestadels nervceller.
3. Överför återsuspenderas neuroner i ett mikrofugrör och försiktigt mal sönder 10-15 gånger för att åter skilja de cellklumpar i enkelcellsuspension.
4. Re-plattan de re-dissocierade neuroner på nyligen preparerat täckglas vid låg densitet (3000-5000 celler / brunn) och kultur över natten (16-24 timmar).

6. Upptagning, immunofärgning och fluorescensavbildning

1. Aspirera mediet och tillsätt 4% paraformaldehyd (PFA) (200 pl / brunn) för att fixera cellerna under 15-20 minuter vid rumstemperatur. De fixerade cellerna tvättas därefter med 1 x PBS under 3 gånger.
2. Aspirera PBS och tillsätt blockeringslösning (1% bovint serumalbumin, 0,1% Triton X-100 och 2,0% normalt getserum i 1 x PBS) till de fasta neuroner under 60 min vid rumstemperatur.
3. För att märka axoner, neuronerna är immuno-färgades med anti-neurofilament eller anti-βIII tubulin-antikropp. För att göra detta, placera en 30 pl droppe av primär antikropp lösning (1:1200 utspädning för-βIII tubulin antikropp) på en parafilm för varje täckglas. Invertera täckglasen och placera dem på den primära antikroppen lösning under 60 min vid rumstemperatur.
4. Återgå täckglas till den ursprungliga odlingsplattan och tvätta dem med 1 x PBS för 3 gånger.
5. Upprepa samma procedur för den sekundära entibody.
6. Tvätta täckglasen med destillerat vatten 3 gånger, och sedan montera täckglas på glasskivor med monteringslösning (t.ex. Förläng Gold antifad).
7. De färgade neuroner kan avbildas med någon fluorescensmikroskopi system utrustat med en digital kamera. Axonet längd mäts och analyseras med bildanalys programvara.

7. Representativa resultat

I avsaknad av tillsatta extracellulära tillväxtfaktorer, de vuxna DRG nervceller brukar börja växa axoner 48 timmar efter första plätering. Axoner visar ofta grenade morfologier (figur 1). I motsats härtill åter pläterade neuroner börjar utvidga axoner endast ett fåtal timmar efter utstrykning, och axonerna långsträckt med mycket reducerad förgrening (figur 2). Dessa resultat antyder att re-pläterade neuroner har liknande egenskaper som de för konditionering skadade neuroner. Genom att använda detta tillvägagångssätt har vi utfört senaste förlustav-funktion studier för att undersöka betydelsen av axonregeneration tillhörande transkriptionsfaktor c-Jun i axontillväxt från vuxna DRG neuron in vitro. Resultaten visade att elektroporering av en grupp av 4 olika siRNA inriktade på olika regioner av c-Jun (ON-TARGETplus) markant reducerad proteinet nivåer av c-Jun i vuxna DRG-neuroner 3 dagar efter transfektion (fig 3) ^9. När nervceller re-pläterad och odlades över natten, axon tillväxt från c-Jun knockdown neuroner reducerades signifikant (Control: 348,37 ± 16.21mm, si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 m, figur 3) ^9. Dessa resultat indikerar att odlade vuxna DRG-neuroner ger en användbar modell för att studera axontillväxt från vuxna nervceller.

Figur 1. Vuxen mus DRG-neuroner odlade vid låg densitet i 3 dagar. Neuronerna färgades med anti - & bETA, III tubulin antikropp. Observera att de flesta axoner visar grenade morfologier. Skala bar: 125 nm.

Figur 2. Re-plätering vuxen mus DRG-neuroner efter 3 dagar i odling. (A) Vuxna DRG-neuroner odlade vid hög densitet under 3 dagar. (B) Re-pläterade vuxna DRG-neuroner odlades vid låg densitet för natten. Observera att de flesta axon visar avlånga morfologier med lite Axon förgrening. Skala bar: 250 m i A och 125 nm i B.

Figur 3. Roll för c-Jun i axontillväxt från vuxna DRG-neuroner in vitro. (A) Western blot-analys av c-Jun i vuxen mus DRG-neuroner efter elektroporering av c-Jun siRNA. Resultatet visar markant reducerad nivå av c-Jun. (B) Kontroll neuroner transfekterade med EGFP blev långa axoner efter re-plating och övernattning kultur. (C) Co-transfection av c-Jun siRNA och EGFP försämrad axontillväxt från vuxna DRG neuron efter re-plating och övernattning kultur. Röd: Tuj-1 färgning, Grön: EGFP. Skala bar: 125 nm. Dessa resultat har publicerats i Saijilafu et al. ^9.

Vuxna DRG nervceller förnya sina axoner kraftigt efter perifer nervskada in vivo och in vitro, vilket ger ett användbart system för att studera axonregeneration hos vuxna djur. In vitro-odling av vuxna DRG nervceller blir en allmänt använd metod för att undersöka de molekylära mekanismer genom vilka Axon förnyelse regleras. In vitro-förfarande mus odla vuxna DRG nervceller som presenteras här möjliggör snabb och effektiv genetisk studie av regenerativ Axon tillväxt. Resuspension och åter-plating förfarande är särskilt användbar för förlust av funktion studier, eftersom den tillåter axoner åter växa från neuroner där riktade proteinet redan slut. Dessutom härmar re-plating odlade DRG-neuroner en in vivo-konditionering skada effekt, vilket ger en mer fysiologisk relevant sätt att studera axonregeneration in vitro.

Transfektionseffektiviteten för vuxna DRG neurons med den beskrivna elektroporering tillvägagångssätt är ca 20-50% för DNA-plasmider, beroende på storleken på de konstruktioner, som är tillräcklig för morfologisk analys av axontillväxt. Jämfört med elektroporering, har den virala genöverföring mycket högre effektivitet, vilket är lämpligt för biokemisk analys med användning av DRG-neuroner. Emellertid att konstruera och producera virus för varje gen av intresse är mycket mer arbetskrävande och tidskrävande. För siRNA oligos kan transfektionseffektiviteten når nästan 90% baserat på den knacka ner effektiviteten av de riktade proteiner (se figur 3A), vilket gör biokemisk analys av vuxna DRG nervceller som möjligt. Emellertid minskar effekten av siRNA efter längre tid på grund av nedbrytning av de siRNA oligos.

När neuroner samtransfekteras med 2-plasmider blandas vid ett förhållande av 1:1, har den plasmid med mindre storlek vanligen högre transfektionseffektivitet än plasmiden med större storlek. Som aresult kommer att justera förhållandet mellan de två plasmidema ändra sam-transfektions-effektivitet i enlighet därmed. För siRNA transfektion, vi ofta tillsammans transfektera nervceller i EGFP att märka nervceller. Eftersom de siRNA oligos är mycket mindre än EGFP är deras transfektionseffektiviteten är mycket högre. Därför, i våra experiment vi tycker i allmänhet att alla EGFP positiva neuroner är också positivt för siRNA.

Många genetiska profiler studier av vuxna DRG neuron efter perifer axotomi har identifierat ett stort antal förnyelse-associerade gener (RAG) ^10-12, som tros ligga bakom förnyelse förmåga vuxna DRG nervceller. Emellertid har funktionerna för dessa trasor i mediering axontillväxt av vuxna DRG-neuroner inte väl karakteriserade. Här har vi undersökt betydelsen av en väl känd RAG, c-Jun, vid förmedling av axon tillväxt från vuxna DRG-neuroner via RNAi-medierad förlust av-funktion tillvägagångssätt. Sådan metod tillhandahåller en värdefull in vitro verktyget undersökningte roller andra trasor i regleringen av Axon förnyelse.