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 JoVE Bioengineering

ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

, , , ,

School of Biomedical Engineering, Science and Health Systems, Drexel University

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Cite this Article: ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

Tchafa, A. M., Shah, A. D., Wang, S., Duong, M. T., Shieh, A. C. Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion. J. Vis. Exp. (65), e4159, doi:10.3791/4159 (2012).

Protocol: ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

1. सेट - अप परख

  1. 4 डिग्री सेल्सियस (लगभग 2 घंटा) में बर्फ पर Matrigel का एक छोटा सा अशेष भाजक (<500 μl) पिघलना.
  2. जेल (उदाहरण संस्करणों तालिका में नीचे देखें) नुस्खा तैयार: 10x (1x कुल मात्रा में) Pbs, 1N सोडियम हीड्राकसीड (जोड़ा कोलेजन की 0.023 मात्रा के बराबर, या कोलेजन के निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, उचित रूप में), Matrigel और कोलेजन मैं टाइप करने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल और 1.3 मिलीग्राम / क्रमशः मिलीलीटर (अन्य मैट्रिक्स योगों के सेल प्रकार और प्रयोग के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है) की अंतिम सांद्रता.

उदाहरण जेल नुस्खा

अवयव स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता मात्रा जोड़ें
10X पीबीएस 10X 1X 0.090 मिलीग्राम
बाँझ पानी 0.346 मिलीग्राम
1N NaOH 0.008 मिलीग्राम
Matrigel 9.90 मिलीग्राम / एमएल 1 मिलीग्राम / एमएल 0.101 मिलीग्राम
चूहा पूंछ प्रकार मैं कोलेजन 3.66 मिलीग्राम / एमएल 1.3 मिलीग्राम / एमएल 0.355 मिलीग्राम
  1. एक ही रूप में ऊपर और 1 घंटे के लिए सेते हैं अंतिम समाधान अनुक्रम में 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर जेल के घटकों का मिश्रण हमारे अनुभव में, एक 1 घंटा सेल कोलेजन का एक और अधिक समान जमाना में बोने के परिणाम के लिए पूर्व ऊष्मायन. बर्फ पर हर समय Matrigel और कोलेजन और रखने के लिए के रूप में तेजी से संभव काम करने के लिए जमाना रोकने के लिए सुनिश्चित करें कि.
  2. Place 12 मिमी व्यास 8 माइक्रोन एक 12 अच्छी तरह निष्फल संदंश का उपयोग कर प्लेट में ताकना सेल संस्कृति आवेषण.
  3. 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल (जेल समाधान की कुल मात्रा का 10% होना चाहिए) में सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं और resuspend गिनती.
  4. सेल र के 100 μl जोड़ेंजेल समाधान के 900 μl (अंतिम सेल 5 एकाग्रता x 10 5 कोशिकाओं / एमएल) spension और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से.
  5. प्रत्येक डालने और 30 मिनट के लिए हस्तांतरण के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर के लिए अंतिम मिश्रण के 150 μl जोड़ें तक जेल polymerizes है.
  6. सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग
  • स्थैतिक हालत के लिए डालने के तहत 1200 μl जेल के शीर्ष पर 100 μl जोड़ें. और अच्छी तरह से में डालने के बाहर के अंदर तरल पदार्थ का स्तर लगभग बराबर हो सकता है, जेल और कोई बीचवाला प्रवाह नहीं भर में कम से कम दबाव अंतर में परिणाम चाहिए.
  • डालने और फ्लो हालत के लिए 650 μl जेल से ऊपर के तहत 100 μl जोड़ें. किसी भी हवाई बुलबुले डालने के नीचे से बचने के लिए सावधान रहो, के रूप में वे इन स्थानों पर झिल्ली के माध्यम से पलायन से कोशिकाओं को रोकने जाएगा. इन संस्करणों से उत्पन्न दबाव अंतर लगभग 1.3 सेमी एच 2 हे (या 1 मिमी Hg) है.
  1. 37 में जगह प्लेटडिग्री सेल्सियस, 5% से 24 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर.

