שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

Arias, A., Ureña, L., Thorne, L., Yunus, M. A., Goodfellow, I. Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus. J. Vis. Exp. (64), e4145, doi:10.3791/4145 (2012).

Noroviruses האדם אחראים לרוב המקרים של גסטרואנטריטיס האנושי (GE) ברחבי העולם, הם הבעיה חוזרת בסביבות שבהן בקשר הדוק אדם אל אדם לא ניתן להימנע מכך ^{1, 2.} בשנים האחרונות עלייה בשכיחות של התפרצויות בבתי חולים דווחה, לגרום לשיבושים משמעותיים והיכולת המבצעית שלהם, כמו גם הפסדים כלכליים גדולים. זיהוי של גישות אנטי החדשים הייתה מוגבלת בשל חוסר היכולת של האדם להשלים noroviruses זיהום פרודוקטיבי תרבית תאים ^3. הבידוד לאחרונה norovirus Murine (MNV), קשורה קשר הדוק norovirus האנושי ⁴ אך ניתן מופצות בתאים ⁵ פתחה אפיקים חדשים לחקר אלה פתוגנים ^{6, 7.}

תוצאות MNV שכפול בסינתזה של הגנומי חדש במובן החיובי subgenomic מולקולות רנ"א, האחרון שבהם מתאים תי האחרוןrd של הגנום הויראלי (איור 1). MNV מכיל ארבע מסגרות שונות הקריאה פתוחים (ORFs), מתוכם ORF1 מעסיק את רוב הגנום מקודד שבע ללא חלבונים מבניים (ns1-7) שוחרר מבית מבשר polyprotein. ORF2 ו ORF3 נמצאים בתוך האזור RNA subgenomic ו לקודד את החלבונים קפסיד (VP1 ו VP2, בהתאמה) (איור 1). לאחרונה, זיהינו כי ORF4 נוסף חופפים ORF2 אבל בתוך מסגרת קריאה שונה הוא פונקציונלי מקודד עבור גורם ארסיות המיטוכונדריה מקומי (VF1) ^8.

שכפול וירוסים תחושת חיוביות רנ"א, כולל noroviruses, מתרחש בציטופלסמה וכתוצאה מכך סינתזה של הגנום חדשים הסיר את המיכסה RNA. כדי לקדם את התרגום ויראלית, וירוסים לנצל אסטרטגיות שונות שמטרתן גיוס חלבון הסלולר סינתזה מכונות ^9-11. מעניין לציין, תרגום norovirus הוא מונע על ידי VPg רב תכליתיים חלבונים פריימר ויראליקשור קוולנטית לקצה '5 של שני RNAs גנומית subgenomic ^12-14. זה מנגנון מתוחכם של התרגום עשוי להיות גורם מרכזי היעילות המוגבלת של התאוששות ויראלי ידי הפוכה הגישות המקובלות גנטיקה.

כאן אנו מדווחים על שתי אסטרטגיות שונות המבוססות על הדור של Murine norovirus-1 (המכונה MNV בזאת) תעתיקים כתרים בסוף "5. אחת השיטות כרוכה הן סינתזה במבחנה מכסת של רנ"א נגיפי, ואילו הגישה השנייה כרוכה שעתוק של MNV cDNA בתאים המבטאים T7 רנ"א פולימרז. הזמינות של מערכות אלה גנטיקה הפוכה לחקר MNV ומודל חיה קטנה סיפקה יכולת חסרת תקדים לנתח את התפקיד של רצפים ויראליים שכפול בפתוגנזה ^15-17.

1. RNA תמלול תקרת להתאוששות של MNV זיהומיות

פרוטוקול זה נועד לאפשר התאוששות יעיל של MNV זיהומיות מ cDNA באמצעות בתעתיק במבחנה in vitro הבאים שלה מכסת (סעיף 1.1). תעתיקי את כתרים וכתוצאה מכך הם transfected מכן לתאים להתאושש MNV זיהומיות (סעיפים 1.2 ו -1.3). גישה זו מספקת את השיטה הרגישה ביותר להתאוששות של MNV עם תשואות טיפוסי העולה על 10 ⁵ יחידות זיהומיות לכל 35 מ"מ (קוטר), צלחת של תאים עבור MNV. פרוטוקול הוא כמפורט להלן:

1.1 סינתזה של תמלילי זיהומיות MNV כתרים:

