एक स्वचालित उच्च सामग्री zebrafish में सूजन परख को सुगम ड्रग डिस्कवरी

Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).

1. पशु हैंडलिंग

चिन परख का उपयोग 3 DPF लार्वा के लिए है homozygous डबल ट्रांसजेनिक :: cldnB GFP / lysC :: DsRED2 और अटल बिहारी मछली (जंगली प्रकार) के बीच समूह matings से उत्पन्न होने वाली है. प्राकृतिक spawning के द्वारा भ्रूण लीजिए और उन्हें 29 में बढ़ा ° E3 के मध्यम में पेट्री डिश में सी (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी ₂ CaCl, 0.33 मिमी ₄ MgSO, और 0.1% नीले methylene, equilibrated 7.0 पीएच). यह प्लेट प्रति 50-70 से अधिक भ्रूण के घनत्व को बनाए रखने के लिए आवश्यक है.

2. लार्वा छंटनी

फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति, सहज सूजन और उचित उम्र से संबंधित विकास के लिए एक प्रतिदीप्ति त्रिविमदर्शी के तहत सभी लार्वा की जाँच करें.

3. स्क्रीनिंग मध्यम तैयार (हमेशा ताजा तैयार)

DMSO के अंतिम (1%) और MS222 (0.05 छ / एल) के साथ पूरक methylene नीले रंग के बिना E3 के माध्यम से तैयार करें.

4. CuSO4तैयारी (हमेशा ताजा तैयार)

पहले CuSO ₄ वजन (एम _आर = 159.6 छ / mol) और DH में एक 20 मिमी स्टॉक समाधान तैयार ₂ ओ. 120 माइक्रोन CuSO ₄ (1%) E3/DMSO / MS-222 में काम कर समाधान (20 मिमी शेयर समाधान से) तैयार है. प्रकाश से CuSO ₄ समाधान को सुरक्षित रखें.

5. 384 अच्छी तरह से प्लेट तैयार (Greiner 384 Microplate खैर)

एक रिवर्स विंदुक के साथ एक अच्छी तरह से (1%) E3/DMSO / MS-222 के 20 μl पूर्व जोड़ने. एक बढ़ा विंदुक टिप बोर भ्रूण किसी भी लोग घायल हो गए inflicting के बिना ध्यान से संभाल करने के लिए आवश्यक है, यह एक 2 बोर मिमी टिप काटने के द्वारा किया जाता है. प्रत्येक अच्छी तरह से (अनुपचारित नियंत्रण के लिए 84 μl) स्थानांतरण करने के लिए माध्यम के 74 μl में एक लार्वा. यदि आवश्यक हो, पूरबी लार्वा एक पार्श्व स्थिति में अच्छी तरह के भीतर एक लचीला Eppendorf Microloader पिपेट टिप (956.003 5242 Eppendorf) का उपयोग कर.

एक रोबोट तरल के साथ आचरण सभी निम्नलिखित तरल से निपटने कदमवर्कस्टेशन से निपटने के लिए सभी लार्वा के साथ - साथ उपचार सुनिश्चित.

6. औषध उपचार

Pipetting और नीचे से दवा स्टॉक थाली में 5 बार यौगिकों का मिश्रण. एक अच्छी तरह लिए 7.5X दवा स्टॉक थाली की 16 μl जोड़ें और मिश्रण 5 बार. कुओं के भीतर टिप स्थिति लार्वा की चोट को रोकने के लिए और 10 μl है / पर मध्यम बांटना समायोजित करें. कुओं में 4 बार मध्यम मिश्रण अच्छी तरह के भीतर दवा के समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए.

7. ऊष्मायन

स्क्रीनिंग थाली सेते हैं 1 ज के लिए 29 डिग्री सेल्सियस एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर यौगिकों प्रकाश से के रूप में ₄ CuSO के रूप में अच्छी तरह से रक्षा कर रहे हैं.