2. सेल धुंधला हो जाना और गिनती

  1. 1X पीबीएस के 500 μl प्रति में अच्छी तरह से नई प्लेट 24 अच्छी तरह से जोड़ें, यह आवेषण को धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. प्रवाह transwells के ऊपरी भाग में शेष मध्यम निकालें और मात्रा निर्धारित है. मूल जोडी, 650 μl (इस प्रवाह की दर की गणना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, नीचे देखें) कुल मात्रा से शेष मात्रा subtracting द्वारा कुल eluted मात्रा की गणना. कपास swabs प्रयोग आवेषण से जेल को हटाने और गैर आक्रमण कोशिकाओं को दूर करने के लिए झिल्ली की शीर्ष सतह पोंछे. आवेषण 24 15 एस के लिए अच्छी तरह से 1X पीबीएस युक्त आवेषण धोने थाली में रखें.
  3. पीबीएस निकालें और प्रत्येक और कमरे के तापमान पर 30 मिनट transmigrated कोशिकाओं को ठीक करने के लिए डालने सेते हैं नीचे 4% paraformaldehyde की (पीएफए) के 500 μl जोड़ें.
  4. पीएफए ​​निकालें और 500 μl 1X पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला अवशिष्ट लगानेवाला हटाने.
  5. 500 μl ओ जोड़ेंच 0.5% नीचे ट्राइटन सम्मिलित करता है और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं कोशिकाओं permeabilize X-100 समाधान.
  6. झिल्ली कट बाहर डालने के 2 μg / - 1X पीबीएस समाधान में मिलीलीटर DAPI के 100 μl में एक रेजर ब्लेड और जगह का उपयोग कर सावधान किया जा रहा है झिल्ली नीचे चेहरे के नीचे जगह (transmigrated कोशिकाओं नीचे चेहरा).
  7. और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 150 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर एल्यूमीनियम पन्नी और जगह में लपेटें थाली.
  8. 500 प्रकार के बरतन पर μl 1X पीबीएस मुक्त DAPI को दूर (10 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार दोहराने) में झिल्ली धो लें.
  9. Transmigrated कोशिकाओं का सामना करना पड़ के साथ गिलास स्लाइड पर जगह झिल्ली, बढ़ते समाधान और कवर पर्ची जोड़ें.

3. डेटा विश्लेषण

  1. प्रत्येक झिल्ली 5 स्थानों (बेतरतीब ढंग से चुनी किनारों से दूर रहने और एक 10X या 20X उद्देश्य लेंस का उपयोग करें) पर DAPI दाग नाभिक गिनती.
  2. औसत कोशिकाओं की संख्या की गणना और निम्न सूत्र का उपयोग करके प्रतिशत आक्रमण प्राप्त:
    प्रतिशत आक्रमण = 100% (औसत कोशिका गिनती x झिल्ली सतह क्षेत्र x) / (कोशिकाओं वरीयता प्राप्त माइक्रोस्कोप छवि एक्स संख्या की सतह क्षेत्र)
    प्रतिशत आक्रमण कुछ नियंत्रण (आम तौर पर स्थिर हालत) हालत स्वतंत्र प्रयोगों के बीच तुलना के लिए अनुमति देने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है.
  3. ऊष्मायन समय (उदाहरण के लिए, 24 घंटे) के द्वारा प्रवाह हालत में कुल eluted मात्रा में विभाजित: औसत प्रवाह दर की गणना.
  4. औसत प्रवाह के वेग की गणना: / जेल झिल्ली (इस मामले में 60 मिमी 2) के पार के अनुभागीय क्षेत्र से औसत प्रवाह दर विभाजित.

4. प्रतिनिधि परिणाम

बीचवाला प्रवाह के तहत ट्यूमर सेल आक्रमण को मापने के लिए, हम हमारे प्रवाह 3 डी आक्रमण परख एमडीए MB-435S metastatic मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग कर प्रदर्शन किया. इन कोशिकाओं को पहले मध्य द्रव 13-14 प्रवाह के जवाब में आक्रमण दिखाया गया है. कोशिकाओं 1.3 मिलीग्राम / एमएल चूहा ताई से बना मैट्रिक्स में एम्बेड किया गयाएल पट्टा कोलेजन प्रकार मैं और 1 मिलीग्राम / 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम सेल एकाग्रता पर मिलीलीटर Matrigel तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स. दो अलग अलग परिस्थितियों की तुलना में थे: (1) औसत बीचवाला प्रवाह = 0.1 माइक्रोन -1 है और (2) स्थिर हालत = कोई औसत दर्जे का प्रवाह दर (चित्रा 1).

