On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria

1. Di coltura cellulare e Preparazione del substrato

1. Tagliare supporti circolari da 3 pollici da una x 100 20 piatto di coltura tissutale mm (BD Falcon) usando un tornio. Sterilizzare substrati mediante immersione in etanolo al 70%. Posto in una capsula di Petri e mantello con 4 ml di collagene di tipo I (100 pg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare con 4 ml 1 x PBS.
2. Sospendere Le cellule endoteliali aortiche (HAEC, passaggio 4-6) a 6.5x10 ⁵ cellule / ml e di sementi mediante l'applicazione di 1 ml direttamente al substrato. Posto a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore e permettere alle cellule di aderire al substrato per 1 h.
3. Aggiungere 9 ml di crescita endoteliale Medio-2 (EGM-2) integrato con 1x antibiotico-antimicotico soluzione alle cellule. Modificare i media ogni 2 giorni fino a quando le cellule raggiungere il 90% di confluenza.
4. Mantenere cellule THP-1 in mezzo RPMI 1640 integrato con 10% FBS e 1x antibiotico-antimicotico soluzione. Cellule Passage quando raggiungono una densità di 10 ⁶ cellule / ml.

2. Cella Shearing protocollo

Le cellule sono condizionati in un costume cono-and-piastra di dispositivo a cella Shearing (CSD). Dettagli del dispositivo e specifiche di progetto sono documentati nella Tabella 1 e Figura 4.

1. Preparare il CSD. Sterilizzare l'alloggiamento camera con etanolo e risciacquare con PBS sterile. Riscaldare l'alloggiamento a 37 ° C e livello per assicurare che il cono è perpendicolare al monostrato cellulare. Assemblare il substrato con le cellule dal fondo del contenitore e impostare il cono all'altezza desiderata.
2. Utilizzare Leibovitz-15 (L-15) mezzo supplementato con BulletKit Endothelial come mezzo di taglio per mantenere il pH corretto in assenza di CO _2. Per stimolare infiammazione, aggiungere fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) al mezzo di taglio e iniettare 6 ml nel dispositivo tramite una siringa collegata ad una porta di ingresso, avendo cura di non introdurre ariabolle nella camera.
3. Cellule di taglio ad un elevato sforzo di taglio grandezza costante (HSS, 15 dyne / cm ²⁾ o una sollecitazione di taglio oscillatoria (OSS, 0 ± 5 dyne / cm ^2, 1 Hz) per 4 ore. La SS desiderato si ottiene ruotando il cono di sopra delle celle, che è controllato con precisione con un micro-motore a passo, come precedentemente descritto ⁶ La parete SS in superficie (τ _w) è approssimata da.:
   
   dove μ è la viscosità del mezzo, ω è la velocità angolare del cono, e α è l'angolo del cono (0,5 °). L'allineamento cono con il substrato viene regolata entro 0,05 ° attraverso il livellamento di precisione e l'altezza gap fissato a 20 ± 10 micron utilizzando un calibro di profondità per ridurre al minimo variazione circonferenziale e radiale in τ _w. Il dispositivo è stato convalidato per garantire caratteristiche di flusso laminare. Rimuovere cells dal dispositivo e preparare l'analisi di adesione dei monociti.

3. Fabbricazione di PDMS Microfluidic Camera

1. Ottenere stampo master per numero di canale desiderato microfluidica e l'altezza del canale a seconda dell'applicazione. Le caratteristiche del disegno specifico utilizzato in questo protocollo sono dettagliati nella Tabella 1. Il metodo per creare questi è già ben documentata in letteratura. ¹ In breve, la rete di canali è progettato utilizzando software CAD (Autodesk Inventor) e stampato a 5000 dpi su una trasparenza. Fotoresist negativo (SU8) viene filata su un wafer di silicio ad uno spessore di 100 um. La trasparenza è sovrapposta ed esposto alla luce UV. Non polimerizzato photoresist viene rimosso per generare la matrice positiva replica.
2. Per rendere la soluzione base di silicone PDMS mix con silicone agente di indurimento a 10:01 in peso in una barca a pesare e mescolare con una pipetta 5 ml sierologico. Fare attenzione a non grattare le paretidel peso della barca per evitare di aggiungere fiocchi di plastica per la soluzione.
3. Posizionare il wafer master in un piatto 100x15mm Petri e versare la soluzione PDMS nel piatto.
4. Coprire il piatto e metterla in un contenitore vuoto per 15 minuti per rimuovere le bolle. Dopo 15 minuti prendere la piastra di Petri e rimuovere le bolle in eccesso delicatamente soffiando aria sulla superficie.
5. Porre la capsula Petri in un forno per 1 ora a 70 ° C. Rimuovere il piatto e tagliare le camere microfluidici utilizzando una lama affilata.