1. לעכל את פלסמיד המכיל את סוג בר MNV cDNA (pT7: MNV 3'Rz) עם Nhe אני להשיג DNA ליניארי Nhe אני מזהה אתר הגבלה ייחודי לאחר תום פולה 3 "זנב MNV הגנום (איור 2).. פלסמידים מטוהרים Linearised הם בדרך כללעם עמודות באמצעות סיליקה (למשל GFX PCR להקת DNA ג'ל טיהור קיט מ GE Healthcare) ו eluted ב H ₂ O.
2. במבחנה לתמלל וקטור linearised באמצעות פולימראז T7-RNA כפי שתואר קודם לכן ^17. ערכות מסחריות רבות זמינות למטרה זו לספק שיטה לשחזור של כמויות גדולות של סינתזת RNA כגון MEGAScript (החיים טכנולוגיות) ו RiboMAX (Promega). תגובות שעתוק הם בדרך כלל DNAse מתעכל לפני ניתוח נוסף, אולם במקרים רבים אין כל הכרח כמו purifications כלוריד ליתיום כמפורט להלן לא להאיץ DNA ביעילות.
3. ניתוח aliquot קטן של התגובה שעתוק RNA, בדרך כלל 0.5 μl או פחות, על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose על מנת להבטיח את התגובה שעתוק עבד ביעילות RNA הוא באורך מלא. בעוד משתמשים רבים עשויים לרצות לרוץ denaturing ג'ל לגודל תקין RNA, אנו משתמשים בדרך כלל לא denaturing agarose ג'ל electrophoresis כשיטה מהירה לנתח שלמות RNA. הגנום MNV המיוצר החל שיבוט cDNA זיהומיות pT7: MNV 3'Rz יפעל על Kbp כ 3 ביחס סולם dsDNA על הלא denaturing agarose ג'ל (איור 3).
4. תחשבי על זה שיטות אחרות זמינים כחלופה לקבל ניתוח מהיר של שלמות RNA כגון שימוש bioanalyser Agilent (איור 3).
5. שים לב, ברזולוציה ג'ל עני יכול להיות נתקל אם RNA יותר מדי טעון. קח בזהירות רבה כדי להבטיח את הג'ל agarose מוכן באמצעות RNAse ללא חומרים כימיים, כדי למנוע השפלה RNA במהלך אלקטרופורזה אשר עשוי להשפיע על החלטת הלהקה. חימום RNA עד 65 ° C ואחריו קירור על הקרח עשוי גם לעזור במקרים מסוימים.
6. לטהר מדגם RNA להסיר את נוקלאוטידים שאינה מאוגדת. שיטות רבות זמינות עבור עמודה זו גישות כולל סיליקה המבוססים זאת בפרוטוקול זה אנו משתמשים בדרך כלל ליתיום כלורי כתחליף חסכוני. עבורלעניין זה, מוסיפים H ₂ O להגיע נפח סופי של μl 100 ולאחר מכן להוסיף 40 μl של פתרון כלוריד משקעים ליתיום (7.5 מ 'LiCl, 50 מ"מ EDTA, pH 8.0, Ambion) ולאחסן את המדגם ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
7. גלולה RNA על ידי צנטריפוגה על 12,000 X גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
8. הסר את supernatant, נזהר שלא להפריע שקוף RNA גלולה ולשטוף אותו μl 150 של אתנול 70%. בצנטריפוגה צינור על 12,000 X גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
9. הסר אתנול האוויר היבש RNA, הימנעות גלולה לחלוטין להתייבש כמו זו יהפכו את resuspension קשה.
10. לאחר מכן, resuspend את תמלילי MNV אל μl 50-100 של פתרון האחסון RNA (Ambion). יש להקפיד על מנת להבטיח את כל RNA נמס כראוי. RNA את צריכה להופיע קשה לפזר באופן מלא, חימום הדגימה עד 60 ° C עשוי לסייע resuspend זה. חומר מסיס אז צריך להסיר בY לפני RNA כימות צנטריפוגה. תעתיקי את מטוהרים הם סגורים ופתוחים ודורשים לאחר מכן בשלב במבחנה מכסת להיות מדבקת (מערכת ScriptCap m7G תקרת, ביוטכנולוגיות Epicentre).
11. לכמת את הרנ"א על ​​ידי ספקטרופוטומטר. בהתאם לאופי ואת קנה המידה של תגובת שעתוק, התשואות אופייניים נעים בין 50-150 מיקרוגרם של RNA לפי התגובה 100 μl שעתוק. שלמות של RNA יש לנתח לפני התגובה מכסת ידי ואוזל 100-300 ng המדגם אל 1% agarose ג'ל (איור 3).
12. כדי לשפר את היעילות של RNA מכסת, 60-70 מיקרוגרם החום של תעתיקי רנ"א MNV על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למקם את הצינור מיד על הקרח. צעד זה עשוי להפחית השפעה מעכבת של מבנה RNA על מכסת. הדופק הצינורית microfuge צונן לאסוף טיפות שנוצרו במהלך שלב החימום.
13. להכין תערובת התגובה מכסת כפי שהוצע על ידי היצרן (ScriptCap m7Gמערכת מכסת, ביוטכנולוגיות Epicentre). בקצרה, להוסיף 60-70 מיקרוגרם של MNV RNA לנפח התגובה האחרון של μl 100. תערובת התגובה מכסת עשוי להכיל 10 μl של 10 x תקרת המאגר (500 מ"מ TrisHCl pH 8.0, 60 מ"מ KCl, 12.5 מ"מ MgCl2), 10 μl של 10 mM GTP, 0.5 μl של 20 S-adenosyl μl מ"מ, מתיונין 2.5 של Scriptguard (100 יחידות), ו 4 μl של האנזים Scriptcap (40 יחידות).
14. במהלך התגובה להגדיר, לשמור על תעתיקי רנ"א על ​​הקרח, כדי למנוע השפלה. מערבבים היטב את התערובת התגובה ואז דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. הערה גודל התגובה עשויה להיות מדורגים על פי כמות של תמליל כתרים הנדרש.
15. לטהר את הרנ"א על ​​ידי משקעים LiCl כמוסבר לעיל (ראה נקודה 1.1.6). ממיסים את גלולה ב μl 50-100 של פתרון האחסון RNA (Ambion) ולכמת את כמות הרנ"א. בדרך כלל, דגימות רנ"א הם מנורמל לאחר מכן מיקרוגרם 1 / μl. שוב, לבדוק את כל RNA נמס כראוי. אם זה לא היה נמס כמו שצריך, לא חוםהוא דגימה עד 60 ° C כדי לאפשר ביטולם. הסר ידי צנטריפוגה כל חומר מסיס לפני RNA כימות.
16. בדוק את שלמות RNA שוב לפני שתמשיך לשלב transfection. למטרה זו, הפעל את כמות ng 100-300 המדגם אל 1% agarose ג'ל (איור 3).