24 घंटे के बाद, कोशिकाओं है कि झिल्ली के pores के माध्यम से हमला किया DAPI साथ दाग रहे थे करने के लिए सेल गिनती की सुविधा चित्रा 2 आक्रमण कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है. Brightfield के तहत, केवल झिल्ली pores दिखाई दे रहे हैं. प्रतिदीप्ति का प्रयोग, DAPI से सना हुआ नाभिक सेल गिनती और phalloidin एफ actin के दाग संरचनाओं के लिए इस्तेमाल किया गया सेल शरीर (वैकल्पिक) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. एक छात्र के टी - परीक्षण का उपयोग बराबर प्रसरण संभालने, हम पता चला है कि बीचवाला प्रवाह काफी स्थिर शर्तों पर 2.3 गुना (पी 0.003 =) (चित्रा 3) के द्वारा एमडीए MB-435S सेल आक्रमण बढ़ जाती है. यह corrobora(समान लेकिन अलग मैट्रिक्स की स्थिति और इसलिए प्रवाह वेग के साथ) निष्कर्ष इस सेल 13-14 लाइन का उपयोग tes.

चित्रा 1
चित्रा 1 3 - ​​डी मध्य द्रव प्रवाह आक्रमण परख के योजनाबद्ध. पहले जेल समाधान उपयुक्त सांद्रता और संस्करणों का उपयोग कर तैयार करते हैं. फिर जेल समाधान करने के लिए कोशिकाओं को जोड़ने और सेल संस्कृति आवेषण करने के लिए स्थानांतरण. अंत में प्रत्येक शर्त के लिए मीडिया की उचित मात्रा जोड़ने और सेते हैं. मध्य द्रव प्रवाह द्रव दबाव सिर द्वारा संचालित है.

चित्रा 2
चित्रा 2 झिल्ली पर एमडीए MB-435S कोशिकाओं Transmigrated. उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत झिल्ली) चित्र, पर आक्रमण कोशिकाओं हमारे मध्य द्रव प्रवाह आक्रमण परख और DAPI और एलेक्सा स्त्राव के साथ सना हुआ 488 संयुग्मित phalloidin आक्रमण कोशिकाओं की गिनती की सुविधा के बाद तय किया गया बी) DAPI स्टेशनined नाभिक (नीले में), सी) एलेक्सा Fluor 488 - phalloidin दाग एफ actin (हरे रंग में). पैमाने बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 प्रवाह के तहत एमडीए MB-435S कोशिकाओं के आक्रमण में वृद्धि. 24 घंटे के बाद सेल आक्रमण काफी बीचवाला प्रवाह (पी 0.003 =) द्वारा बढ़ाया. परिणाम औसत स्थिर हालत सामान्य हैं और मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं मतलब ± 6 सेल संस्कृति सम्मिलित SEM.

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Discussion: ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

यहाँ हम ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला प्रवाह के प्रभाव को बढ़ाता है, एक सेल संस्कृति डालने के भीतर एक 3 डी मैट्रिक्स में एम्बेडेड कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन किया है. यह और इसी तरह के तरीकों सेल प्रकार 13-15, 17 की एक किस्म के पर बीचवाला प्रवाह के प्रभाव का अध्ययन किया गया है. हमारा दृष्टिकोण आंशिक रूप से ट्यूमर के प्रकार का उपयोग करके मैट्रिक्स microenvironment mimics के मैं कोलेजन और Matrigel जो उपकला ऊतक और आसपास के 21-22 stroma के तहखाने झिल्ली में पाया प्रोटीन होते हैं. यह प्रणाली अपेक्षाकृत करने के लिए सेट - अप आसान, सरल, और अधिक सबसे microfluidic उपकरणों है कि इन विट्रो में 23-24 मध्य द्रव प्रवाह का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है की तुलना में लागत प्रभावी है. यह पंप या विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और कई एक साथ परीक्षण किया जा स्थितियों के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, माप मौजूदा Boyden कक्ष assays के उन सामान्यतः करने के लिए आक्रमण और migra परीक्षण किया तुलना कर रहे हैंकैंसर कोशिकाओं के tion.