4. Montaggio del dispositivo sul microscopio

1. Accendere sorgente di luce al microscopio invertito e impostare riscaldamento a 37 ° C. Collegare il tubo di una siringa da 10 ml e riempirlo con acqua distillata in modo tale che non ci siano bolle. Posizionare la siringa nella pompa a siringa e portata impostata per indurre una parete di SS 1 dyne / cm ^2. La sollecitazione di taglio parete (τ _w) generata lungo la mezzeria del canale è approssimata utilizzando lo standardequazione per un parallelo-plate camera di flusso:
   
   dove μ è la viscosità del mezzo, Q è la portata volumetrica, h è l'altezza del canale, e w è la larghezza del canale. Nota: poiché i canali sono di larghezza finita effettivo τ _w varia con w seconda del canale rapporto di aspetto, e le misurazioni vengono evitati al 25% più vicino alle pareti laterali. ^1,7
2. Posizionare PDMS camera in acqua e utilizzare una micropipetta 100 microlitri per rimuovere aria dai singoli canali. Collegare l'alimentatore alla camera a vuoto facendo attenzione che la valvola è disattivata.
3. Porre Petri con monostrato HAEC rispetto all'obiettivo. Posizionare la camera di PDMS sulla piastra di Petri e cautela impostato sul monostrato HAEC, assicurando che non si formano bolle d'aria tra il dispositivo e il monostrato. Ruotare la valvola in modo che il vuoto è acceso e la camera è fissato saldamente. Tagliare 19 aghi calibro smorzare tale che ci sia solo 5 mm di sinistra metallo. Riempire il serbatoio di plastica con il tampone e mettere in ingresso PDMS camera. Ripetere per appropriato numero di canali da utilizzare. Collegare il tubo dalle pompe siringa per PDMS uscite canale.

5. Adesione Assay monociti sotto stress Shear

1. Sospensione cellule THP-1 a 2x10 ⁶ cellule / ml in HBSS + Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} + HSA 0,1%. Attivazione cellule THP-1 mediante incubazione con stromale fattore-1 derivato (SDF-1, 50 ug / ml) per 15 min a temperatura ambiente.
2. Accendere pompa a siringa per stabilire un flusso, quindi si aggiungono 50 microlitri di sospensione cellulare al serbatoio senza introdurre bolle d'aria. Quando il flusso è completamente sviluppato, iniziare l'acquisizione dei dati.
3. Eseguire per 5 min a velocità di flusso del caso, aggiungendo tampone al serbatoio se la soluzione diventa bassa. Continuare tampone scorre nei canali per lavare le cellule non legate nella corrente di flusso.

6. Acquisizione dati e analisi

1. Acquisire sequenze di immagini digitali a 3 fotogrammi / s per 2 min a seguito del flusso pienamente sviluppata lungo l'asse longitudinale del canale a 3 posizioni nel canale, facendo attenzione a non registrare immediatamente dopo l'ingresso o prima o porte di uscita 25% in più vicina al lato pareti.
2. Contare il numero di cellule arrestate per campo identificando loro fase aspetto brillante nello stesso piano focale del monostrato.
3. Cell arresto impresa è definita dal movimento <cella diametro ½ in 10 s. Dati di una media di 3 campi aleatori per canale e quantificare utilizzando il software ImageJ.