8. रासायनिक लोग घायल हो गए

प्रत्येक अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण, 4 बार मिश्रण को छोड़कर 120 माइक्रोन CuSO, ₄ कार्य समाधान के 10 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए फिर से 29 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस

9. धुलाई

निकालें और मेरे 80 μl का आदान - प्रदान दो बार अच्छी तरह से प्रत्येक से dium 20 μl चरणों में यौगिकों को दूर करने के लिए और ₄ CuSO.

10. छवि अधिग्रहण

90 मिनट के बाद प्रारंभिक तांबा उपचार: एक औंधा स्वचालित खुर्दबीन (ओलिंप स्कैन ^ आर यानी) पर छवि अधिग्रहण शुरू करो. प्रारंभिक z-स्तर सेट इतना है कि सही है और छोड़ दिया पीछे पार्श्व रेखा से neuromasts दिखाई दे रहे हैं. छवि एक बार अच्छी तरह से प्रत्येक चैनलों brightfield में प्रति घंटे, Cy3 और 4 केन्द्र विमानों (50 माइक्रोन दूरी) में GFP एक 4x उद्देश्य है (एनए = 0.13) का उपयोग कर.

छवि और डाटा प्रोसेसिंग पर अतिरिक्त जानकारी के अनुरोध पर उपलब्ध हैं.

11. इमेज प्रोसेसिंग

1. छँटाई डेटा

कच्चे छवियों हमारे कस्टम Labview सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट के साथ कार्रवाई कर रहे हैं. छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन में पहला ऑपरेशन कच्चे छवियों की खुर्दबीन उत्पन्न चैनल अच्छी तरह से, और समय - बिंदु जानकारी से डेटा फ़ोल्डर से छँटाई है.

इसके बाद सॉफ्टवेयर चैनलों में से प्रत्येक के लिए 4 केन्द्र विमानों से बढ़ा ध्यान केंद्रित छवियों पैदा करता है.

3. आरजीबी - उपरिशायी

अंतिम चरण में 3 चैनल से विस्तारित ध्यान केंद्रित छवियों के लिए एक अंतिम छवि आरजीबी - उपरिशायी में परिणाम के लिए विलय कर रहे हैं.

4. स्वचालित neuromast का पता लगाने

एक पैटर्न मान्यता (Labview तेज आइए प्रोटोटाइप उपकरण) उपकरण आरजीबी उपरिशायी छवियों के भीतर neuromasts को दिखाता है और ब्याज की neuromasts चारों ओर एक अनुभव से परिभाषित क्षेत्र बनाता है.

5. मात्रा का ठहराव

ब्याज घायल neuromasts आसपास के अनुभव से परिभाषित क्षेत्र के भीतर लाल फ्लोरोसेंट leukocytes (लाल पिक्सल के रूप में परिलक्षित) पी ercent एक वजह ओ के एक प्राथमिक readout के एल eukocytes (Paol) द्वारा ccupied में रन बनाए हैं. पर औसत 95.27 ± 2.11% (FDA1) और 95.12 ±कुओं (लार्वा) के 1.56% (FDA2) ठीक से पता लगाया गया है और बाद में आगे डाटा प्रोसेसिंग के अधीन किया गया है. कच्चे डेटा निर्गम (प्रत्येक का पता चला neuromast के लिए Paol) एक txt फ़ाइल में संग्रहीत किया जाता है और MATLAB स्क्रिप्ट है कि कच्चे डेटा आगे की प्रक्रिया के लिए डेटा इनपुट के रूप में कार्य करता है.

12. डाटा प्रोसेसिंग

1. IMAPS

कच्चे डेटा उत्पादन Paol के एक रंग कोड में की चित्रमय दृश्य द्वारा अलग - अलग प्रयोगों की सफलता का आकलन तथाकथित सूजन नक्शे (IMAPS) (चित्रा 2) के साथ महसूस किया जा सकता है. चमकीले हरे रंग की एक उच्च प्रारंभिक भड़काऊ सूचकांक को दर्शाता है, काला नहीं सूजन इंगित करता है. इस त्वरित अवलोकन प्रयोगों में विफल रहा, जो फिर आगे डेटा के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है की तेजी से पहचान के लिए अनुमति देता है.