1.2 השחזור transfection נאון בתיווך של רנ"א לתוך Raw264.7 תאים:

להתאוששות של virions MNV זיהומיות בתור תא מתירנית אפשר electroporate תמליל MNV כתרים Raw264.7 לתוך התאים באמצעות מערכת transfection נאון (Invitrogen). Raw264.7 הם תאים רגישים לזיהום MNV, תמיכה סיבובים רבים של שכפול הנגיף לאחר הדבקה חוזרת. כתוצאה מכך, תשואות אופייניות תפנה העולה על 10 ⁵ יחידות זיהומיות לכל מ"ל ב transfection 24 שעות הודעה אבל השיא ב> 10 ⁷ יחידות זיהומיות לאחר 48 שעות.

1. יום אחד לפני טראן, sfection זרע Raw264.7 תאים בכל מוערך 50% confluency. בדרך כלל שני T75 צלוחיות של תאים נדרשים עבור 3 transfections.
2. יום transfection, לגרד את monolayers התא אל שונה Dulbecco הנשרים בינוני (DMEM) המכיל 10% עוברית עגל בסרום (FCS), מה שמבטיח לך לייצר תא בודד ההשעיה על ידי pipetting חזר.
3. קבע את הריכוז של תאים קיימא haemocytometer באמצעות הדרה trypan כחול לתייג את התאים הלא קיימא.
4. גלולה התאים ב 1200 X גרם דקות 5 ו resuspend אותם DMEM FCS המכיל 10% בריכוז סופי של 8 x 10 ⁶ תאים למ"ל.
5. בדיוק לפני, 1 מ"ל transfection aliquot של תאים לכל transfection ו גלולה אותם 1,200 גרם דקות X 2. הסר את התקשורת לשטוף את התאים ב 500 μl של PBS (ללא Mg ^{2 +} / Ca ^{2 +).} לסובב את התאים שוב 1200 X גרם דקות 2. הערה מומלץ לשמור תאים DMEM כל עוד אפשרכמו אחסון PBS עבור תקופות זמן ארוכות עלול לפגוע כדאיות התא וקצב transfection.
6. הסר PBS משפופרות ולהוסיף 130 μl של פתרון resuspension (transfection נאון מערכת קיט, Invitrogen) לריכוז סופי של 6 x 10 ^-7 תאים למ"ל. יש להקפיד על הימנעות resuspend התאים היווצרות בועות דבר אשר יגרום וגרם במהלך transfection ותא הישרדות פשרה.
7. מוסיפים את הכמות המתאימה של תמליל MNV כתרים על התאים (איור 2), בדרך כלל 1.3 מיקרוגרם של RNA כתרים מתווסף 130 μl של תאים resuspended ו מעורב בעדינות. לאחר מכן, לאסוף 100 μl של התערובת ב 100 עצה נאון μl transfection. זהירות יש לנקוט על מנת להבטיח כי אין בועות נוצרות קובט electroporation (ערכת נאון מערכת transfection 100 עצה μl) כמו זה יגרום לכישלון של הניסוי.
8. Electroporate את התאים באמצעות הדופק יחיד V 1700 על 25 אלפיות השניה, ensuring העדר ניצוצות במהלך פועם אשר מצביעים על נוכחות של בועות במדגם. בכל מקרה וגרם צריך להתרחש, לבטל את המדגם וחזור transfection. לשחרר את התאים לתוך צינור Eppendorf המכילה 1 מ"ל של אנטיביוטיקה ללא DMEM FCS המכיל 10%. שים לב כל עצה ניתן לעשות שימוש חוזר עד שלוש פעמים עם מדגם RNA אותה אם מספרים גדולים יותר של תאים transfected נדרשים.
9. לאחר מכן, להפיץ את התאים מן הצינור לתוך בארות עצמאיות המכילים כמות מתאימה של prewarmed אנטיביוטיקה חינם DMEM FCS המכיל 10%. כמו הדרכה כללי, 150 μl של השעיה התא שנוצר במהלך השלב 1.2.8 מספיקים אחד גם צלחת של 24 מנה המכילה 0.5 מ"ל של DMEM prewarmed, בעוד 300 μl מתאימים גם צלחת של 12 מנה המכילה 1 מ"ל של prewarmed DMEM.
10. דגירה התאים ב 37 ° C ו 10% CO ₂ למשך 24 עד 72 שעות. לאחר מכן, שחרר virions זיהומיות מתאי אחד (או יותר)להקפיא את מחזורי ההפשרה ולקבוע titre וירוס במדגם או באמצעות שלט או TCID50 assay. שים לב lysates יובהר על ידי צנטריפוגה של 1-2 דקות במהירות המקסימלית או על ידי סינון שלהם באמצעות מסנן 0.22 נקבוביות מיקרומטר לפני טיטרציה. בדרך כלל, מגיע MNV של הסרט של כ 1 TCID50/ml x ⁶ 10 ב 24 שעות שלאחר transfection ועד 1 x 10 ⁹ ב 72 שעות שלאחר transfection.
11. נוכחות ויציבות של מוטציות הציג pT7: 3'Rz MNV נקבעים בדרך כלל על ידי רצף של וירוסים שניצלו לאחר 2 עד 5 קטעים נוספים Raw264.7 תאים.