7. Risultati rappresentativi

Anche se l'endotelio vascolare è uniformemente esposta agli agonisti che contribuiscono a infiammazione sistemica, l'aterosclerosi è una malattia focale che si sviluppa preferenzialmente ai siti di disturbo del flusso nelle arterie, implicando eterogeneità spaziale in funzione endoteliale. ⁸ 9, 10, TNF-α induce una risposta ben caratterizzato in CE che include up-regolazione di molecole di adesione cellulare (CAM : ad esempio, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) e chemochine che reclutano monociti dal circolo, un segno distintivo della lesione aterosclerotica primi ¹¹ emodinamica è un importante regolatore del fenotipo endoteliale infiammatoria ¹² Alta tensione di taglio (HSS. magnitudo.; ad esempio 15 dyne / cm ²⁾ o sollecitazione di taglio pulsatile (PSS, ad esempio 15 ± 5 dyne / cm ²⁾ associati a siti di resistenza a aterosclerosi in arterie down-regolano TNF-α-risposte indotte. Al contrario, lo stress shear a bassa magnitudo (LSS: ad esempio, 2 dyne / cm ²⁾ o di taglio oscillatoria (OSS, ad esempio 0 ± 5 dyne / cm ^2), caratteristiche dei siti sensibili in vivo, esacerbare cytokine-indotta infiammazione. ^{13, 14} I nostri dispositivi microfluidici PDMS fornire una piattaforma per la realizzazione di studi meccanicistici per verificare ipotesi relative alla sovrapposizione di stress metabolico con i fattori idrodinamici nella regolazione della funzione endoteliale e la patologia. L'utilità e la versatilità del metodo è ampiamente illustrata attraverso i seguenti risultati rappresentativi.

Figura 1. Shear stress modula differenziale THP-1 di adesione delle cellule al TNF-alfa monostrati infiammate endoteliali. Questi dati sono stati acquisiti utilizzando il protocollo dettagliato descritto in precedenza e documentato nel video. Monostrati HAEC sono stati esposti contemporaneamente a una bassa dose di citochina infiammatoria TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC ₅₀ per VCAM-1 up-regulation) e sia HSS (15 dyne / cm ²⁾ o OSS (0 ± 5 dynes / cm ^2, 1 Hz) in un CSD personalizzato per 4 ore come descriletto nel protocollo dettagliato. THP-1 arresto cellulare è stata quantificata sotto flusso di taglio in una camera di flusso PDMS. Questa linea cellulare che imita il fenotipo di monociti umani è stato scelto per la sua riproducibilità e facilità d'uso. HSS attenuato la risposta infiammatoria rispetto agli OSS, con conseguente diminuzione THP-1 arresto cellulare. I dati sono stati analizzati mediante Student t-test e sono rappresentati come media ± SEM di 3 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di DeVerse et al. ⁵

I dati che seguono dimostrano la versatilità del nostro approccio con esempi dal nostro lavoro pubblicato. Partenze dal protocollo di cui sopra sono indicati, se del caso.

Figura 2. Modulazione di citochine indotta VCAM-1 e reclutamento dei monociti in un gradiente di sollecitazione di taglio. A) HAEC monostrati sono state stimolate con TNF-α (0,3 ng / ml) per 4 ore sotto flow in uno VMMC progettato sulla base Hele-Shaw teoria del flusso. ¹⁵ A decremento lineare in grandezza SS lungo l'asse del canale è stato ottenuto progettando le pareti laterali della camera di coincidere con la ottimizza di un flusso due stagnazione dimensionali e di forma alla fine del canale per abbinare i iso-potenziali linee. La sollecitazione di taglio parete (τ _w) generata lungo la mezzeria di questo canale ad una distanza assiale dall'ingresso (x) è dato da:

