一种改进的EPA方法1623使用切向流中空纤维超滤和热解离步骤检测水性

Eric R. Rhodes¹, Leah Fohl Villegas², Nancy J. Shaw², Carrie Miller³, Eric N. Villegas¹

¹National Exposure Research Laboratory, Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency, ²Shaw Environmental & Infrastructure, ³Office of Ground Water and Drinking Water, US Environmental Protection Agency

Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).

隐孢子虫和贾第鞭毛虫种原虫，造成水源性腹泻病爆发的全球最流行 ​​的两个。为了更好地描述这些病原体的流行，开发和利用到美国饮用水中这些生物监测水平EPA方法1623提供^12。该方法有三个主要部分，首先是样品浓度，其中至少10 L是原始地表水过滤。生物体和被困的碎片，然后洗脱从过滤器和离心样品，以进一步集中。该方法的第二部分使用浓缩水样专门绑定到允许特定拆除集中碎片寄生虫的隐孢子虫和贾第虫包囊的免疫磁珠免疫分离过程。这些囊肿（OO），然后脱离磁珠酸解多项式dure。该方法的最后一部分是囊肿（OO）应用于幻灯片，染色，并通过显微镜列举的免疫荧光染色和枚举。

方法1623有四家上市样品浓度系统捕捉水中隐孢子虫和贾第虫囊肿：过滤器（Envirochek Pall公司，安阿伯，MI），Envirochek高压过滤器（Pall公司），Filta最大的过滤器（爱德士，韦斯特布鲁克，马萨诸塞州），或连续流离心（Haemonetics，布伦特里，马萨诸塞州）。然而， 隐孢子虫和贾第 （OO）囊肿回收率差别很大，取决于水源矩阵和过滤器使用^1,14。一种新的切向流中空纤维超滤（HFUF）系统最近被证明是更有效和更强大的恢复隐孢子虫 和贾第虫包囊从各种水矩阵;此外，它是小于其他囊式过滤器“选项可以集中精力和多种病原体同时^{1-3,5-8,10,11。}此外，以往的研究表明山和他的同事的HFUF显着提高回收率隐孢子虫卵囊，直接与Envirochek高压过滤器⁴相比。也有报道补充修改目前的方法，以提高方法的性能。更换酸解过程与热分解被证明是更有效地从一些矩阵^9,13磁珠分离隐 。

这个协议描述修改的方法1623使用热分解步骤的新HFUF过滤系统。使用这种方法的改进与HFUF是一个不太昂贵的替代当前的EPA方法1623过滤选项，允许多种生物的浓度，并提供更多的灵活性。