1.3 השחזור lipofection אל BHK-21 תאים:

שיטה יעילה יותר ישיר ולעתים קרובות עולה יותר להתאוששות של MNV זיהומיות של תמלילי כתרים היא באמצעות lipofection (Lipofectamine 2000, Invitrogen). בהתחשב בכך Raw264.7 תאים קשה transfect באמצעות גישות השומנים מבוסס שאנחנו בדרך כלל עושים שימוש othאה קל transfect שורות תאים כגון BHK-21 שהוא קו הנציח נגזר fibroblasts התינוק אוגר בכליות. כגישה תקן במעבדה שלנו אנו משתמשים בסר-T7 תאים, נגזרת של קו BHK-21 תאים, כמו בעוד תאים אלה קלים transfect ולתמוך שכפול MNV, הם חסרי קולטן מתאים שיאפשר מספר סבבי זיהום מחדש . כתוצאה מכך, התשואה וירוס שנוצר במערכת זו היא אינדיקציה של מחזור אחד של שכפול הנגיף. גישה זו של שימוש בעיקר כאשר בוחנים את ההשפעה של מוטציות על התאוששות וירוס שכן היא מאפשרת transfections מספר להתבצע ובעלות נמוכה באופן ממשי לעומת transfection נאון בתיווך וגם אינו דורש ציוד מומחה. ראוי לציין כי שורות תאים אחרים זמינים כמו אדם 293T תאים עובריים כליה גם לתמוך בהתאוששות יעילה של MNV אולם התנאים transfection צריך קודם להיות מותאם על מנת להבטיח אספקה ​​יעילה RNA.

1. טריפסיןISE monolayer של BHK-21 תאים (או בסר-T7 תאים), זרעי 7.5 x 10 ⁵ תאים לתוך צלחת בקוטר 35 מ"מ אנטיביוטיקה ללא מדיה צמיחה דגירה של התאים על 37 מעלות צלזיוס עם 10% CO ₂ בלילה. להכפיל את כמות התאים כל צלחת אם transfections מתוכננים ליום כמו זריעה, ולאפשר לתאים לדבוק צלחת 2-3 שעות ב 37 מעלות עם 10% CO _2. שים לב, תאים אחרים המתאימים גישה זו כוללים תאים 293T אדם, אדם קרצינומה hepatocellular Huh7 תאים קוף ירוק אפריקה Cos7 תאים.
2. הסר את התקשורת בין התאים ולהחליף עם 3 מ"ל של התקשורת טריים ללא אנטיביוטיקה על מנת להבטיח יעילות מרבית של transfection.
3. להכין תערובת של 1-2 מיקרוגרם של תמליל MNV כתרים אל μl 100 של Opti-MEM (Invitrogen) ומערבבים את זה עם 4 μl של Lipofectamine 2000 מעורב בעבר μl 100 של Opti-MEM. מערבבים היטב את המדגם על ידי pipetting אותה למעלה ולמטה 15 פעמים. לעזובאת התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
4. מוסיפים את מתחמי transfection המכילים כתרים תמלילי MNV בצורה טיפה מבחינת כדי monolayer את התא בעדינות לנער את הצלחת בכיוונים ניצבים זה לזה.
5. דגירה התאים ב 37 ° C ו 10% CO ₂ למשך 24 עד 72 שעות. לאחר מכן, שחרר virions זיהומיות מתאי ידי הפשרת ההקפאה ולקבוע titre וירוס על ידי assay פלאק או TCID50. התשואות אופייניים של כ 1 TCID50/ml x ⁶ 10 הם הגיעו.