2. नियंत्रणों के का औसत

प्रत्येक प्रयोगात्मक प्लेट 320 को दर्शाती यौगिकों शामिल हैंयौगिक और के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय - बिंदु 32 सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के प्रति क्रमशः एकल डेटा बिंदु,. 32 नियंत्रण प्रतिकृति का औसत और मानक विचलन की गणना है. नियंत्रण के लिए केवल 2 मानक विचलन के भीतर डेटा बिंदु शामिल हैं.

3. मानकीकरण

सामान्यीकरण स्प्रेडशीट विश्लेषण के द्वारा किया जाता है. DMSO के औसत मूल्य, नकारात्मक नियंत्रण किया जा रहा है, 0 पर सेट है और. उच्चतम तांबा नियंत्रण लिए औसत Paol के 1 के लिए सेट कर दिया जाता है, ताकि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के बीच अधिकतम अंतर 1 करने के लिए सेट कर दिया जाता है. प्रत्येक यौगिक Paol रैखिक या अंतर्वेषित प्रयोगात्मक प्लेट पर नियंत्रण करने के लिए extrapolated किया.

4. भड़काऊ सूचकांक: अंतिम पढ़ने के लिए बाहर

के बाद पर्याप्त दोहराने प्रयोगों (15) अर्थात् आयोजित किया गया है, दोहराने प्रयोगों से सामान्यीकृत कच्चे डेटा औसत रहे हैं, पढ़ने के बाहर अंतिम भड़काऊसूचकांक. तांबा नियंत्रण की प्रारंभिक भड़काऊ सूचकांक समय बिंदु शून्य के लिए 100% पर शुरू होता है और छवि अधिग्रहण शुरू करने का समय (90 मिनट के प्रारंभिक तांबा उपचार के बाद) को संबद्ध करता है.

5. Monotonic घातीय प्रतिगमन फिटिंग

समय के साथ सूजन संकल्प के कारण हम का उपयोग करके प्रारंभिक सूजन की दिशा में एक monotonic घातीय nonlinear प्रतिगमन फिटिंग प्रदर्शन - एक ₀ टी = 0 पर प्रारंभिक प्रतिक्रिया के लिए एक उपाय है, _एक एक समय से अधिक परिमाण की ढलान से संबंधित है.

6. 2 - डी सुविधा अंतरिक्ष साजिश (चित्रा 4)

सुविधा स्थान उत्पन्न करने के लिए, एक गैर रेखीय प्रतिगमन लागू है और एक क्लस्टर विश्लेषण लक्षण क्षेत्रों में सुविधा अंतरिक्ष विभाजित, इस प्रकार विभिन्न प्रतिरक्षा modulatory श्रेणियों को दिलचस्प से उम्मीदवारों की स्वचालित पहचान (विरोधी - inflammat की अनुमतिory, विरोधी संकल्प, समर्थक भड़काऊ, समर्थक संकल्प). सभी यौगिकों 2 - डी साजिश में एक ₀ और ₁ के मानकों के आधार पर प्रदर्शित कर रहे हैं.

13. डाटा हैंडलिंग और भंडारण

हमारे डेटा से निपटने दिनचर्या जालपृष्ठ बनाने के लिए कल्पना और ऐसी दवा उपलब्ध कराने के स्क्रीन छवि की एक त्वरित अवलोकन और डेटा प्रसंस्करण कदम के परिणाम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक विस्तृत दृश्य जब ¹⁰ उपयोगकर्ता द्वारा अनुरोध का प्रतिनिधित्व. अन्य प्रासंगिक विषम जैविक और रासायनिक डेटाबेस के लिए नरम लिंक के रूप में अच्छी तरह से एकीकृत कर रहे हैं के लिए तुलनात्मक और उपन्यास ¹¹ के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करते हैं. इन routines के द्वारा, उचित डेटा मानकों और metainformation के इस डेटा की लंबी अवधि के भंडारण के लिए सेट कर रहे हैं.