1。中空纤维切向流超滤程序

1. 缓冲区和解决方案的筹备工作：

   洗脱液（1升）：
   至1 L试剂级水增加0.1 G钠聚，0.1毫升吐温80和0.01毫升Y型30消泡剂。

2. 准备在生物安全柜滤清器总成（ 图1）：
   1. 通过1的Masterflex易于负载泵连接的I / P 1的Masterflex精密无刷驱动器的I / P头插入的Masterflex的I / P 73实验室管。
   2. 1 0-60磅，填充甘油压力表1“不扩散核武器条约”的分支T-连接上游的泵用螺丝钳头安装固定油管，1 HDPE T-连接泵头下游。
   3. 组装装修NALGENE 53-B的灌装/排气的Masterflex的L / S 15实验室管帽和T-连接，并确保其1升NALGENE重税聚丙烯瓶截留瓶。
   4. 适合的Masterflex的L / S 24油管瓦特第i个一掐钳（掐钳2）和连接从截留瓶HDPE T-连接。
   5. 用螺丝钳的Masterflex的L / S 24实验室管连接压力表旭化成Rexeed 25S高通量透析器，透析截留瓶。使用定制DIN适配器设计，以适应¼“身份证油管连接管的中空纤维超滤。
   6. 掐钳（掐钳1）适合的Masterflex的L / S 24实验室油管和连接10毫升的塑料吸管尖端拆下来作为样本的吸收线和棉塞，然后附加油管的高密度聚乙烯ţ连接器。
   7. 适合的Masterflex L/S-36实验室管的一端与坡道钳和油管连接污水过滤器的出口端附近的港口。放置在废物容器的另一端。
3. 添加0.01％（W / V）聚磷酸钠10 L的水样和混合3分钟。
4. 关闭掐钳2删除排气帽从截留瓶的。所有其他的夹具应是开放的。
5. 设置泵的方向移动从T型连接器的流体压力表（从右到左下面的图1）。调节泵的速度，最高车速的25％，并打开泵。
6. 当截留瓶是2/3满，开放掐钳2，快速更换排气帽截留瓶。检查所有的线路和配件，以确保没有泄漏。
7. 慢慢增加泵的转速所需的滤过率（约1.5升/分钟），检查是否有泄漏。使用量筒和一个计时器或流量计，检查滤液水从污水线（蓝色的L / S 36油管图1）退出率。通常可以使其难以实现稳定的压力和滤过率的过滤器的出口端形成气泡。这是纠正用手按捏了一会儿出水线。这个动作将一般哄气泡，滤液端口和退出通过出水线。根据需要重复，牢记豌豆大小的气泡往往是不可避免的。
8. 监测过滤过程。测量和记录需要的压力和滤过率。压力不应超过20磅。据建议，滤过率应不超过2.0升/分钟。重要的是，这水截留瓶的量进行监测，以确保它永远不会清空。它的体积增加或略有下降是正常的。如果截留瓶的水量降到低于1/3满，然后取出通风帽和密切掐钳2上截留瓶线。带来的体积约2/3满，打开夹子和快速更换排气帽，确保密封。如果在截留瓶量迅速下降，并连续，然后确保截留瓶盖很紧，排气帽安全到位，并在tubi吴仍是在接触水样。如果这些问题都没有发生，那么它很可能截留瓶盖密封不好，应及时更换。
9. 当样品容器是空的，立即关闭掐钳1，降低泵的转速，其最大的20％，除去从截留瓶通风口帽和关闭坡道钳。
10. 斜坡钳拧紧或松动，调整样品截留瓶的体积约200毫升。体积约200毫升后，拧紧洗脱步骤（1.11-1.12）的斜坡钳。
11. 洗脱溶液中加入500毫升的样品容器和冲洗容器内。将10毫升吸管连接成洗脱溶液的容器，它包含了样品的吸收线。确保斜坡钳，被关闭。打开掐钳1，密切掐钳随时吸取洗脱液。
12. 洗脱溶液500毫升后制定，接近掐钳1和开放掐钳2。让洗脱液流通的20％，其最大的泵的转速为5分钟。
13. 出水行坡道钳拧紧或松动，调整样品截留瓶的体积约100毫升。拧紧的坡道钳和允许的样品分发1分钟。避免拉进油管空气，确保在截留瓶的样本量是不够高，覆盖的L / S 15油管进入回流瓶。
14. 扭转这迫使的截留瓶的样品泵的方向。为20秒，共截留瓶〜225毫升，使泵反向运行。关闭泵。
15. 从泵头的Masterflex的I / P 73油管和断开压力表。断开的L / S“的Masterflex 24油管退出中空纤维超滤。按住管截留瓶以上，强行进入任何剩余的样品截留瓶。
16. 断开所有油管从瓶子和更换非排气帽的通风帽。
17. 继续〜225毫升截留的IMS / IFA过程。

2。免疫分离程序

1. 缓冲区和解决方案的筹备工作：
   1. 允许在磁珠包括： 隐/贾第组合套件的缓冲区，以达到室温。
   2. 1X SL - 缓冲液A：加入1毫升的10倍SL缓冲到9毫升试剂级水。
2. 从截留的瓶子转移打成250毫升锥形离心管中的液体〜225毫升。 10毫升试剂水冲洗截留瓶两次，并添加冲洗锥形离心管。在1500 XG离心15分钟，在4°没有刹车ç暂停。
3. 小心吸取上清液从空气 - 水界面5毫升以上的包装颗粒，每个颗粒体积为0.5毫升（即吸15毫升以上颗粒体积为1.3毫升，5毫升0.5毫升或更少）颗粒吸。
4. 彻底悬浮颗粒涡旋和/或吸管搅拌成上清。每个5毫升体积的液体转移到平板双面DYNAL L10管含有1毫升每10X缓冲的SL-A和10X SL - 缓冲乙冲洗锥形离心管，2.5毫升试剂水的两倍，并添加冲洗的L10管，带来的L10管12毫升的总量，包括缓冲区。
5. 加入100μL以及混合再悬浮反隐和反贾第磁珠的L10管。上肩混频器在室温下为1小时18转旋转的L10管。
6. 将反对的MPC-6磁铁，轻轻地用手岩管端至年底，180°2分钟的L10管侧扁。
7. 保持在MPC的6磁铁与磁铁侧的L10管起来，慢慢倒出上清离珠/（OO）囊肿络合物BOU第二到磁铁。从磁铁的L10管，并加入0.5毫升的管1X SL缓冲。转让暂停使用两个额外漂洗0.5毫升的1X SL - 缓冲举行的磁铁在垂直位置在MPC-S的1.5 ml离心管一个。
8. 轻轻摇动1分钟，在MPC-S的磁铁180°管。与地方磁铁，吸出上清液，用巴斯德吸管向离心管的底部。
9. 加入1毫升的1X PBS的离心管的前端，取出磁铁和管轻轻晃动，只是直到珠悬浮。更换磁铁在垂直位置，并轻轻摇动1分钟，180°管。吸的PBS漂洗，不扰民的珠球，用巴斯德吸管去除尽可能多的碎片。
10. 取下磁铁，并添加50μL试剂水的离心管的背面。旋涡管在50秒的全速，然后在80℃孵育10分钟30秒涡管。更换成MPC-S的磁铁，在倾斜的位置，结合珠磁铁和留在液体（OO）囊肿。 （OO）囊肿暂停申请到SingleSpot以及幻灯片。
11. 重复步骤2.10，采用液体含首次分离同井。在37°C间1小时回暖幻灯片干燥暂停幻灯片以及地方幻灯片。