2. שחזור ישיר של MNV זיהומיות מ cDNA של תאים המבטאים T7-RNA פולימראז

פרוטוקול זה נועד לאפשר התאוששות של MNV בתאים על ידי שעתוק של מחסה פלסמיד זיהומיות רצף מלא cDNA גנומי של פולימראז T7 לידי ביטוי בתאים. שורות תאים שונים ניתן להשתמש כדי לשחזר MNV זיהומיות על ידי גישה זו למרות שאנחנו בדרך כלל להשיג את התשואות הגבוהות ביותר עם BHK-21 ו-T7 ב.ס. ר CElls ^15. אנו משתמשים בדרך כלל בסר-T7 תאים שכן הם גדלים מהר יותר מאשר קו BHK ההורים שיבוט. תאים נגועים קידוד (FPV) fowlpox של RNA פולימראז T7 (FPV-T7) ¹⁸ המתפקד כמו וירוס עוזר לנהוג ביטוי של רנ"א נגיפי ושחזור בדיעבד של וירוס מדבק (איור 4). למרות בסר-T7 תאים constitutively אקספרס פולימראז T7-RNA, ביטוי זה אינו מספיק כדי להציל MNV זיהומיות אחרי transfection של pT7: MNV 3'Rz בהעדר עוזר FPV-T7. בעוד התשואות אופייניים של מערכת זו הם לפחות פי 10 נמוך יותר מאשר אלו שתוארו לעיל, גישה זו מספק שיטה מהירה של מוטציות ההקרנה על מנת לאפשר זיהוי של מוטציות מתישה. בדרך כלל שיטה זו משמשת 1 כדי להעריך את הכדאיות של מבנה cDNA. צריך לבנות גם מצליחים לייצר וירוס מדבק או להופיע להניב הנגיף ברמה נמוכה מזו של שיבוט סוג בר זיהומיות, אז מבוססי RNA approaפרק המתואר לעיל מתבצע.

1. Trypsinise monolayer של BHK-21 תאים (או בסר-T7 תאים) וזרעי 7.5 x 10 ⁵ תאים לתוך צלחת 35 מ"מ אנטיביוטיות התקשורת הצמיחה חינם דגירה של התאים ב 37 ° C ו 10% CO ₂ למשך הלילה. הוסף להכפיל את כמות התאים כל צלחת אם transfections מתוכננים ליום כמו זריעה, ולאפשר לתאים לדבוק צלחת 2-3 שעות ב 37 ° C ו 10% CO _2.
2. הסרה של תרבות המדיה הנייד ולהוסיף 700 μl של FPV-T7 היטב כל (איור 4). ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של התא ~ PFU 0.5 דולר, בהתבסס על titrations על fibroblasts העובר הראשוניים עוף, משמש בדרך כלל. עם זאת ראוי לציין כי ההכנות חדשים של נגיף עוזר גדל fibroblasts העיקריים הם טיטרציה תפקודית על מנת לקבוע את המינון הנדרש להתאוששות וירוס יעיל. הפרוטוקולים להפצת ו טיטרציה של FPV-T7 תוארו קודם לכן ^18.
3. בתוךcubate ב 37 ° C ו 10% CO ₂ שעה 1 כדי לאפשר FPV-T7 להדביק את התאים. לאחר מכן יש להוסיף 2 מ"ל של אנטיביוטיקה ללא DMEM FCS המכיל 10% ו דגירה התאים במשך שעה נוספת על 37 ° C ו 10% CO ₂ כדי לאפשר ביטוי T7 רנ"א פולימרז.
4. כדי להמשיך transfection של פלסמיד זיהומיות, קודם כל להסיר את מדיה של התאים הנגועים, לשטוף עם 2 מ"ל של התקשורת (FCS 10% DMEM חינם אנטיביוטיקה), ובסופו של דבר לכסות את monolayer תא עם 3 מ"ל של התקשורת. אנטיביוטיקה לא יש להוסיף את התקשורת כי הם עלולים להפריע ליעילות של Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
5. להכין תערובת של 1 מיקרוגרם של סוג בר MNV cDNA זיהומיות פלסמיד (למשל pT7: MNV 3'Rz) ב 100 μl של Opti-MEM (Invitrogen) ומערבבים את זה עם 4 μl של Lipofectamine 2000 (Invitrogen) מעורב בעבר עם μl של 100 Opti-MEM (Invitrogen). מערבבים היטב את התגובה של pipetting אותה למעלה ולמטה 15 פעמים ולהמשיך לערבב בחדר בטמפהrature במשך 20 דקות.
6. תערובת transfection וכתוצאה מכך יש להוסיף לאחר מכן נפתח חכם monolayer תא הצלחת צריך להיות מזועזע בעדינות בכיוונים ניצבים זה לזה.
7. דגירה FPV-T7 נגוע, MNV פלסמיד-transfected התאים ב 37 ° C ו 10% CO ₂ למשך 24 עד 72 שעות. תאים transfected עם pT7 פלסמיד זיהומיות: MNV 3'Rz בדרך כלל לבלתי של הסרט מ 1 x ^4-5 אוקטובר TCID50/ml x ⁴ 10.