dove μ è la viscosità del mezzo, Q è la portata volumetrica, h è l'altezza del canale, w ₁ è la larghezza del canale di ingresso, ed L è la lunghezza totale del canale. Q è stato scelto per generare un gradiente di grandezza da 16 SS dyne / cm ² a monte che a 0 al punto di stagnazione "a" appena prossimale al outlet. B)-C), VCAM-1 espressione è stata misurata in situ tramite microscopia immunofluorescenza usando anticorpi coniugati punti quantici e presentati come percentuale di intensità di fluorescenza media (MFI) di controllo non stimolato statico. SS non modulare il livello basale di VCAM-1, che è basso in HAEC non stimolate (triangoli grigi). Tuttavia, espressione di VCAM-1 è aumentato rispetto al TNF-α a grandezze LSS, con un picco a ~ 2 dyne / cm ² e tornare al TNF-α basale o inferiore a grandezze di taglio di 5 dyne / cm ² (quadrati neri). D) monociti (10 ⁶ / ml) sono stati perfusi a 2 dyne / cm ² per 5 min in canali di flusso paralleli su monostrati precondizionati come in A). Reclutamento dei monociti all'endotelio quantitativamente correlato con l'espressione di VCAM-1 in un ampiezza di taglio dato stress. In particolare, la capacità di sondare espressione di VCAM-1 e il reclutamento dei monociti con fine risoluzione spaziale in un monolayer rivelato cambiamenti significativi su un range limitato in grandezza SS che non dovrebbe essere apprezzato dagli applicando valori discreti poche di taglio in esperimenti separati. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA misure ripetute e valutate differenze di Newman-Keuls posttest, * P <0,05 da TNF-α in condizioni statiche. I dati sono media ± SEM di 3-6 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di Tsou et al. ²

Figura 3. Lipoproteine ​​ricche di trigliceridi (TGRL) modulare citochine indotta infiammazione in proporzione a livelli di trigliceridi di siero e VCAM-1 espressione. HAEC monostrati sono state stimolate con TNF-α (0,3 ng / ml) per 4 ore simultaneamente con TGRL (10 mg / dl ApoB) isolato da soggetti umani dopo un pasto ricco di grassi nella cultura statica. A) espressione di VCAM-1 è stato misurato separatamente in sospeso CE mediante citometria a flussoe adesione monociti quantificato utilizzando un VMMC come descritto nel protocollo dettagliato. I dati sono presentati come variazione% di TNF-α. Arresto Monocyte varia in proporzione diretta alla endoteliale espressione di VCAM-1, che ha aumentato direttamente con il livello di trigliceridi di siero. B) Monocyte arresto per un sottoinsieme di pro-infiammatorie donatori è abrogata in presenza di un anticorpo VCAM-1 blocco. La significatività è stata determinata la Student t-test accoppiato, significa ± SEM di 3-5 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di Wang et al. ⁴

Si descrivono l'uso di dispositivi microfluidici PDMS per la valutazione on-chip di endoteliale fenotipo infiammatoria attraverso l'imaging in tempo reale di espressione CAM e adesione monociti. Uno dei principali vantaggi del nostro approccio risiede nella capacità di quantificare i risultati associati a disfunzione endoteliale in cellule esposte a mediatori infiammatori come i lipidi alimentari e citochine in condizioni idrodinamiche definiti che rispecchiano shear stress nei vasi aterogene. Il VMMC facilitare l'uso di piccole quantità di reagenti o materiali che possono essere disponibili in quantità limitata e hanno il vantaggio aggiunto di essere poco costoso, personalizzabile e suscettibili di un throughput elevato.

L'uso di dispositivi microfluidici rappresenta un'alternativa approcci macroscala che sono stati utilizzati per decenni per indagare la risposta di coltura CE di taglio. Questi includono piatti paralleli camere di flusso, tubi cilindrici, e cono-e-piastra viscosimetri, ciascuno dei quali è cado di imporre costanti, condizioni di flusso laminare Poiseuille (recensione in ^16). Le modifiche a questi dispositivi in grado di produrre variazioni temporali e spaziali a sollecitazioni di taglio a parete o anche ricapitolare forme d'onda arteriosa. ⁶ Tuttavia, in generale questi dispositivi richiedono una grande quantità di media, sono costose da fabbricare, meno adattabili, e soffrono di velocità relativamente bassa.