14. प्रतिनिधि परिणाम

हम एक पायलट स्क्रीन में 640 की मिलकर पुस्तकालय का विश्लेषण एफडीए को मंजूरी दे दी, दीक्षा, या एक granul की प्रगति संकल्प पर प्रभाव के लिए जाना जाता है bioactive यौगिकोंocytic भड़काऊ प्रतिक्रिया. हम प्रतिरक्षा modulatory phenotypes है कि कार्रवाई के विभिन्न तरीकों का संकेत हो सकता है के 4 प्रकार वर्गीकृत मनाया प्रभाव के आधार पर: विरोधी भड़काऊ (1), विरोधी संकल्प (2) (3) समर्थक भड़काऊ और समर्थक संकल्प (4) एक ₀ पैरामीटर और एक _{1 है,} कि एक monotonic गैर रेखीय प्रतिगमन फिटिंग (ई ^{ए ओ + alx} -) से उठता है के साथ वर्णित किया जा सकता है जो प्रारंभिक सूजन की ओर. एक ₀ भड़काऊ प्रतिक्रिया की भयावहता का प्रतिनिधित्व करता है जबकि एक ₁ वक्र के ढलान की विशेषता है और इस प्रकार सूजन संकल्प का वर्णन है. एक फीचर 2 - डी अंतरिक्ष भूखंड (एक ₀ बनाम ₁₎ में सभी यौगिकों प्रदर्शित विभिन्न प्रतिरक्षा modulatory श्रेणियों के से मारा उम्मीदवारों (चित्रा 3) की स्वचालित पहचान के लिए अनुमति देता है.

45 640 यौगिकों के बाहर 50% या उससे कम के लिए प्रारंभिक भड़काऊ सूचकांक को कम करने से महत्वपूर्ण विरोधी भड़काऊ प्रभाव exerted. थी भीतरश्रेणी हम 6 यौगिकों गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं (NSAIDs), हमारे दृष्टिकोण की वैधता की पुष्टि के औषधीय वर्ग से संबंधित पाया गया. हालांकि, NSAIDs सबसे प्रबल विरोधी भड़काऊ दवाओं के बीच नहीं स्थान पर रहीं. NSAIDs से अलावा हम कई अतिरिक्त ऐसे उदाहरण एंजियोटेनसिन रिसेप्टर (arbs) ब्लॉकर्स, एंटीबायोटिक दवाओं और प्रोटॉन पंप inhibitors के लिए के रूप में औषधीय दवा वर्गों पाया.

7 यौगिकों संभावित संकल्प समर्थक दवाओं के लिए अनुभव से परिभाषित सीमा मापदंड से मुलाकात की.

18 दवाओं के एक समर्थक भड़काऊ प्रभाव exerted है, अतिरंजित ल्युकोसैट भर्ती में घायल neuromasts सकारात्मक नियंत्रण के लिए की तुलना में जिसके परिणामस्वरूप.

केवल 2 यौगिकों भड़काऊ प्रतिक्रिया की समय पर संकल्प को रोका.

पायलट स्क्रीन coul से कई हिट उम्मीदवारों के विरोधी भड़काऊ प्रभाव (उपर्युक्त औषधीय दवा वर्गों से अनुकरणीय उम्मीदवारों)बाद माध्यमिक चिन assays (नहीं दिखाया डेटा) में एक खुराक पर निर्भर ढंग से पुष्टि की जानी है. 4 संभावित समर्थक संकल्प दवाओं की कार्रवाई के संकेत मोड Retesting पुष्टि नहीं के रूप में प्राथमिक स्क्रीन के में exerted किया. 2 दवाओं की उच्च सांद्रता (20 माइक्रोन) में एक मामूली विरोधी भड़काऊ संभावित था. 20 माइक्रोन - एक तिहाई दवा मामूली गैर खुराक पर निर्भर दवा 5 से लेकर सांद्रता में विरोधी भड़काऊ प्रभाव का प्रदर्शन किया. चौथे दवा परीक्षण सांद्रता पर भड़काऊ प्रतिक्रिया पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा.