3. נציג תוצאות

שתי גישות הפוכות הגנטיקה היעילה ביותר להתאוששות של MNV זיהומיות בתרבות התא כפי שמוצג באיור 5. MNV זיהומיות של הסרט עם מעל 10 ⁵ TCID50/ml הם התאוששו לאחר 24 שעות לאחר transfection של כתרים MNV RNA Raw264.7 לתוך התאים. באופן דומה, transfection של pT7 פלסמיד זיהומיות: MNV 3'Rz לתוך בסר-T7 תאים נגועים בעבר עם עוזר FPV להביע T7 (FPV-T7) של הסרט הובילה ויראלי בעיקר ערך חצידינג 10 ⁴ TCID50/ml (איור 5). ערכים אלה titre ויראלי שהושגו עם RNA סינתטיים מולקולות דנ"א דומים לאלה שהושגו transfections מעורבים טבעיים VPg צמודות RNA מבודד virions זיהומיות לתוך אותם תאים (איור 5). תוצאות אלו מדגישות את היעילות הגבוהה של גישות גנטיקה הפוכה שתוארו כאן כדי לשחזר מוגדר גנטית גרסאות MNV בתרבות התא.

באיור 1. איור של הגנום MNV ו פלסמיד להתאוששות של וירוס מדבק. ייצוג סכמטי של MNV הגנום הארגון. כל חלבון קידוד באזור באה לידי ביטוי גם בתיבת לבן יחיד. ORF1 מתורגם -7 הלא מבניים חלבונים שונים (ns1 / 2 כדי NS7) שפורסמו מתוך polyprotein מבשר לאחר עיבוד עצמי פרוטאוליטים. 2 ORF מקודד לחלבון חשוב capsid VP1, 3 ORF מקודד שווי קטיןחלבון סיד VP2, ו ORF4 חפיפה עם אזור ORF2 קידוד מקודד גורם ארסיות VF1. RNAs גנומית subgenomic מכילים זנב פולה הקצוות 3 'שלהם באורך משתנה. ב ', פלסמיד המכיל MNV cDNA שימוש בגישות גנטיות הפוכה שלנו (pT7: MNV 3'Rz). MNV cDNA הוא קיבע את הזנב של פולה 26 שאריות של הקצה 3 'שלה. רצף cDNA MNV ממוקם מיד במורד הזרם של רצף T7 מקוצץ מקדם, לאפשר T7 מונע שעתוק, ואת הזרם של Nhe ייחודי אני באתר רצף הדנ"א המקודד ribozyme עצמית ביקוע אחריו. רצפים אלה סייעה להבטיח סיום RNA תעתיק מיד אחרי הנוכחית פולה הגנומי הזנב בסוף "3.

איור 2. סקירה כללית של פרוטוקול להתאוששות של MNV זיהומיות מ-RNA יתוכתבו כתרים במבחנה pT7 פלסמיד. MNV 3'Rz הוא linearised מיד במורד הזרםרצף הגנום MNV באמצעות Nhe האנזים אני הגבלה (שלב 1). לאחר טיהור DNA, MNV תעתיקי הרנ"א נוצרות במבחנה באמצעות T7 רנ"א פולימרז (שלב 2). מוצרים שעתוק לרוץ בדרך כלל עם ניידות לכאורה של 2.5-3KB על הלא denaturing 1% agarose ג'ל (שלב 3, איור 3). ה-DNA תבנית מסולק באמצעות מסחרי RNAse ללא DNAse. RNA מטוהרים מכן על ידי LiCl משקעים (שלב 4) של נוקלאוטידים חופשיים. המוצר RNA מטוהרים עשויים אז להיות במבחנה כתרים לאחר מחומם בעבר על 65 מעלות צלזיוס להתגלות משני מבנים RNA (שלבים 5-6). לאחר טיהור ידי LiCl רטיבות, RNA הוא transfected או תחת Raw264.7 תאים (מערכת נאון transfection, Invitrogen) או בסר-T7 תאים (Lipofectamine 2000, Invitrogen) (שלבים 7-8). פעם בתוך התא, כתרים תעתיקי רנ"א יתורגם חלבונים נגיפיים אשר לזרז שכפול נגיפי תמלילי לניו מולקולות רנ"א MNVהמכיל מולקולה VPg הנכון בסוף 5 "שלהם. מחזורים רצופים של שכפול בליווי תרגום ויראלי היה לייצר מספר רב של הגנום הנגיפי אשר יהיה encapsidated ליצור virions זיהומיות. כדי להקל על שחרור הנגיף לתאים, מחזור אחד או כמה ההקפאה ההפשרה מבוצעות (שלב 9). התשואות ויראלי ניתן לקבוע מכן על ידי TCID50 או assay נהלים פלאק.