सेल प्रकार और मैट्रिक्स की संरचना से बदल रहा है, विभिन्न जैविक प्रणालियों मॉडलिंग के रूप में 13 स्तन कैंसर, रक्त 15 जहाजों, और वृक्ष के समान सेल 17 की तस्करी हो सकता है. मैट्रिक्स के गुण और संरचना और नियमन दबाव सिर फेरबदल भी मध्य द्रव प्रवाह वेग बदलने के लिए, इस प्रकार परख ब्याज की जैविक प्रणाली पर निर्भर मापदंडों में लचीलापन के लिए अनुमति देता है. इस प्रणाली को भी सह संस्कृति assays में इस्तेमाल किया जा सकता है 17 14.

आक्रमण को मापने के अलावा, मध्य द्रव प्रवाह परख यहाँ वर्णित करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेल प्रसार और सेल संकेत घटनाओं में मतभेद जैसे अन्य सेल व्यवहार में परिवर्तन को मापने के लिए विस्तारित किया जा सकता है. कोशिकाओं को आसानी से शाही सेना डीएनए के लिए जेल में है, और प्रोटीन निष्कर्षण से सीधे कर सकते हैं अलग किया और बाद में पीसीआर और पश्चिमी के रूप में आणविक जीव विज्ञान, assays के लिए इस्तेमाल कियादाग. यह एक अत्यंत लचीला परख है कि आसानी से स्थापित कर सकते हैं और सेल प्रणाली का एक संख्या में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला के पर बीचवाला प्रवाह के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूलित है.

इस परख की मुख्य कमियां के तथ्य यह है कि प्रवाह वेग मैट्रिक्स एकाग्रता की बहुत निर्भर है. प्रवाह वेग बढ़ जाती है के रूप में Matrigel एकाग्रता कम हो जाती है. इसका मतलब यह है कि कोलेजन का पूरी तरह से शामिल मैट्रिक्स, जो stroma जुड़े कोशिकाओं के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है Matrigel (<0.05 माइक्रोन है -1) के लिए मुख्य रूप से मिलकर की तुलना में उच्च प्रवाह वेग (-1> 1 माइक्रोन है) होगा किसी दिए गए दबाव अंतर है. यदि एक विशिष्ट प्रवाह के वेग की आवश्यकता है, एक पहले मैट्रिक्स संरचना है कि वांछित प्रवाह वेग प्रदान करता है की पहचान के लिए एक प्रारंभिक परीक्षण प्रदर्शन कर सकते हैं. जेल की मोटाई भी प्रवाह के वेग को समायोजित करने के लिए अलग किया जा सकता है. परख भी जीना सेल इमेजिंग, जहां व्यक्ति की कोशिकाओं के व्यवहार के लिए अनुमति नहीं हैअपनी गति और दिशा में घ परिवर्तन मापा जा सकता है. इसके बजाय, इस परख आक्रमण में कोशिकाओं की आबादी में परिवर्तन की एक endpoint माप प्रदान करता है.

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Disclosures: ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials: ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

Name Company Catalog Number Comments
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 Keep sterile
Millicell cell culture insert EMD Millipore PI8P01250 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane
Matrigel BD Biosciences 354234 Keep sterile
PBS Sigma-Aldrich 100M-8202 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps
Sodium Hydroxide, 1.0N Solution Sigma-Aldrich S2770 Keep sterile
DMEM 1X Cellgro 10-013-CV Keep sterile
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals 511150 Keep sterile
Penicillin Streptomycin Cellgro 30002CI Keep sterile
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ml 0.5% in PBS
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500 4% in PBS
Deionized Water Keep sterile
4’,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) MP Biomedicals 0215757401 1mg/ml stock solution
Mounting Solution Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-030-FM
Trypsin-EDTA Cellgro 25-052-CI Keep sterile

References: ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

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