आकृति 1. चिन परख के कार्यप्रवाह व्यक्तिगत परिसर ट्रांसजेनिक में :: cldnB / GFP lysC. :: DsRED2 लार्वा (3 DPF) मैन्युअल रूप से 384 अच्छी तरह प्लेटें microtiter में वितरित कर रहे हैं. दवाओं को एक साथ अच्छी तरह से एक हलकी हवा कॉम्पैक्ट तरल हैंडलिंग कार्य केंद्र का उपयोग कर प्रत्येक के लिए जोड़ रहे हैं. परख प्लेटें तो 29 को 1 घंटे के लिए incubated डिग्री सेल्सियस ₄ CuSO साथ उपचार

चित्रा 2. Cy3 (बाएं) और GFP (दाएं), क्रमशः चैनल में 50 माइक्रोन की दूरी पर कच्चे छवियों की चित्र अवलोकन आंकड़ा 4 फोकल विमानों (3 जेड = 0) के कच्चे छवियों से पता चलता है. तीर (जेड = 1,2) अनुकरणीय neuromasts, तीर neuromasts आसपास clustered leukocytes के लिए बिंदु (= जेड 1,2) से संकेत मिलता है.

चित्रा 3. सूजन (IMAPS) मानचित्र व्यक्ति प्रयोगों की सफलता एक रंग कोड में भड़काऊ प्रतिक्रिया (कच्चे डेटा) को दर्शाती IMAPS में मूल्यांकन किया जा सकता है: उज्ज्वल हरे रंग एक उच्च प्रारंभिक infla है को दर्शाता है mmatory प्रतिक्रिया, काला कोई सूजन इंगित करता है IMAPS timepoint (बाएं) 0 और 5 बार बिंदु (दाएं) में स्पष्ट रूप से दिखाने के लिए कि क्या एक प्रयोग और डाटा प्रोसेसिंग में शामिल किया जाना चाहिए. कॉपर नियंत्रण (13 पंक्ति और 24) हरे रंग के अलग रंगों में दिखाने के लिए, जबकि DMSO के नियंत्रण कुओं (1 पंक्ति और 12) हरे रंग अंधेरे या काले रंग में दिखाई देते हैं. 5 समय बिंदु पर, सूजन लगभग तांबे नियंत्रण में हल हो गई है, अब हरे या काले काले रंग में संकेत दिया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 4. 2 - डी सुविधा अंतरिक्ष भूखंड एक एफडीए के 320 यौगिकों के पुस्तकालय और उनके संबंधित नियंत्रण अनुमोदित सभी यौगिक कुओं ₀ और ₁ पैरामीटर, जो एक गैर रेखीय से उत्पन्न पर आधारित एक फीचर 2 डी अंतरिक्ष भूखंड में प्रदर्शित किया जा सकता है. प्रतिगमन फिटिंग ("alt =" d/4203/4203eq1.jpg 1 समीकरण "/> प्रारंभिक सूजन की ओर). इस सुविधा अंतरिक्ष साजिश दिलचस्प निम्नलिखित 4 प्रतिरक्षा modulatory श्रेणियों को कि दवाओं के संकेत हो सकता है के लिए अभ्यर्थियों की स्वचालित पहचान की अनुमति देता है कार्रवाई की मोड: विरोधी भड़काऊ (1), विरोधी संकल्प (2), समर्थक भड़काऊ (3) और (4) समर्थक संकल्प बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें .

Disclosures: एक स्वचालित उच्च सामग्री zebrafish में सूजन परख को सुगम ड्रग डिस्कवरी

Acknowledgements: एक स्वचालित उच्च सामग्री zebrafish में सूजन परख को सुगम ड्रग डिस्कवरी