איור 3. ניתוח של שלמות MNV תעתיקי רנ"א לאורך הפרוטוקול. שלמות, של MNV RNA מסונתז במבחנה. PT7 פלסמיד: MNV 3'Rz הוא linearised ראשית באמצעות Nhe האנזים אני הגבלה. לאחר טיהור DNA, MNV תעתיקי הרנ"א נוצרות במבחנה באמצעות T7 רנ"א פולימרז (מסלול 2). רנ"א הוא אז purifi אד מ נוקלאוטידים חופשיים ידי LiCl למשקעים (מסלול 3). מוצרים שעתוק מנוהלות על ג'ל שאינו denaturing agarose 1% במקביל 1-Kb סולם DNA (ניו אינגלנד Biolabs, מסלול 1). ניידות היחסי של תמלילי ויראליים תחת תנאים שאינם denaturing דומה למוצר dsDNA של 2.5-3 KB. ב ', Integrity של תעתיקי רנ"א MNV לאחר מכסת. תמלילי MNV מטוהרים בעבר על ידי LiCl למשקעים (מסלול 2) נאלצים לעבור את מכסת האנזימטית (במסלול 3) וטיהור על ידי LiCl למשקעים (מסלול 4). C, ניתוח שבב RNA Agilent 6000 Nano של תמלילי MNV (מסלול 2) ו תעתיקי MNV כתרים (במסלול 3) אשר היו שהאיצו בעבר LiCl. סולם ssRNA מנוהל במקביל.

= "Pdflinebreak">
באיור 4. סקירה כללית של פרוטוקול להתאוששות של MNV זיהומיות של cDNA. בתחילה, ב.ס. ר-T7 (או BHK) תאים נגועים בווירוס fowlpox רקומביננטי (FPV) להביע bacteriophage T7 רנ"א פולימרז (FPV-T7) (שלב 1). התאים הנגועים מודגרת למשך 2 שעות לפני טיפול נוסף כדי לאפשר ביטוי של חלבונים FPV הכולל פולימראז רקומביננטי T7-RNA (שלב 2). לאחר מכן, pT7: MNV 3'Rz הוא transfected לתוך התאים באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (שלב 3). פעם בתוך התא, pT7: MNV 3'Rz מוכר על ידי RNA פולימראז T7 אשר synthesises MNV תעתיקי רנ"א (שלב 4). נוכחות רצף δ-Ribozyme עצמית השחיטה ב 3'end של הגנום מבטיח לא 3 תמליל "erminus ממוקם מיד אחרי הזנב פולה (שלב 5). התמלילים הם חלק ויראלי כתרים intracellularly ידי אנזים FPV מכסת (שלב 6). תמלילי כתוצאה מכך MNV כתרים יתורגמו ליצירת חלבונים MNV אשר לזרז MNV שכפול תעתיקים. מסונתז חדש MNV המכילים מולקולות RNA מולקולה VPg הנכון בסוף 5 "שלהם היו עוברים מחזורים רצופים של שכפול בליווי תרגום ויראלי אשר עשוי בסופו של דבר לגרום לדור של וירוס encapsidated זיהומיות. כדי להקל על שחרור הנגיף לתאים, מחזור אחד או כמה ההקפאה ההפשרה מבוצעות (שלב 7). התשואות ויראלי ניתן לקבוע מכן על ידי TCID50 או assay נהלים פלאק.

איור 5. תוצאות נציג של וירוס של הסרט המתקבל גנטיקה הפוכה שונה מתקרב לתאר בטקסט. ברים מייצגים את גריי של הסרט וירוס שהתקבלו לאחר 24 שעות לאחר נאון-Transfection של 2 x 10 ⁶ תאים Raw264.7, או לאחר השאיבה-transfection של 2 x 10-T7 ב.ס. ר ⁶ תאים במבחנה יתוכתבו כתרים MNV RNA. ברים לבנים מייצגים titre וירוס שהושג בדרך כלל לאחר lipofection של pT7: MNV 3'Rz (MNV cDNA) לתוך 2 x 10-T7 ב.ס. ר ⁶ תאים שנדבקו בעבר עבור 2 שעות עם וירוס fowlpox המבטאים רקומביננטי פולימראז T7 (FPV-T7). כביקורת חיובית transfection לתוך גלם למוצרי ב.ס. ר T7cells, אנו משתמשים בדרך כלל 2 מיקרוגרם של RNA המופקים תאים נגועים MNV המכילים רמות גבוהות של VPg צמוד MNV RNA. בקרות שליליות בוצעו גם עם RNA MNV או pT7: MNV 3'Rz קידוד מוטציה frameshift (F / S), אשר מבטלת שכפול, וכתוצאה מכך הנגיף אינו ניתן לזיהוי (מידע לא מוצג).