Limitazioni Esistono anche con l'uso dei VMMCs. Questi dispositivi sono progettati sulla base di piatti paralleli teoria del flusso, che assume larghezza infinita. Questa è una ipotesi ragionevole per dispositivi macroscala cui larghezza è molto superiore all'altezza. Tuttavia, la larghezza finita dei canali microfluidici richiede che gli studi essere condotto lungo il centro dell'asse longitudinale del canale di eliminare gli effetti delle pareti laterali, come l'effettivo τ _w varia con w seconda del rapporto di aspetto canale. ^{1, 7} Analogamente , le misure non sono prese t vicinoO l'ingresso e l'uscita dei canali per evitare effetti di ingresso. Abbiamo escluso eventuali significativi effetti paracrini di segnalazione o infiammazione indotta da lesioni o danni causati da CE sigillando il dispositivo per il monostrato come un contributo alle nostre risposte osservate. PDMS ha un'alta affinità per le molecole idrofobe, che potrebbe portare l'assorbimento di chemochine secrete e non-specifiche interazioni tra leucociti e la VMMC. Tuttavia, non abbiamo trovato che questo è un problema per tutta la durata dei nostri studi. ²

L'uso di dispositivi di flusso con cellule in coltura costituisce un approccio riduzionista che facilita gli studi meccanicistici e la dimostrazione di causa ed effetto con riferimento alle sollecitazioni di taglio. Tuttavia, una limitazione di qualsiasi approccio in vitro è il presupposto che sarà adeguatamente ricapitolano la complessità dell'ambiente in arterie native. In vivo, le cellule endoteliali sono cronicamente adeguamento a schemi di flusso complessi esono soggetti a interazioni con altre cellule, matrice e mediatori umorali che regolano il loro comportamento.

È interessante notare che tutti i risultati presentati sopra sono in modelli a breve termine e come tale non può essere tempo invariante. Tuttavia, essi sono rappresentativi di esperimenti che noi comunemente eseguite per indagare sotto un meccanismo di sfida infiammatoria acuta. Una strategia adeguata per i nostri studi è quello di monitorare i cambiamenti da una base infiammatoria di bassi dosaggi di TNF-α stimolo, per i quali 4 ore rappresenta il picco approssimativo in espressione di VCAM-1. Abbiamo documentato in diversi studi che cambiamenti nell'espressione superficie di VCAM-1 correlano con una maggiore assunzione dei monociti in queste condizioni. ^{2-4, 17}

Inoltre, la scelta di SS forma d'onda può evocare differenziali risposte endoteliali. Nel nostro protocollo rappresentante si documentare l'uso del VMMC per quantificare eventi di adesione monociti in HAEC condizionati sotto sascoltare sollecitazioni scelti per essere rappresentativi dei siti di relativa resistenza (HSS) e sensibilità (OSS) per l'aterogenesi nelle arterie in un dispositivo di taglio su misura cell. Coerentemente con i risultati precedenti colta CE, HSS attenuato la risposta all'attivazione delle citochine. OSS rispetto al ^{12, 13} I risultati sono coerenti con una permissività maggiore attivazione infiammatoria della CE nei siti di disturbo del flusso in vivo. Mentre queste condizioni sono comunemente utilizzati per rappresentare flusso indisturbato e disturbato rispettivamente, non completamente ricapitolano la complessità del flusso in arterie. Tuttavia, una ricchezza della letteratura sostiene il loro uso come approssimazioni semplici che riproducono in modo adeguato le caratteristiche salienti di flusso ^14.

In particolare, il cono e la piastra-base CSD è in grado di generare forme d'onda più complessa e cellule condizionamento per periodi più lunghi come precedentemente segnalati. ⁶ Così, l'accoppiamento con la VMMC CSD nella descritto protocol conferisce un massimo grado di flessibilità. Una considerazione di questo approccio consiste nel l'orientamento della VMMC rispetto alla direzione di condizionamento di taglio nella CSD, in cui il flusso HAEC esperienza nella direzione circonferenziale. In pratica, il VMMC è orientata in modo che i canali siano paralleli al campo di flusso a monte e l'ingresso di cellule condizionati per quanto possibile. I canali sono abbastanza piccoli che ciò rappresenti una ragionevole approssimazione. Tuttavia, abbiamo anche dimostrato in un precedente studio monociti che scorrono parallele o perpendicolari alla direzione di condizionamento di taglio nella VMMC non ha influenzato i risultati mostrati in Figura 2. ²