3。染色和考试

1. 缓冲区和解决方案的筹备工作：
   工作的DAPI溶液加入25μL的DAPI储备液（甲醇2毫克/毫升）25毫升的1X PBS。商店库存和1°C和10°C在黑暗之间的工作方案。
2. 适用于50μL甲醇以及幻灯片，并允许它在室温下晾干。
3. 加入50μL工作的DAPI解决方案以及幻灯片和2分钟，在室温下孵育。
4. 使用1 KimwiPE灯芯从井的DAPI。应用50μLEasyStain。在35°C孵育30分钟。
5. 威克与Kimwipe的染色好，然后慢慢加入微升300的冷EasyStain固定缓冲区，允许它流过了井沿。在室温下孵育2分钟。
6. 使用Kimwipe灯芯从井的缓冲区和应用10μL的EasyStain安装介质。
7. 仔细申请盖玻片，消除发生任何气泡。封盖玻片透明指甲油。
8. 200X的总放大倍率为卵形或球形类似于卵囊或囊肿的苹果绿色荧光的对象，用FITC标记的过滤器，扫描整个幻灯片。 1000X总放大倍率的DAPI过滤，然后与DIC的所有检查对象，也总放大倍数1000X。使用校准眼微米和形态特征记录的大小。
9. 文档结果。

注：附加Infor公司mation有关的原程序，可以发现在2005年12月版本EPA方法1623 ^12。中空纤维切向流超滤过程描述用于EPA方法1623 12.0节的地方。热分解修改EPA方法1623 13.3.3节。这个过程还介绍了在IMS的过程可分为2005年12月法1623版本13.3.2.16节之后插入一个额外的PBS冲洗。 EPA方法1623包括这些修改所使用的耗材，试剂和设备的完整列表中列出的设备清单。

4。代表结果

通过过滤和免疫分离的过程中回收的隐孢子虫和贾第虫囊肿是由微观分析检测。 200X的总放大倍率，每个生物体表现出一个典型的染色图案，大小和形状如图2所示隐是一个球形物体的卵形直径在4至6微米，具有突出明亮的边缘（ 图3A辉煌的苹果绿色的FITC荧光）。用DAPI紫外线，卵囊将呈现以下典型特征类别之一：淡蓝色与绿色的边缘，并没有明显的原子核（负的DAPI），强烈的蓝色内部染色，或多达四个不同的，天蓝色的细胞核（DAPI染色内部正面- 图3B）。非典型特征，包括颜色，结构，或DAPI荧光（例如，太多的染色细胞核，红色荧光的内部结构）中的偏差。如果荧光对象已符合标准，为典型的FITC和DAPI染色，它是利用微分干涉CON对比度（DIC）。非典型内部或外部形态特征，如细胞壁的纹饰，或一个或两个填充细胞的细胞核大检查的对象。如果不遵守非典型结构，对象被记录在总IFA计数和一个空的无定形结构，或用一到四个孢子出席（ 图3C）分类。同样， 贾第虫状物体研究方面FITC和DAPI染色以及DIC的特征，如axonemes，中位数机构和原子核， 贾第虫囊肿是圆卵形辉煌的苹果绿色的物体，8 - 18微米长5 -宽15微米，突出明亮的边缘（ 图3D）。用DAPI紫外线， 贾第虫囊肿将展出的DAPI染色阴性，或的DAPI阳性的特点（ 图3E）。荧光检查对象为DIC的典型和非典型的功能以同样的方式为隐 。如果不遵守非典型特征，对象被记录在总IFA计数及分类为空含无定形结构，或与一个或多个类型的内部结构（ 图3F）。