כאן אנו הדגימו שתי גישות שונות גנטית הפוכה המאפשרים התאוששות MNV מדבקות תרבית תאים. שתי הגישות יעילות לעקוף את הדרישה מוחלטת הצמדה קוולנטית של VPg עד הסוף '5 של הגנום RNA ויראלי באמצעות הדור של כתרים תמלילי MNV המוכרים מכן על ידי הריבוזומים הסלולר. ב שעתוק במבחנה ואחריו enzymatically מכסת יעיל יותר ההתאוששות של MNV זיהומיות מאשר שעתוק של פלסמידים זיהומיות בתאים המבטאים T7 רנ"א פולימרז, שבו תעתיקי ניתן כתרים על ידי אנזימים FPV פיקוק. וירוס של הסרט התאושש עם מערכות אלה גנטיקה הפוכה דומים אלה שהושגו על ידי transfection של VPg צמודות רנ"א נגיפי מטוהרים מן בתרביות תאים נגועים ¹⁷ (איור 5). Transfection של כתרים MNV RNA לתוך תאים Raw264.7 מתירנית הופך titre וירוס רק 1-log נמוך ניסויים הקשורים transfection של RNA הכולל תאים נגועים המכילים ויראלי VPg צמוד RNA (איור 5). עובדה זו מעודדת בדיקות נוספות כדי לקבוע אם תוספת של מולקולת VPg עד הסוף '5 של תמלילי שנוצר על ידי מערכות אלה עלול לגרום עלייה בתשואות וירוס אשר עשוי לחשוף היבטים פונקציונליים שבבסיס infectivity MNV בתאים הקשורים VPg. עם זאת, אנו רואים במערכת זו גנטיקה הפוכה כמו 1 היעילה ביותר להשוות אחרים וירוסים RNA להפוך מערכות גנטיקה המשמש כיום שבו במבחנה RNA עיבד מאפשר התאוששות של הסרט רק 10-100 נמוך יותר מאשר זיהומים אמיתיים עם ^{19 virions, 20.}

בסך הכל, את שיטות הנוכחי מהווה צעד משמעותי קדימה בתחום של ביולוגיה מולקולרית norovirus לספק לנו את הכלים לחקור את התפקידים תפקודית של חלבונים ונשמר מוטיבים רנ"א ב הגנום norovirus. גישות אלה כבר בשילוב עם גבמודל עכבר urrent זמין הראו כי MNV התאושש cDNA זיהומיות יכול לגרום לזיהום קטלני של> 80% STAT1-/ - העכברים בתוך פחות מ -10 ימים ^{4, 21.} תוך שימוש במערכת זו אנו התאוששו קיימא מוטציות norovirus Murine של החלבון capsid של מערכת polypyrimidine מעורב מחייב גורמים מארחים שונים (PTB ו PCBP) המציגים פנוטיפים נחלש מעט ב ^{21 vivo, 22.} בנוסף, הראו לאחרונה כי וירוסים חסרי יכולת לבטא את החלבון VF1 מ ORF4 ביעילות לשכפל תרבית תאים אבל שוב צמצמו ארסיות בעכברים לגבי WT MNV ^8. מחקרים אלו מעודדים אותנו לעצב גרסאות נחלש noroviruses של אדם בהתבסס על מחקרים MNV אשר יכול להיחקר כמועמדים פוטנציאליים לחיסון.

אין לנו מה למסור.

מחקר זה מומן על ידי עמיתי הקרן Wellcome בכיר הוענק לאיאן גודפלו, וגם מארי קירי תוך אחוות האירופי (FP7 המועצה האירופית למחקר) הוענק ארמנדו אריאס. אנו רוצים להודות איו הונג צ'ונג, ד"ר רבקה וד"ר רובי מייק סקינר שנתן לנו רשות להשתמש bioanalyser Agilent שלהם ולעזור בניהול דגימות רנ"א.

1. Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States, 2002. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-5 (2002).
2. Lopman, B.A., et al. Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003. Emerg. Infect. Dis. 10, 1827-34 (2004).
3. Duizer, E. et al. Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).
4. Karst, S.M., Wobus, C.E., Lay, M., Davidson, J., & Virgin, H.W.T. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus. Science. 299, 1575-8 (2003).
5. Wobus, C.E., et al. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
6. Bok, K., et al. Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome. Virology. 380, 328-37 (2008).
7. Kim, Y., Thapa, M., Hua, D.H., & Chang, K.O. Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection. Antiviral Res. 89, 165-73 (2011).
8. McFadden, N., et al. Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4. PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).
9. Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., & Goldbach, R. Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs. J. Gen. Virol. 73 (Pt. 8), 2125-8 (1992).
10. Shuman, S. & Hurwitz, J. Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-91 (1981).
11. Jang, S.K., Pestova, T.V., Hellen, C.U., Witherell, G.W., & Wimmer, E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 44, 292-309 (1990).
12. Chaudhry, Y., et al. Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components. J. Biol. Chem. 281, 25315-25 (2006).
13. Goodfellow, I., et al. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E. EMBO Rep. 6, 968-72 (2005).
14. Herbert, T.P., Brierley, I., & Brown, T. D. Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J. Gen. Virol. 78 ( Pt 5), 1033-40 (1997).
15. Chaudhry, Y., Skinner, M.A., & Goodfellow, I.G. Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J. Gen. Virol. 88, 2091-100 (2007).
16. Ward, V.K., et al. Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-5 (2007).
17. Yunus, M.A., Chung, L.M., Chaudhry, Y., Bailey, D., & Goodfellow, I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 169, 112-8 (2010).
18. Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., & Domingo, E. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS One. 5, e10735 (2010).
19. van der Werf, S., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F.W. & Dunn, J.J. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-4 (1986).
20. Bailey, D., Thackray, L.B., & Goodfellow, I.G. A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J. Virol. 82, 7725-8 (2008).
21. Bailey, D. et al. Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence. J. Virol. 84, 2859-70 (2010).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.