Ulteriori considerazioni associati con le tecniche in vitro includono la variabilità indotta dalla deriva fenotipica associata passaging di serie del CE nella cultura e nella eterogeneità isolata CE o monociti. HAEC deve in genere essere utilizzato dal passaggio 6 e ciascun lottocaratterizzato per una risposta infiammatoria consistente di TNF-α. L'uso di una linea cellulare come THP-1 può ridurre la variabilità associato con l'uso di monociti, che variano in attività da donatore e sono facilmente attivabile con il loro isolamento. Al fine di garantire letture funzionali riproducibili e preciso, la preparazione delle cellule e dei tempi di trasferimento dovrebbe essere minimizzato. L'attenta selezione dei controlli è necessario interpretare significativamente i risultati. Secondo l'esperimento, questi possono includere cellule non trattate o statica-coltivate, TNF-α trattamento, disattivo cellule THP-1, l'uso di anticorpi che bloccano e siRNA o inibitori farmacologiche, e altri.

Come testimonia la versatilità del metodo, abbiamo applicato questi dispositivi per indagare citochine, ^{2 lipidi-3, 4} e ⁵ RAGE-indotta infiammazione HAEC. I nostri studi hanno incluso la valutazione del potenziale infiammatorio di siero-derivati ​​da particelle lipidiche s umanaubjects sulle cellule endoteliali ^{3, 4 e} monociti. ¹⁷ In una strategia alternativa, monociti possono essere presentate con substrati derivatizzati con molecole immobilizzate come VCAM-1 per esaminare meccanismi di adesione. Usando questo approccio, abbiamo precedentemente dimostrato un ruolo funzionale per la molecola di adesione CD11c, che collabora con l'antigene molto tardi (VLA) -4 in adesione dei monociti a VCAM-1 durante la dislipidemia ¹⁷ negli esseri umani e nei topi. Dal ¹⁸ monociti può essere facilmente attivata il loro isolamento, abbiamo anche sviluppato un saggio di sangue intero per l'uso con il nostro laboratorio-chip dispositivo per consentire il rilevamento più sensibile e riproducibile. ¹⁷

In definitiva, oltre a fornire informazioni sugli eventi infiammatori alla base dell'aterosclerosi precoce, prevediamo che questo sviluppo della tecnologia porterà ad approcci fedeli ex vivo per valutare il rischio individuale di infiammazione mediata da malattie cardiovascolari, aprendo la way per lo sviluppo della diagnostica personalizzati che riportano in monociti e CE.

Tabella 1. Specifiche CSD e VMMC.

Figura 4. Vista in sezione trasversale del cono e piastra dispositivo a cella tranciatura (CSD). La CSD è costituito da un cono di acciaio inossidabile cilindrico che ruota sopra un substrato stazionaria coltura cellulare. L'angolo del cono e l'altezza gap sono parametri critici che definiscono la natura del campo di taglio prodotta in presenza di terreno di coltura. Un numero di Reynolds modificato mostra la relazione della centrifuga a forze viscose è dato da:

<br />

dove r è il raggio cono, ω è la velocità angolare, α è l'angolo del cono, e ν è la velocità cinematica del fluido. Quando R è << 1 forze centrifughe sono bassi, il flusso laminare e è puramente azimutale, e la sollecitazione di taglio indotta è costante per l'monostrato. ¹⁹ Nel nostro CSD, il substrato con cellule coltivate viene caricato dal basso nella camera che ospita la cono. Media viene aggiunto alla camera e come fluido di taglio. Il cono viene montato con cuscinetti precaricati precisione e la rotazione azionato da un micro-motore a passo. Un sistema di livellamento di precisione mantiene un allineamento perpendicolare al substrato cellulare. L'altezza gap (definita dalla distanza tra l'apice del cono al substrato cella) è impostato con una elevata precisione profondimetro. Un grasso di cattura e media tenuta sono in atto per garantire che la camera di alloggiamento delle celle è tenuto pulito e privo di olio e detriti.