任何被观察到的非典型特征的生物体不应该算作一个囊肿（OO）。环境样品的微观分析，可以挑战有生物体，可能会自动发出荧光或交叉反应与FITC标记的反隐和/或抗贾第虫抗体^1。据分析师建议熟悉水生微生物和幻灯片的审查数十获得经验识别隐孢子虫和贾第 （OO）至少有三个阳性控制幻灯片上的囊肿，应会议在显微镜前每一个特点。

（OO）的囊肿可能会飙升与质量控制样品，确定％REC安理为每个使用的计算原生动物：
（OO）囊肿回收率=（（QC样品计数-无稀释剂法样品的计数）/穗）×100。

图1。切向流中空纤维超滤系统的图形表示。油管的颜色编码，以帮助系统组装。

图2。代表荧光图像的隐孢子虫和贾第 （OO）的囊肿。 隐孢子虫和贾第虫包囊染色与FITC标记的反隐 / 贾第虫抗体。箭， 贾第虫包囊;箭头， 隐孢子虫 。共有四个隐孢子虫和六鞭毛虫孢囊被发现在焦平面。样品observ1146 200X倍率。

图3代表显微图像隐孢子虫隐孢子虫和表征Giaridia囊肿（A类- C）。辉煌的苹果绿色的FITC荧光突出明亮的边缘（一）含有高达四季分明，天蓝色的DAPI核（B）和一至四个孢子（）（三）每卵囊直径在4至6微米球状物体。 贾第虫包囊（四-六）。辉煌的苹果绿色的FITC荧光圆卵形对象8 - 18微米长5 - 15微米，宽强调明亮的边缘（四）含有多达四个天蓝色的DAPI核（五）与一个或多个可辨别的内部结构等作为细胞核（N）中位数的身体（M）和或axonemes（一）（女）。白色箭头，辉煌的苹果绿色荧光染色隐孢子虫和贾第虫包囊瓦特承滴盘，白色箭头的DAPI阳性细胞核。样本观察下1000X倍率。

切向流中空纤维超滤是替代水隐孢子虫和贾第虫包囊的初始浓度和有效的技术。比传统的过滤器，中空纤维超滤是昂贵。因为它有能力从各种不同的水矩阵集中的隐孢子虫和贾第虫囊肿，它是一个有用的替代目前的过滤技术用于EPA方法1623。与大多数其他过滤方法，中空纤维超滤是容易产生污垢极其浑浊样品。高水压会导致过滤器的污垢;因此建议监控过滤运行过程中的压力。此外隐孢子虫和贾第虫囊肿，中空纤维超滤已被证明是能够集中细菌和病毒^1-3,5,8。中空纤维超滤Ø这种方法utlined的可用于集中在单个样品的多种生物。值得注意的是，获得200至250毫升的最后一卷，是在集中过程中的关键的最后一步，使额外的离心步骤，可能导致（OO）囊肿损失，避免（步骤2.2）。然而，允许在瓶子的体积降得过低，可回收率有不利影响，因为不会有足够的液体体积，截留瓶迫使所有的卵囊或囊肿。因此，建议保持200至250毫升的最终体积。

热分解是酸解方法1623步的替代方法。已被证明这种替代的步骤，以提高隐孢子虫的卵囊恢复和减少变化时，无论从河流或试剂水⁹隔离的方法。端侧的酸和热分解方法比较表明，用热，以解离TE从免疫磁珠生物体产生较高的平均回收率为隐孢子虫和贾第 。此外， 隐孢子虫和贾第回收率精度优于热分解处理的样品酸解^9。

浓缩步骤的HFUF纳入允许集中多种生物的能力提供更多的灵活性。此外，它是一个较为便宜的替代目前的方法1623过滤选项。

美国环境保护署资助这里描述的研究，通过其与地表水和饮用水的技术支持中心办公室合作研究和开发办公室。所有工作的支持，美国俄亥俄州辛辛那提，在美国环保局的网站上。虽然在这篇文章中所描述的信息已根据合同，美国环境保护局（EP-06-031合同）肖环境和基础设施，公司的全部或部分资助，它并不一定反映的意见应推断机构并没有正式认可。它一直受到机构的审查和批准出版。

我们要感谢他的技术支持，严格审查本手稿和Doug汉密尔顿安格林和迈克尔·齐默尔曼。

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